，

(1.廣東藥學(xué)院 中山校區(qū)實(shí)驗(yàn)中心，廣東 中山 528458；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510405)

胃癌是一種常見的對(duì)人類危害較大的疾病，我國(guó)在20世紀(jì)90年代進(jìn)行的全國(guó)惡性腫瘤死亡率調(diào)查表明，胃癌死亡率高居惡性腫瘤死亡率的首位[1]，目前使用手術(shù)、化療、放療等治療方法存在許多局限，而且不能有效防治胃癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是從活血化瘀中藥川芎中分離得到的一種生物堿，主要應(yīng)用于缺血性心、腦血管疾病，毒副作用少。有研究發(fā)現(xiàn)[2]，川芎嗪對(duì)MKN45人胃癌低分化腺癌細(xì)胞有直接的殺傷作用；張薇等[3]的研究則顯示川芎嗪能抑制胃癌前病變大鼠新生血管生成，可能對(duì)胃癌具有一定的預(yù)防和治療作用。本文擬通過(guò)MTT比色法觀察川芎嗪對(duì)胃癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，初步探討川芎嗪在胃癌治療中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 材料 RMPI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)，SFM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，谷氨酰胺(美國(guó)Amresco，博理分裝)，重組人β內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhβ-ECGF,美國(guó)R&D)，F(xiàn)8兔抗人多克隆抗體、FITC-羊抗兔IgG(武漢博士德)，鹽酸川芎嗪注射液(常州制藥廠有限公司，規(guī)格：40 mg/2 mL，批號(hào)：0403231)，MTT(美國(guó)Amersco，博理分裝)。

1.2 方法

1.2.1 胃癌細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901胃腺癌細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，用RMPI 1640完全培養(yǎng)基(加入10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺)培養(yǎng)。

1.2.2 HUVEC培養(yǎng) 采用胰蛋白酶消化法分離獲取[4-5]。用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和1 ng/mL rhβ-ECGF的SFM培養(yǎng)基)培養(yǎng)，傳代后用第八因子相關(guān)抗原免疫熒光染色法進(jìn)行鑒定。HUVEC第3～6代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 川芎嗪對(duì)細(xì)胞增殖影響的檢測(cè)

1.2.3.1 對(duì)胃腺癌細(xì)胞增殖的影響 SGC-7901胃腺癌細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔接種100 μL，用RMPI 1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，吸棄孔中培養(yǎng)基。每塊培養(yǎng)板分4組，每組6個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組加入100 μL/孔R(shí)MPI 1640完全培養(yǎng)基；川芎嗪組則將含川芎嗪25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的RMPI-1640培養(yǎng)基依次加入相應(yīng)的孔中，每孔100 μL。藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養(yǎng)板，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況(檢測(cè)490 nm處光吸收值)。

1.2.3.2 對(duì)無(wú)因子培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞增殖的影響 HUVEC以2×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔接種100 μL，用SFM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和2 mM谷氨酰胺)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，吸棄孔中培養(yǎng)基。每塊培養(yǎng)板分4組，每組6個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組則加入100 μL/孔SFM完全培養(yǎng)基；川芎嗪組則將含25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的SFM完全培養(yǎng)基依次加入相應(yīng)孔中，每孔100 μL。分別在藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養(yǎng)板，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況(檢測(cè)490 nm處光吸收值)。

1.2.3.3 對(duì)胃腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC增殖的影響 胃腺癌細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶接種以1.5×106個(gè)/mL，加入SFM完全培養(yǎng)基至5 mL。培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)上清吸至同一離心管內(nèi)，1 500 r/min離心10 min。離心后的上清收集于新的離心管內(nèi)，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

HUVEC以2×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔接種100 μL，共接種3個(gè)培養(yǎng)板，用SFM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，吸棄孔中培養(yǎng)基。每塊培養(yǎng)板分7組，每組6個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組加入100 μL/孔的SFM完全培養(yǎng)基；條件對(duì)照組加入100 μL/孔的條件培養(yǎng)基(將上述收集的胃腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清與SFM完全培養(yǎng)基按1∶1的比例混勻)；川芎嗪組將含川芎嗪終濃度為25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的條件培養(yǎng)基依次加入相應(yīng)各孔中，每孔100 μL。分別在藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養(yǎng)板，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 上述實(shí)驗(yàn)各進(jìn)行2次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,相同時(shí)間點(diǎn)均數(shù)間兩兩比較使用單因素方差分析，方差齊則用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett’s-C檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)胃腺癌細(xì)胞的影響 經(jīng)不同濃度川芎嗪作用后，HUVEC的光吸收值(A值)見表1。各川芎嗪組A值與相同時(shí)間的正常對(duì)照組相比較(P>0.05)。

表1 不同濃度川芎嗪對(duì)胃腺癌細(xì)胞增殖的影響

2.2 對(duì)HUVEC增殖的影響 經(jīng)不同濃度川芎嗪作用后，HUVEC的光吸收值(A值)見表2。各川芎嗪組A值與相同時(shí)間的正常對(duì)照組相比較(P>0.05)。

表2 不同濃度川芎嗪對(duì)正常培養(yǎng)條件HUVEC增殖的影響

2.3 對(duì)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)HUVEC增殖的影響 經(jīng)不同濃度川芎嗪作用后，HUVEC的光吸收值(A值)見表3；各川芎嗪濃度組抑制率見表4。各組光吸收值均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；條件對(duì)照組和各川芎嗪組A值高于相同時(shí)間的正常對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.05)；川芎嗪濃度為125 μg/mL(川芎嗪4組)作用48、72 h、濃度為625 μg/mL(川芎嗪5組)作用24、48、72 h對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC增殖有明顯影響(P<0.05)，川芎嗪濃度為125～625 μg/mL時(shí)，增殖抑制率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高(見表4)。

表3 不同濃度川芎嗪對(duì)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC的增殖的影響

表4 不同濃度川芎嗪對(duì)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)HUVEC增殖的抑制

3 討論

川芎嗪在臨床主要應(yīng)用于缺血性心、腦血管疾病，同時(shí)能通過(guò)直接抑制腫瘤、化療增效與減毒作用、調(diào)節(jié)免疫機(jī)制等作用達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)；能通過(guò)下調(diào)腫瘤多藥耐藥基因蛋白(P-gp)而克服腫瘤細(xì)胞耐藥性;通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞黏附與侵襲、抗凝血與抗血小板集聚作用而發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用[5]。研究者還發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可有效抑制大鼠胃癌前病變組織和小鼠Lewis肺癌組織中微血管增生[3,6]，從而減少腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。 本研究顯示，川芎嗪對(duì)SGC-7901細(xì)胞和HUVEC無(wú)直接殺傷作用，但對(duì)胃癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)HUVEC的增殖具有抑制作用。反映川芎嗪可通過(guò)抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮預(yù)防和治療作用。腫瘤細(xì)胞能分泌各種促血管生成因子，這些因子與其相應(yīng)的受體相結(jié)合，是促使腫瘤新生血管增殖、遷移和形成管腔的重要原因[7-8]，故川芎嗪對(duì)胃癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC增殖的抑制作用，可能與影響胃腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基中促血管生長(zhǎng)因子與其受體結(jié)合的中間環(huán)節(jié)有關(guān)。研究表明[9-10]，川芎嗪抑制腫瘤新生血管生成的作用可能與抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的表達(dá)有關(guān)，但川芎嗪對(duì)這兩種因子影響的具體作用機(jī)制目前不甚明了，是否對(duì)其它因子或受體具有抑制作用也尚未清楚，因此要明確川芎嗪抑制腫瘤新生血管生成的具體機(jī)制和作用環(huán)節(jié)仍需進(jìn)一步研究。

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