摘要：植物膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是蛋白質(zhì)組學(xué)研究者關(guān)注的焦點(diǎn)之一，但由于膜蛋白具有低豐度、疏水性等特點(diǎn)，因此膜蛋白的富集提取、分離鑒定存在很大的難度。從膜蛋白的富集提取、分離鑒定入手，闡述其研究進(jìn)程，對(duì)質(zhì)膜蛋白、葉綠體膜蛋白、線粒體膜蛋白和液泡膜蛋白等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對(duì)膜蛋白的研究前景進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：植物；膜蛋白；膜蛋白質(zhì)組學(xué)：研究技術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q51 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439—8114(2009)01—0223—04

生物膜具有的主要功能可歸納為：能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)送、信息識(shí)別與傳遞等，這些功能在很大程度上決定于膜內(nèi)所含的蛋白質(zhì)——膜蛋白。膜蛋白是一類(lèi)具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，鑲嵌于膜脂的特性使這一類(lèi)蛋白處于細(xì)胞與外界的交界部位，介導(dǎo)細(xì)胞與外界之間的信號(hào)傳導(dǎo)，并執(zhí)行很多基本的和重要的細(xì)胞生物學(xué)功能。

1 膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展

膜蛋白的研究面臨的挑戰(zhàn)是膜蛋白(主要是低豐度蛋白、疏水蛋白)的提取鑒定、膜蛋白的定位和功能等方面?，F(xiàn)在一些新技術(shù)的利用如增溶劑(尿素、硫脲)。新的去垢劑(CHAPS和ASB-14)，以及有機(jī)溶劑(CHCl₃)等極大地改善了膜蛋白質(zhì)的溶解性能；同時(shí)一些新的雙向電泳技術(shù)(如：自由流電泳)的利用擴(kuò)大了膜蛋白的常規(guī)分離范圍：另外質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展使得膜蛋白的鑒定在最近幾年取得了較大的發(fā)展，這些技術(shù)都在一定程度上使膜蛋白具有低豐度、難溶解、等電點(diǎn)時(shí)易沉淀、不易酶解等難題得到一定程度的解決。

1.1 膜成分的制備純化

獲得高度純化的膜成分是進(jìn)行膜蛋白研究的基礎(chǔ)。制備純化膜成分的方法很多，在植物材料中以蔗糖密度梯度離心法、兩相分配法和自由流電泳(FFE，free flow electrophoresis)等方法為主。

有的學(xué)者利用親和兩相法提純了質(zhì)膜，WGA(麥胚凝集素，wheat-germ agglutinin)能識(shí)別質(zhì)膜表面的糖鏈，結(jié)合糖蛋白質(zhì)和糖脂，并能與質(zhì)膜外表面的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖相結(jié)合，將WGA共軛結(jié)合到葡聚糖上，可將質(zhì)膜從其他生物膜中純化出來(lái)。生物素-親和素親和純化法可以明顯地降低其他細(xì)胞器的污染，尤其是線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。經(jīng)試驗(yàn)，這種方法可將質(zhì)膜富集400倍并且污染較少，尤其是經(jīng)高鹽(1 mol·L^-1KCL)和(0.1 mol·L^-1Na₂COM₃)洗滌后，可以得到很純的整合質(zhì)膜片段。

1.2 膜蛋白的分離純化

利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較不同組織器官的膜蛋白組成的差異，分離膜蛋白的技術(shù)體系日趨成熟，優(yōu)化裂解液的成分、優(yōu)化雙向電泳的某些條件都使膜蛋白的分離純化得到很好的效果。

1.2.1 裂解液的改 進(jìn)單獨(dú)使用某一種去垢劑都不會(huì)最有效地分離膜蛋白，將兩性離子去垢劑與非離子型去垢劑結(jié)合使用能較好地溶解各種膜蛋白。傳統(tǒng)上使用的陰離子去污劑有SDS(十二烷基硫酸鈉)、Triton X-100和NP-40。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)用低濃度1％(m/V)SB3-10和1％(m/V)ASB-14與5 mol·L^-1尿素、2 mol·L^-1硫脲、2 mmol-L^-1 TBP、0.2％兩性電解質(zhì)共用時(shí)可以有效的提高膜蛋白的溶解性。新型的兼性離子去污劑ASB-14對(duì)膜蛋白的溶解效果較好。在通過(guò)使用0.1 mol·L^-1Na₂CO₃、Triton X-114等處理質(zhì)膜后，使用含有ASB-14的裂解液去裂解細(xì)胞質(zhì)膜，經(jīng)2-DE分離，MALDI-TOF-MS(基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)鑒定了其中的61個(gè)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)很多疏水性膜蛋白能夠在2-DE膠上較清晰地顯示出來(lái)，其中包含有水通道蛋白和ATPase等內(nèi)在膜蛋白。

1.2.2 雙向電泳(2-DE)的改進(jìn)雙向電泳技術(shù)一直是蛋白質(zhì)組鑒定的核心技術(shù)，它的發(fā)展可以從一定程度上決定蛋白質(zhì)組的發(fā)展程度，因此近年來(lái)這一技術(shù)的改進(jìn)也越來(lái)越被大家所重視。1996年歐洲的一些科學(xué)家利用雙向凝膠電泳獲得可重復(fù)的膜蛋白完全圖譜，鑒定了一些質(zhì)膜特異性蛋白，為238種蛋白的一部分找到了對(duì)應(yīng)的功能，為膜蛋白研究方法的改善提供一個(gè)很好的開(kāi)端。

為了更好地分離質(zhì)膜中的疏水性蛋白，研究出了一套新的雙向電泳體系：在第一向等電聚焦中使用瓊脂糖作為基質(zhì)。用4.4-二氨基二苯甲烷(DDM)作為表面活性劑，第二向使用18％-24％的梯度丙烯酞胺、6 mol·L^-1的尿素和Tris-MES作為上樣緩沖液，成功地分離了集胞藻質(zhì)膜中的主要平均親水值大于0.3的疏水性蛋白，并分離鑒定了細(xì)胞色素C和亞鐵血紅素。

1.2.3 其他分離技術(shù)的改進(jìn) 用器官組織萃取劑進(jìn)行單向電泳，是目前用以鑒定幾種葉綠體疏水膜蛋白的研究方法之一。這種方法可以富集大多數(shù)葉綠體膜疏水蛋白、排除親水蛋白，從而降低蛋白混合物的復(fù)雜性。單向電泳并不能得到完整的膜蛋白質(zhì)組，也不能分離出一些低豐度蛋白。利用藍(lán)綠溫和膠電泳(BN-PAGE)法分析了豌豆葉綠體基質(zhì)和基粒類(lèi)囊體膜的色素蛋白復(fù)合物的組成。此法可以同時(shí)在一塊膠上將光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ、細(xì)胞色素b6f復(fù)合物、捕光復(fù)合物Ⅱ、ATP合成酶和RuBP羧化酶等分開(kāi)。

用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)和RP-HPLC(反相高效液相色譜)分離純化了擬南芥的膜蛋白，這些蛋白經(jīng)反相高效液相色譜法和Ed-man測(cè)序法鑒定，擬南芥的基因序列中的肽段序列屬于42個(gè)家族，其中34種蛋白的明確序列被確定，一些跨膜蛋白和膜錨定蛋白被鑒定出來(lái)。

利用雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)分離純化了質(zhì)膜蛋白，2D-DIGE是一種新出現(xiàn)的熒光標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，具有更高的動(dòng)力學(xué)范圍和靈敏性。該方法通過(guò)引入內(nèi)標(biāo)使得多個(gè)樣品在一塊膠上分離，進(jìn)而減少了試驗(yàn)條件不一致引起的誤差。2D-DIGE結(jié)合質(zhì)譜、生物信息學(xué)及高可信度的統(tǒng)計(jì)分析使得成功地定量鑒定植物蛋白質(zhì)成為可能。

1.3 膜蛋白的鑒定技術(shù)

目前分離鑒定技術(shù)的自動(dòng)化程度不高，還不能滿足大規(guī)模、高通量的要求，但隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，肽質(zhì)量指紋圖譜(PFM)、同位素親和標(biāo)簽(ICAT)技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、表面等離子共振(SPR)技術(shù)及生物信息學(xué)等也使膜蛋白的鑒定技術(shù)不斷的得到完善。利用HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)經(jīng)雙向電泳分離的小麥造粉體膜蛋白進(jìn)行鑒定，并經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，發(fā)現(xiàn)63種造粉體蛋白?？梢詰?yīng)用一維電泳結(jié)合質(zhì)譜分析來(lái)鑒定膜蛋白和基于液相的鳥(niǎo)槍法(shotgun)策略來(lái)鑒定膜蛋白。

2 植物膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究概況

現(xiàn)在針對(duì)膜蛋白的研究越來(lái)越受到重視，許多植物如擬南芥、煙草等已經(jīng)成為質(zhì)膜蛋白質(zhì)組研究的熱點(diǎn)，而對(duì)線粒體膜蛋白的研究主要集中在水稻、花生等植物上。分析擬南芥、水稻、煙草亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的質(zhì)膜、葉綠體膜、線粒體膜、液泡膜等的蛋白質(zhì)組，為植物抗病相關(guān)蛋白的研究提供了有利線索。

2.1 質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)

為了更好地研究和證明植物細(xì)胞質(zhì)膜上各種生理反應(yīng)的規(guī)律性以及質(zhì)膜的生物學(xué)特性，許多科研院所都在對(duì)質(zhì)膜蛋白展開(kāi)豐富細(xì)致的研究，使質(zhì)膜的研究取得了一定的進(jìn)展。首先應(yīng)該通過(guò)細(xì)胞勻漿和超聲波破碎等得到各種膜的混合物，再經(jīng)雙相分配法、蔗糖密度梯度離心等分離純化質(zhì)膜。

與差速離心法相比，不連續(xù)蔗糖梯度使高粱根質(zhì)膜的純度提高了近2倍。兩相法分離質(zhì)膜所依據(jù)的原理是膜表面性質(zhì)的不同，它可以制備無(wú)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體膜和線粒體膜污染的富含質(zhì)膜的成分。用免疫學(xué)和酶學(xué)試驗(yàn)對(duì)擬南芥的一個(gè)高度純化的細(xì)胞質(zhì)膜組分進(jìn)行詳細(xì)分析。用疏水蛋白提取與單向膠帶質(zhì)譜分析的互補(bǔ)方法鑒定102個(gè)蛋白質(zhì)，其中95％蛋白質(zhì)是新鑒定的質(zhì)膜蛋白，且大部分鑒定蛋白為質(zhì)膜鑲嵌蛋白。以水稻根尖為材料通過(guò)SDS-PAGE單向電泳分離和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析，鑒定了8個(gè)質(zhì)膜蛋白。經(jīng)洗滌后的質(zhì)膜組分復(fù)雜度顯著降低。SDS-PAGE中的蛋白條帶只包含1-2種蛋白，且主要為疏水性較強(qiáng)的穿膜蛋白，說(shuō)明多種生物化學(xué)分離方法及不同質(zhì)譜分析的綜合運(yùn)用，是解決生物膜蛋白質(zhì)組學(xué)難點(diǎn)的有效途徑。

2.2 葉綠體膜蛋白質(zhì)組學(xué)

據(jù)估計(jì)高等植物共有約21 000-25 000個(gè)蛋白質(zhì)，葉綠體的蛋白質(zhì)占其中10％-25％，充分證明了葉綠體在植物細(xì)胞中的重要性，因此葉綠體膜蛋白也逐漸成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。有些學(xué)者鑒定了擬南芥葉綠體膜中100種蛋白質(zhì)，其中約80種蛋白質(zhì)都為葉綠體蛋白或者是極可能為葉綠體蛋白，這些蛋白質(zhì)參與到離子運(yùn)輸或者代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及葉綠體中脂類(lèi)代謝中。采用順序提取法富集提取葉綠體類(lèi)囊體膜蛋白鑒定了27個(gè)被預(yù)測(cè)為葉綠體運(yùn)送肽的未知功能的新蛋白：在100個(gè)已知蛋白中，83個(gè)位于類(lèi)囊體光合裝置的蛋白參與蛋白插入、蛋白組裝、蛋白折疊或蛋白降解：16個(gè)位于類(lèi)囊體光合裝置的蛋白參與蛋白翻譯過(guò)程，證明了類(lèi)囊體膜表面是蛋白質(zhì)合成的重要場(chǎng)所。

2.3 線粒體膜蛋白質(zhì)組學(xué)

2001年有學(xué)者第1次用2-DE來(lái)研究線粒體蛋白質(zhì)組。聯(lián)合應(yīng)用藍(lán)色非變性PAGE電泳、IEF(等電聚焦電泳)和SDS-PAGE 3種不同的凝膠電泳方法分別分離鑒定了線粒體蛋白質(zhì)復(fù)合體和蛋白質(zhì)復(fù)合體亞基。通過(guò)對(duì)水稻種子線粒體的膜蛋白進(jìn)行2-DE和BN-PAGE、MS/MS分析鑒定，鑒定了其中的64％的蛋白質(zhì)點(diǎn)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)發(fā)現(xiàn)其中有細(xì)胞色素氧化酶亞單位1、皮質(zhì)鐵氧還蛋白和ATP合成酶，并指出這些蛋白與水稻的49個(gè)基因有關(guān)。

2.4 液泡膜蛋白質(zhì)組學(xué)

液泡與細(xì)胞質(zhì)有一層液泡膜，液泡膜具有特殊的選擇透性，使液泡具有高滲性質(zhì)，能調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓和膨壓，并能使多種物質(zhì)在液泡內(nèi)貯存和積累。用多相液相色譜或單向SDS-PAGE結(jié)合技術(shù)成功鑒定了擬南芥營(yíng)養(yǎng)體的液泡蛋白質(zhì)。將分離純化得到的不同富含液泡膜組分，經(jīng)過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜分析共鑒定了402個(gè)蛋白質(zhì)，其中在12個(gè)已知液泡的ATP酶亞基中有11個(gè)被鑒定，還發(fā)現(xiàn)4個(gè)液泡膜定位的N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNAREs)，有證據(jù)顯示每個(gè)有代表性的SNAREs蛋白可能是液泡膜融合所必需的。采用密度梯度離心法提取擬南芥膜蛋白并用二維液相色譜分離純化液泡膜蛋白組分，經(jīng)MALDI-TOF-MS技術(shù)分析，共鑒定了70個(gè)液泡膜蛋白質(zhì)。經(jīng)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，幾乎50％鑒定蛋白是功能未知的，60％鑒定蛋白質(zhì)至少有兩個(gè)跨膜區(qū)。

3 展望

對(duì)于膜蛋白的研究還涉及到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白等許多方面，盡管膜蛋白質(zhì)組研究還處于一個(gè)初期階段，相關(guān)技術(shù)手段及其配套應(yīng)用還很不成熟，但隨著膜蛋白的研究越來(lái)越受到重視，蛋白質(zhì)研究數(shù)據(jù)的不斷積累，尤其是針對(duì)膜蛋白的提取純化和分離鑒定的新技術(shù)的不斷突破和生物信息學(xué)工具的日益完善，膜蛋白在基礎(chǔ)研究和農(nóng)業(yè)應(yīng)用中揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病機(jī)制及代謝調(diào)控規(guī)律上都將會(huì)有所突破。我們希望更加優(yōu)化的膜蛋白的提取方法、分離鑒定方法被進(jìn)一步的提出，相關(guān)膜蛋白的數(shù)據(jù)庫(kù)也越來(lái)越多，為人類(lèi)研究膜蛋白提供可靠的保證。