張秋菊　顧地周　裴明玉

（1.通化師范學(xué)院生物系，吉林通化，134002；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院；3.通化師范學(xué)院分院）

東北龍膽不同提取液對(duì)菜蚜的生物活性研究

張秋菊1，2顧地周1裴明玉3

（1.通化師范學(xué)院生物系，吉林通化，134002；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院；3.通化師范學(xué)院分院）

應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)法研究了東北龍膽全草的不同提取液對(duì)菜蚜的觸殺和拒食作用。研究結(jié)果表明，乙醇浸提液對(duì)菜蚜具有較高的觸殺作用，對(duì)菜蚜48 h的致死中濃度為8.4133 mg/mL，觸殺致死率為95.8%。水蒸氣蒸餾液對(duì)菜蚜具有較強(qiáng)的拒食作用。對(duì)菜蚜24，48 h的拒食中濃度分別為9.2154，8.7136 mg/mL，48 h的拒食率為93.8%。丙酮浸提液對(duì)菜蚜的觸殺和拒食作用不明顯。

東北龍膽菜蚜均勻設(shè)計(jì)生物活性

長(zhǎng)白山區(qū)由于其適宜的地理位置和氣候條件，野生殺蟲(chóng)植物資源非常豐富，周繇[1]報(bào)道了長(zhǎng)白山野生殺蟲(chóng)植物共有57科、130屬、176種，其中龍膽屬植物既是道地藥材，又具有殺蟲(chóng)作用。東北龍膽（為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，全草入藥，主治濕熱黃疸、肝膽大逆、頭昏腦脹、消化不良、高血壓、急性傳染性肝炎、尿道炎等癥。目前對(duì)東北龍膽的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理活性等方面。利用植物防治作物病蟲(chóng)害的研究很多[2～3]，但利用東北龍膽防治農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。菜蚜為蔬菜重要害蟲(chóng)，主要吸食汁液，并能傳播病毒，嚴(yán)重時(shí)植株生長(zhǎng)停滯，產(chǎn)量降低，品質(zhì)變差。以往防治菜蚜大多采用樂(lè)果等高效、高毒、高殘留農(nóng)藥。本試驗(yàn)采用乙醇、丙酮浸提及水蒸氣蒸餾法對(duì)東北龍膽全草活性成分進(jìn)行提取，研究了不同提取液對(duì)菜蚜的生物活性，以期為長(zhǎng)白山野生殺蟲(chóng)植物資源的更好利用提供參考資料。

1　材料與方法

1.1供試材料

東北龍膽采自吉林省通化白雞腰國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。原植物由通化師范學(xué)院周繇教授鑒定。菜蚜捕自通化師范學(xué)院附近蔬菜田內(nèi)，選擇健康、大小均勻的菜蚜供試。

1.2藥液制備及制備方法

取東北龍膽的鮮全草3份，每份10 g，切割成小段，其中2份分別加入50 mL乙醇和丙酮，（25±2）℃恒溫震蕩提取6 h。另外1份用蒸餾水浸泡12 h后進(jìn)行水蒸氣蒸餾3次，均用雙層紗布過(guò)濾3次。將3次水餾液混合后直接定容，乙醇、丙酮浸提液的濾液減壓濃縮后加入少量95%乙醇溶解，再用蒸餾水定容，3種提取液均制備成質(zhì)量濃度為10.0，12.5，15.0，17.5，20.0，22.5，25.0 mg/mL備用（表1）。

1.3東北龍膽全草乙醇、丙酮浸提液和水蒸氣蒸餾液對(duì)菜蚜觸殺和拒食活性測(cè)定

①觸殺作用測(cè)定 采用浸漬法[4～5]，將菜蚜放入自制的小培養(yǎng)皿狀濾網(wǎng)中，浸沒(méi)于不同濃度乙醇、丙酮浸提液和水蒸氣蒸餾液（3種藥液均加入少量的吐溫-80或洗衣粉作為表面活性劑以確保藥液與菜蚜充分接觸）中處理20 s后迅速取出，置于有鮮嫩蔬菜葉的燒杯（500 mL，杯底墊有保濕濾紙3層）中，每個(gè)處理30只菜蚜，重復(fù)3次，對(duì)照分別用30%的乙醇、丙酮和蒸餾水做同樣處理。將燒杯置于溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度60%～75%，光照強(qiáng)度600 lx的培養(yǎng)箱內(nèi)觀察，于24，48 h后觀察菜蚜的死亡情況，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算出死亡率、校正死亡率和致死中濃度（）。

死亡率（%）=（死亡蟲(chóng)數(shù)/供試總蟲(chóng)數(shù)）×100%；校正死亡率（%）=[（處理組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）]×100%。

②拒食作用測(cè)定 采用浸葉法[6～7]，將鮮嫩的蔬菜葉用打孔器打成葉碟（直徑為3.0 cm），放入供試藥液中浸泡15 s，取出用吸水紙吸干葉碟表面藥液后放入墊有3層保濕濾紙的燒杯中，每杯1片葉碟，于葉片中央接入已饑餓12 h的菜蚜10只，每個(gè)處理30只菜蚜，重復(fù)3次，對(duì)照分別用30%的乙醇和蒸餾水做同樣處理。將燒杯置于溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度60%～75%，光照強(qiáng)度600 lx的培養(yǎng)箱內(nèi)觀察，24 h后統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和處理組葉碟上蚜蟲(chóng)棲息數(shù)，48 h后再次統(tǒng)計(jì)棲息數(shù)。計(jì)算棲息率和拒食率。根據(jù)平均棲息率計(jì)算出拒食率和拒食中濃度（）。

表1　(103)因素及水平設(shè)計(jì)

表1　(103)因素及水平設(shè)計(jì)

注:X1為乙醇浸提液質(zhì)量濃度，X2為丙酮浸提液質(zhì)量濃度，X3為水蒸氣蒸餾液質(zhì)量濃度，下同

水平　　因素/mg·mL-112310.0　10.0　10.02 12.5　12.5　12.53 15.0　15.0　15.04 17.5　17.5　17.55 20.0　20.0　20.06 22.5　22.5　22.57 25.0　25.0　25.08 20.0　20.0　15.09 22.5　22.5　12.510　25.0　25.0　10.01

表2　東北龍膽不同提取液對(duì)菜蚜的致死率和拒食率

棲息率（%）=（處理組蚜蟲(chóng)棲息數(shù)/每個(gè)處理蚜蟲(chóng)總數(shù)）×100%；拒食率（%）=[（對(duì)照組蚜蟲(chóng)棲息數(shù)-處理組蚜蟲(chóng)棲息數(shù)）/每個(gè)處理蚜蟲(chóng)總數(shù)]×100%。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用均勻設(shè)計(jì)（Uniform Design）軟件。回歸分析均采取全回歸（后退法）。

2　結(jié)果與分析

由表2，表3可知，24 h的毒力回歸方程分析結(jié)果表明，乙醇浸提液和水蒸氣蒸餾液對(duì)菜蚜有較好的觸殺作用，隨著乙醇浸提液和水蒸氣蒸餾液質(zhì)量濃度的增大，校正死亡率升高，由各方程項(xiàng)對(duì)回歸的貢獻(xiàn)值分別為（按偏回歸平方和降序排列）：4.92e-2%，由此可知，乙醇浸提液＞水蒸氣蒸餾液對(duì)菜蚜的觸殺活性；由48 h的毒力回歸方程（表3）發(fā)現(xiàn)，水蒸氣蒸餾液對(duì)菜蚜的觸殺不起作用，僅乙醇浸提液對(duì)菜蚜保持著較好的觸殺作用，當(dāng)乙醇浸提液質(zhì)量濃度為25.0 mg/mL時(shí)，其48 h校正死亡率可達(dá)到95.8%，=8.4133 mg/mL。

2.1東北龍膽全草乙醇、丙酮浸提液和水蒸氣蒸餾液對(duì)菜蚜的觸殺作用菜蚜蟲(chóng)體接觸藥液后，先是迅速無(wú)方向的四處爬動(dòng)，然后爬動(dòng)速度逐漸減慢直至靜止不動(dòng)，斷定菜蚜蟲(chóng)體已癱瘓或麻痹，大部分蟲(chóng)體不能恢復(fù)正常狀態(tài)，直接死亡，死亡狀態(tài)為靜止萎縮；24 h內(nèi)的觀察和統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，少數(shù)菜蚜雖經(jīng)歷癱瘓或麻痹一段時(shí)間后還可以恢復(fù)，但表現(xiàn)出明顯不取食現(xiàn)象，直至死亡。由回歸分析的結(jié)果可知，丙酮浸提液對(duì)菜蚜的觸殺活性不顯著。

2.2東北龍膽全草乙醇、丙酮浸提液和水蒸氣蒸餾液對(duì)菜蚜的拒食作用

由表2，表3可知，24 h的毒力回歸方程分析結(jié)果表明，3種藥液對(duì)菜蚜均有較好的拒食作用，隨著3種藥液質(zhì)量濃度的增大，拒食率增高，各方程項(xiàng)對(duì)回歸的貢獻(xiàn)值分別為（按偏回歸平方和降序排列）：由此可知，水蒸氣蒸餾液＞乙醇浸提液＞丙酮浸提液對(duì)菜蚜的拒食活性。由48 h的回歸方程（表3）發(fā)現(xiàn)，乙醇浸提液和丙酮浸提液對(duì)菜蚜的拒食不起作用，僅水蒸氣蒸餾液對(duì)菜蚜保持顯著的拒食作用，隨質(zhì)量濃度的增大，拒食率升高，菜蚜在處理葉碟上的棲息數(shù)比在對(duì)照葉碟上少，在高質(zhì)量濃度處理的葉碟上又比低質(zhì)量濃度處理的葉碟上顯著減少，24 h和48 h的水蒸氣蒸餾液拒食中濃度值分別為9.2154，8.7136 mg/mL；不同處理時(shí)間的拒食率不同，48 h的拒食率均高于24 h的拒食率，說(shuō)明48 h的拒食活性明顯高于24 h的拒食活性。

表3　東北龍膽對(duì)菜蚜的觸殺和拒食活性回歸分析結(jié)果

3　小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，東北龍膽全草中含有對(duì)菜蚜具有顯著生物活性的物質(zhì)，主要表現(xiàn)在對(duì)菜蚜的觸殺和拒食作用。

在觸殺試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)24 h的毒力回歸方程分析結(jié)果（表3）和表2可知，乙醇浸提液和水蒸氣蒸餾液對(duì)菜蚜都有較好的觸殺作用，24 h校正死亡率高達(dá)94.5%；對(duì)48 h的毒力回歸方程分析結(jié)果（表3）和表2可知，僅乙醇浸提液對(duì)菜蚜有較好觸殺作用，48 h校正死亡率可達(dá)到95.8%，觸殺的值為8.4133 mg/mL，部分菜蚜雖未死亡，但取食量明顯較對(duì)照少，且最終致死率均比24 h的高。丙酮浸提液對(duì)菜蚜的觸殺作用表現(xiàn)不明顯。分析以上結(jié)果的原因如下：①東北龍膽全草中起觸殺作用的活性物質(zhì)極易溶于乙醇且浸提量較多或者是在乙醇中保持較好的穩(wěn)定性，也可能是水蒸氣蒸餾液中起觸殺作用的活性物質(zhì)的量少或者在水中不穩(wěn)定易分解造成的；②東北龍膽全草中可能含有2種以上具有觸殺活性的不同物質(zhì)，其各自的觸殺作用機(jī)理不同，水蒸氣蒸餾液中的觸殺活性物質(zhì)作用時(shí)間短而乙醇浸提液中的觸殺活性物質(zhì)作用時(shí)間長(zhǎng)；③水蒸氣蒸餾液和丙酮浸提液中的觸殺活性物質(zhì)較乙醇浸提液中的拒食活性物質(zhì)易被菜蚜產(chǎn)生抗藥免疫力等；④可能是24 h的觸殺作用是2種藥液同時(shí)作用的結(jié)果，2種藥液同時(shí)起作用使觸殺率達(dá)到一定的數(shù)值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)乙醇浸提液中的觸殺活性物質(zhì)繼續(xù)起作用所致。

在拒食試驗(yàn)中，可能是24 h的拒食作用是3種提取液同時(shí)作用的結(jié)果，說(shuō)明東北龍膽全草中具有拒食作用的生物活性物質(zhì)均能被乙醇和丙酮浸提出來(lái)，也能通過(guò)水蒸氣蒸餾出來(lái)，只是提取的量不同而已?；蛘呤呛?種以上不同的對(duì)菜蚜具有拒食活性的物質(zhì)。從48 h的拒食活性分析（表3）和表2看出，僅水蒸氣蒸餾液表現(xiàn)顯著，24 h和48 h的水蒸氣蒸餾液拒食中濃度值分別為9.2154，8.7136 mg/mL，且48 h的拒食率都高于24 h，這可能是東北龍膽全草中起拒食作用的活性物質(zhì)主要靠水蒸氣蒸餾的方法才能提取得較完全或者是水蒸氣蒸餾液中起拒食作用的活性物質(zhì)較強(qiáng)，也可能是乙醇浸提液和丙酮浸提液中起拒食作用的活性物質(zhì)不強(qiáng)或者是3種藥液中具有拒食活性的不同物質(zhì)的拒食作用機(jī)理不同，乙醇浸提液和丙酮浸提液中的拒食活性物質(zhì)作用時(shí)間短而水蒸氣蒸餾液中的拒食活性物質(zhì)作用時(shí)間長(zhǎng)，還有可能是乙醇和丙酮浸提液中的拒食活性物質(zhì)較水蒸氣蒸餾液中的拒食活性物質(zhì)易被菜蚜產(chǎn)生抗藥免疫力等原因。

本試驗(yàn)應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析處理數(shù)據(jù)縮短了研究的周期，減少了試驗(yàn)次數(shù)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)將為進(jìn)一步利用東北龍膽研究和開(kāi)發(fā)新型的植物源農(nóng)藥提供參考依據(jù)。

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Study on Extraction fromKitag on Biological Activity against

ZHANG Qiuju1,2,GU Dizhou1,PEI Mingyu3

The effect of various extraction from the bulbs ofon contacting death and anti-feeding againstwas studied through uniform design was studied.The results showed that ethanol extract had high contacting death activity,the 48 hof death was 8.4133 mg/mL,the rate of death was 95.8%.Wet distillation liquid had strong antifeedant activity,the 24 h and 48 hof antifeedant were 9.2154,8.7136 mg/mL,the 48 h.rate of antifeedant was 93.8%.Acetone extracts had indistinctively contacting death and antifeedant.

Brevicoryne brassicae;Uniform Design;Biological activity

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.18.025

吉林省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目[(2003)-65]

張秋菊（1968-），女，副教授，在讀博士，主要從事長(zhǎng)白山藥用植物研究，電話:0435-3208073。E-mail:zhangqiuju5515@163.com

2009-05-06