摘要：植物基因工程是大豆遺傳改良的重要途徑，近幾年來轉(zhuǎn)基因植物與日俱增，轉(zhuǎn)化方法也得到了快速發(fā)展，綜述近年來國內(nèi)外大豆遺傳轉(zhuǎn)化再生體系(不定芽器官再生體系、體細(xì)胞胚胎再生體系、原生質(zhì)體再生體系)及其優(yōu)缺點(diǎn)，同時分析影響轉(zhuǎn)化效率的幾種因素。

關(guān)鍵詞：大豆；遺傳轉(zhuǎn)化；再生體系

中圖分類號：S330 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

大豆作為重要的糧食和油料作物，其再生體系的建立和遺傳轉(zhuǎn)化研究受到了廣泛重視，轉(zhuǎn)基因大豆是最早引入商業(yè)化種植的農(nóng)作物之一，播種面積最大，占轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的60％，產(chǎn)量占世界大豆總產(chǎn)量的50％以上，而且這一趨勢還將進(jìn)一步擴(kuò)大，但大豆的遺傳轉(zhuǎn)化受許多因素影響，轉(zhuǎn)化率不高，本文將對近年來國內(nèi)外大豆遺傳轉(zhuǎn)化的再生體系、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素以及存在的問題進(jìn)行綜述。

1 大豆遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的研究進(jìn)展

隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展及植物基因工程發(fā)展的需要，大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系不斷得到改良，自Cheng等首次用大豆無菌苗子葉節(jié)獲得再生植株后，已有許多研究報道，目前應(yīng)用于大豆轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)主要有以下3種：不定芽器官發(fā)生途徑的再生體系、原生質(zhì)體再生體系、體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生體系。

1.1 不定芽器官再生體系

大豆器官發(fā)生體系所用的外植體分別是無菌苗子葉節(jié)、未成熟種子的子葉和莖尖、無菌苗上胚軸等，大豆子葉節(jié)不定芽器官發(fā)生體系目前已經(jīng)被公認(rèn)為較成熟、易行的大豆再生體系，不定芽器官發(fā)生系統(tǒng)中，外植體內(nèi)已存在的分生組織和有分化潛力的表皮、亞表皮細(xì)胞都可作為遺傳轉(zhuǎn)化的靶組織，以子葉節(jié)再生體系為代表的大豆不定芽再生體系的優(yōu)點(diǎn)是：①再生時間短，通常1～3月就可獲得生根的再生植株；②外植體容易獲得，不受季節(jié)限制；③再生過程簡單，只需叢生芽分化培養(yǎng)、芽伸長及生根培養(yǎng)3個步驟；④再生頻率高，同時，子葉節(jié)不定芽再生系統(tǒng)也存在外植體較大、再生芽之間的保護(hù)作用以及外植體本身的抗性對于轉(zhuǎn)化后的篩選工作不利等缺點(diǎn)，另外，由于不定芽多數(shù)為多細(xì)胞起源，轉(zhuǎn)化后一般為嵌合體，純化、篩選難度較大。

1.2 原生質(zhì)體再生體系

1988年，衛(wèi)志明等報道了大豆原生質(zhì)體再生系統(tǒng)，獲得愈傷組織，誘導(dǎo)成苗，獲得再生植株，在之后的研究中對不同的大豆品種進(jìn)行了實(shí)驗，也獲得了大豆原生質(zhì)體再生植株，大豆原生質(zhì)體再生體系從理論上講是克服大豆遺傳轉(zhuǎn)化嵌合體現(xiàn)象的最有希望的系統(tǒng)；但由于此系統(tǒng)操作復(fù)雜，不易掌握，工作量大，不同基因型差異很大，再生效率低，以及相關(guān)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(電擊法、PEG法(聚乙二醇法))的轉(zhuǎn)化效果不理想，所以該體系在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用并不廣泛。

1.3 體細(xì)胞胚胎再生體系

體細(xì)胞胚胎再生體系是目前大豆再生系統(tǒng)研究的另一個重要部分，被認(rèn)為是解決大豆遺傳轉(zhuǎn)化中嵌合體問題的最有潛力的再生體系，Christianson等首先觀察到大豆細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，Parrott等首先采用這一體系進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，但是轉(zhuǎn)化率很低，而且轉(zhuǎn)化植株均為嵌合體，F(xiàn)iner等采用胚性細(xì)胞團(tuán)作為外植體，由于其位于表面，且能在很多位置形成體細(xì)胞胚，因此轉(zhuǎn)化和篩選都很容易，鄧向陽等以3個大豆主栽品種3～6 mm幼胚的子葉為外植體，研究體外體細(xì)胞胚發(fā)生的各影響因素，發(fā)現(xiàn)不僅激素種類、濃度、各激素組合會影響體胚發(fā)生，而且幼胚長度、接種量等因素對體胚發(fā)生方式也有重要影響，Liu等報道用再生能力較強(qiáng)的胚尖作為外植體建立了高效的再生體系，張淑珍等目前已經(jīng)有將Bt基因、牛酪蛋白基因轉(zhuǎn)入Jack等少數(shù)大豆品種中的報道，王曉春等用球形期的體細(xì)胞胚受傷處理作為轉(zhuǎn)基因的受體用于轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明體細(xì)胞胚團(tuán)的轉(zhuǎn)化率可高達(dá)8.0％，而發(fā)育晚期的子葉胚很難誘導(dǎo)出抗性體細(xì)胞胚，轉(zhuǎn)化率為0％，雖然大豆體細(xì)胞胚再生體系取得了一定進(jìn)展，但存在后代不育、傳代時間長(一般大于6個月)、再生植株常出現(xiàn)變異等問題，是影響其用于遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素，需要進(jìn)一步研究解決，

通過胚狀體產(chǎn)生再生植株有3個顯著優(yōu)點(diǎn)：①在一個培養(yǎng)物上所能產(chǎn)生的胚狀體數(shù)目一般比不定芽數(shù)目多；②胚狀體形成速度快；③胚狀體結(jié)構(gòu)完整，缺點(diǎn)是從幼胚誘導(dǎo)得到可用于轉(zhuǎn)化的受體所需時間較長，轉(zhuǎn)化、篩選和植株再生所需時間也較長，另外如外植體為幼胚子葉，取材受季節(jié)和溫室條件的限制。

大豆不定芽器官發(fā)生受體系統(tǒng)，相對于體胚和原生質(zhì)體受體系統(tǒng)，具有對農(nóng)桿菌“敏感性”較高、再生時間短、轉(zhuǎn)化再生植株育性好、外植體來源范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為成熟的適合于農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的再生體系的受體系統(tǒng)。

2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)基因影響因素研究現(xiàn)狀

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)基因已經(jīng)取得很大成就，表現(xiàn)最為突出的是抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆的商業(yè)化生產(chǎn)，不少研究顯示，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆的頻率低，李明春等報道的轉(zhuǎn)化率為1.27％，崔欣的轉(zhuǎn)化率為0.49％～0.91％，Chen認(rèn)為大豆的轉(zhuǎn)化率一般為0.5％～1.8％，呂慧穎研究表明，轉(zhuǎn)化率為2.39％，其轉(zhuǎn)化率低是由于有很多因素影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化。

2.1 大豆的易感性

農(nóng)桿菌感染能力與大豆基因型有密切關(guān)系，雖然雙子葉植物是農(nóng)桿菌的天然宿主，但是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化仍然存在一定程度的基因型特異性，Owens等通過對栽培大豆品種和野生大豆株系進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究，篩選出3個栽培品種(Biloxi，Jupiter和Peking)和1個野生材料(P1393，693B)，對農(nóng)桿菌A348(pTiA6)高度易感，進(jìn)一步研究表明，易感性是受少數(shù)幾個基因控制的數(shù)量性狀，王連錚用15個農(nóng)桿菌菌系從2759個大豆基因型中進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)不同大豆基因型的易感性差異很大，其中858個為易結(jié)瘤基因型，其余基因型則不被感染，王罡等對5個栽培大豆品種進(jìn)行比較，不同基因型間對農(nóng)桿菌侵染的敏感性存在顯著差異，吉林43易被侵染轉(zhuǎn)化，而綏農(nóng)8、黑農(nóng)35和東農(nóng)42沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)化體，Hinchee等從100多個大豆品種中選出對農(nóng)桿菌反應(yīng)最佳的Peking品種，說明基因型不同的株系對農(nóng)桿菌的反應(yīng)能力是不同的。

2.2 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化能力

農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化能力與農(nóng)桿菌菌株有關(guān)，即不同農(nóng)桿菌菌株對大豆的轉(zhuǎn)化能力有差異，李洪泉等用Chry5分析我國10個大豆品種子葉的致瘤作用，其中7個品種致瘤作用比超毒菌株A28j還強(qiáng)，對所有品種致瘤率均高于T37，與Benny等首先發(fā)現(xiàn)的Chry5具有強(qiáng)致瘤性一致，Byrne以大豆品種Pe—king為材料對11個根癌農(nóng)桿菌菌株的轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行研究，以致瘤頻率和瘤的大小為指標(biāo)，他們發(fā)現(xiàn)不同菌株轉(zhuǎn)化能力的差異主要是Ti質(zhì)粒的差異所致，胭脂堿型Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)于章魚堿型Ti質(zhì)粒，章魚堿型質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)較胭脂堿型質(zhì)粒復(fù)雜，究竟哪一部分的差異導(dǎo)致了它們轉(zhuǎn)化能力的差異，目前還未見報道，王連錚等通過15個農(nóng)桿菌菌株對2759個大豆品種的致瘤作用進(jìn)行研究，篩選出7個致瘤能力較強(qiáng)的菌系，致瘤效果較好的菌株為B₃/73，C₃₈和A₂₀₈，劉海坤等采用EHA105也獲得了較高的轉(zhuǎn)化頻率，可達(dá)6.4％～12.1％。

2.3 酚類化合物對轉(zhuǎn)化的作用

酚類化合物如乙酰丁香酮等對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力有明顯影響，許躍和李寶鍵的研究表明，用多酚化合物或某些植物提取物處理農(nóng)桿菌，可提高農(nóng)桿菌在培養(yǎng)植物細(xì)胞上的附著，農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞，誘導(dǎo)vir基因的活化，農(nóng)桿菌vir區(qū)的活化是通過virA/virG雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)的，酚類物質(zhì)可以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌vir基因的活化，首先是virA受到酚類誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)后激活virG，然后進(jìn)一步激活vir區(qū)基因的表達(dá)，vir基因的表達(dá)控制著T-DNA的轉(zhuǎn)移，在大豆轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮可以克服農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化的種和組織的特異性，是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化成功的重要因素。

2.4 抗氧化劑對組織褐化的抑制

農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)化時，常常會引起外植體的褐化，這種外植體的褐化是植物對受傷和病原體侵害的一種防御性反應(yīng)，但這種因農(nóng)桿菌的侵染和制造傷口引起的褐化和細(xì)胞死亡可能會阻礙T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞，Olhoft等報道了在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入L-Cys(L-半胱氨酸)可以有效減少共培養(yǎng)后大豆子葉節(jié)外植體的褐化現(xiàn)象，同時將農(nóng)桿菌的感染率從37％提高至91％，后來又發(fā)現(xiàn)加入巰基混合物L(fēng)-Cys，DTT(二硫蘇糖醇)和硫代硫酸鈉對轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用更加明顯，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子葉節(jié)系統(tǒng)得到轉(zhuǎn)基因植株的頻率可達(dá)9.4％～26.2％，這是目前為止農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化最為成功的報告，他們推測巰基混合物提高T-DNA轉(zhuǎn)移效率的機(jī)理可能是抑制了植物對創(chuàng)傷和病原體侵染發(fā)生褐化反應(yīng)的酶的活性，例如過氧化物酶(PODs)和多酚氧化酶(PPOs)，而且由于不同化合物對氧化作用抑制的效果存在差異，使得巰基混合物促進(jìn)T-DNA向植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)移和減少外植體褐化的效果好于單一的巰基化合物。

2.5 合適的篩選劑

在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中，應(yīng)用最為廣泛的篩選劑是卡那霉素，Hinchee等采用卡那霉素作為篩選劑進(jìn)行大豆遺傳轉(zhuǎn)化，所獲得的再生植株中有6％是轉(zhuǎn)基因植株，Zhang等以除草劑glufosinate為篩選劑，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)的方法轉(zhuǎn)化大豆，使轉(zhuǎn)化頻率提高到3％，Paz等比較了glufosinate和bialaphos 2種篩選劑對轉(zhuǎn)化效率的影響，在芽誘導(dǎo)和芽伸長階段，在培養(yǎng)基中加入6mg/L的glufosi—nate，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率為2％～6.3％，而以biala—phos為篩選劑的材料，轉(zhuǎn)化頻率只有2.1％，Olhoft等采用潮霉素作為篩選劑，并在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加半胱氨酸、二硫蘇糖醇和硫代硫酸鈉，轉(zhuǎn)化效率由0.7％提高到16.4％，另外，在篩選策略上，不同研究者都趨于采用同樣的方式，即共培養(yǎng)后采用恢復(fù)培養(yǎng)，待外植體恢復(fù)正常活力后再采用較高的篩選濃度，生根時再降低篩選濃度，采用以上方法可以提高轉(zhuǎn)化效率。

總之，影響或限制農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素可概括為：①大豆基因型；②農(nóng)桿菌菌株和Ti質(zhì)粒；③外植體類型；④酚類化合物等各類誘導(dǎo)條件及轉(zhuǎn)化時合適的篩選劑等各種技術(shù)性環(huán)節(jié)。

責(zé)任編輯 校對 魏樂