于俊生，王瑤瑤，杜雅靜

(青島市海慈醫(yī)療集團，山東 青島 266033)

研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤的自身免疫治療劑量明顯高于其有效抗生育閾劑量[1]，說明雷公藤在發(fā)揮免疫抑制作用的同時，不可避免地影響到生殖功能。我們在既往的研究中證實，益腎飲合雷公藤多苷治療慢性腎炎有減毒增效的作用[2-3]。本實驗選用慢性系膜增生性腎小球腎炎模型大鼠，探討益腎飲拮抗雷公藤多苷對系膜增生性腎炎雌性大鼠性腺損害的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級Wistar雌性大鼠25只，6～8周齡，體重(200±20)g，由山東省魯抗動物房提供(魯20050017)。于室溫23℃,用標準大鼠飼料喂養(yǎng)。造模前預養(yǎng)1周，隨機分為正常對照組、模型組、雷公藤多苷組、益腎飲組、雷公藤多苷與益腎飲合用組(以下簡稱合用組)，每組5只。

1.2 藥品與試劑 益腎飲:當歸15 g，赤芍15 g，川芎10 g，茯苓15 g，澤瀉10 g，白術15 g，熟地黃15 g，肉蓯蓉15 g(由青島市海慈醫(yī)療集團制劑科配制)，含生藥2.2 g/mL。按大鼠100 g體重每天用量2.2 g。雷公藤多苷：10 mg/片(由浙江普洛康裕天然藥物有限公司提供)，配成2.4 mg/mL；按大鼠100 g體重每天用2.4 mg。牛血清白蛋白(BSA)購自瑞士羅氏公司；弗氏佐劑購自美國sigma公司;一抗(iNOS)兔抗鼠多克隆抗體，二抗：羊抗兔iNOS，PV9000均購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.3 系膜增生性腎小球腎炎大鼠模型建立[4]4組大鼠適應性喂養(yǎng)1周，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，常規(guī)消毒后經(jīng)背部切除左側(cè)腎臟，休養(yǎng)1周。大鼠足墊皮下注射完全弗氏佐劑0.1 mg加3 mg BSA,于1、2周末加強2次。3周末，腹腔連續(xù)4次注射BSA，間隔時間為1 h，注射劑量分別為每只0.5、1.0、1.5、3.0 mg；次日晨加強1次(2.0 mg/只)。之后每日腹腔注射BSA,劑量從每只0.5～5.0 mg開始，每日增加0.5～5.0 mg,繼續(xù)每周加量1 mg至10 mg為止。正常對照組大鼠，手術造模時開腹游離左側(cè)腎臟后關腹,藥物造模時給予相應劑量的生理鹽水注射。造模5周時，雷公藤多苷組、益腎飲組、合用組分別用相應藥物灌胃,共灌胃8周。正常對照組和模型組灌以相同劑量的生理鹽水。

1.4 觀察指標

1.4.1 卵巢組織的病理變化 于12周末宰殺大鼠后取卵巢以濾紙吸干用分析天平稱重，計算卵巢臟器指數(shù)。之后取子宮置于10%的中性甲醛固定液中固定，進行病理切片、光鏡HE染色測定。

1.4.2 免疫組化染色步驟(PV9000二步法)(略)

2 結(jié)果

2.1 各組性腺臟器指數(shù)的變化 見表1。

2.2 卵巢和子宮組織病理改變

2.2.1 卵巢 光鏡下，正常對照組和模型組卵巢組織結(jié)構(gòu)正常,可見各級生長卵泡、成熟卵泡及黃體。成熟卵泡中可見卵丘、卵泡液及卵細胞，卵泡液豐富，顆粒細胞層次多；黃體發(fā)育好。雷公藤多苷組大鼠卵巢較正常對照組和模型組略偏小，可見生長卵泡、成熟卵泡及黃體，成熟卵泡數(shù)、黃體數(shù)較少，卵泡較小，顆粒細胞層次較少，黃體偏小。益腎飲和合用組卵巢可見各級生長卵泡、成熟卵泡及黃體。顆粒細胞層次多，黃體發(fā)育好。

表1 各組性腺臟器指數(shù)變化情況

2.2.2 子宮 正常對照組和模型組大鼠子宮管徑均勻，內(nèi)膜被覆高柱狀上皮,漿內(nèi)有核下空泡；腺體豐富，腺體呈圓形、橢圓形，腺體上皮呈高柱狀。雷公藤多苷組大鼠子宮管徑細，內(nèi)膜上皮薄，腺體含量少；子宮肌層較正常對照組薄，肌纖維排列較稀疏。益腎飲組和合用組大鼠子宮管徑正常，內(nèi)膜被覆高柱狀上皮，腺體豐富。

采用動物圖像分析系統(tǒng)，掃描顯示圖像觀察卵巢卵泡數(shù)量及子宮內(nèi)膜厚度，見表2。

表2 各組雌鼠卵泡數(shù)量、子宮內(nèi)膜厚度變化情況

2.3 卵巢中iNOS表達 將二步法染色切片置于Olympus顯微鏡400×/下觀察，隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，分別讀出其中陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)和強陽性(+++)的細胞數(shù)。免疫組化評分(IHS)參照文獻[5]，結(jié)合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面評分。結(jié)果：正常對照組在卵巢卵泡顆粒細胞內(nèi)可見iNOS陽性細胞，雷公藤多苷組陽性細胞數(shù)量減少，表達減弱，與正常對照組及益腎飲組對比有統(tǒng)計學意義(P<0.01),合用組與正常對照組相比無差異(P>0.05)。

3 討論

中藥拮抗雷公藤多苷抗生育活性的研究已取得新進展[6-8]。我們認為雷公藤多苷毒副作用的中醫(yī)病機關乎“精血受損，肝脾腎三臟功能失調(diào)”[9]；并據(jù)此提出調(diào)補肝腎、健脾利濕、養(yǎng)血活血治則，以經(jīng)方當歸芍藥散加熟地黃、肉蓯蓉組成益腎飲。當歸芍藥散出自《金匱要略·婦人妊娠病脈證篇》，仲景本方原為婦人懷孕腹中疼痛而設，有養(yǎng)血疏肝、健脾滲濕、安胎止痛之功效，乃疏肝健脾之名方。方中當歸補血活血，芍藥養(yǎng)血柔肝，川芎行氣疏肝、活血化瘀；茯苓健脾滲濕，澤瀉利水滲濕，白術補氣健脾燥濕。加入熟地黃、肉蓯蓉以補腎填精，二者相配體現(xiàn)了陰中求陽、陽中求陰的原則。熟地黃配當歸、芍藥增強了填精養(yǎng)血之功；熟地黃配川芎，使熟地補而不滯、滋而不膩，使川芎行而不破；熟地黃配茯苓、澤瀉、白術使祛濕而不傷陰；肉蓯蓉補腎助陽，溫熱之性助當歸、川芎活血行氣，同時溫煦脾陽助茯苓、澤瀉、白術健脾祛濕，共奏調(diào)肝補腎、健脾除濕、養(yǎng)血活血之功效。體現(xiàn)了標本兼治、濕瘀同治、肝脾腎三臟同治的原則。

在前期的研究中已經(jīng)證實，益腎飲與雷公藤多苷合用可減輕大鼠系膜增生性腎小球腎炎因應用雷公藤多苷所致的肝腎損害[2]，提高血清蛋白水平，且影響腎臟中TNF-α、IL-6的表達[3]。本實驗觀察到應用雷公藤多苷治療系膜增生性腎炎同時應用益腎飲，卵巢iNOS活性比雷公藤多苷組顯著提高,與正常對照組相近，說明益腎飲通過影響iNOS活性來改善雷公藤多苷對生殖系統(tǒng)的損害。

[1]路秀英,徐 錚,修賀明,等.抗生育劑量雷公藤對小鼠免疫功能的影響[J].生殖與避孕,1998,18(2):116-18.

[2]吳桂艷,于俊生,衛(wèi)艷玲.益腎飲拮抗雷公藤多苷治療大鼠系膜增生性腎炎中致肝損傷的實驗研究[J].中華實用中西醫(yī)雜志,2006,19(11):1243-1246.

[3]于俊生,吳桂艷,衛(wèi)艷玲.益腎飲合雷公藤多苷對系膜增生性腎炎大鼠TNF-α和IL-6蛋白表達的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2008,9(3):225-227.

[4]賈 慧,鄒萬忠.改良慢性血清病性大鼠系膜增生性腎炎模型的建立[J].腎臟病與透析腎移植雜志,1996,1(3):21

[5]Soslow RA,Dannenberg AJ,Rush D,Woerner BM,Khan KN,Masferrer J,Koki AT[J].Cox-2 is expressed in human.pulmonary,colonic,and mammary tumors.Cancer 2000(89):2637-2645.

[6]林金芳,于傳鑫.高促性腺激素繼發(fā)閉經(jīng)的臨床研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,1996:278-282.

[7]胡 兵,董曉蕾,陳林囡,等.當歸芍藥散拮抗雷公藤對雌鼠生殖系統(tǒng)影響的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2000,11(9):775-776.

[8]王瑤瑤,于俊生.中藥拮抗雷公藤多苷抗生育活性的研究[J].吉林中醫(yī)藥,2008,28(2):143-144.

[9]衛(wèi)艷玲,于俊生.雷公藤多苷治療腎臟疾病所致毒副作用中醫(yī)病機的探討[J].中華醫(yī)學百科雜志,2006,8(2):36.