王學貴 伍智華 沈麗淘 田永清

（1.農(nóng)藥與化學生物學教育部重點試驗室，華南農(nóng)業(yè)大學，廣州，510642；2.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院）

WANG Xuegui1,2,WU Zhihua2,SHEN Litao1,TIAN Yongqing1

42種藥用植物甲醇提取物對番茄灰霉病菌抑菌活性的研究

王學貴1，2伍智華2沈麗淘2田永清1

（1.農(nóng)藥與化學生物學教育部重點試驗室，華南農(nóng)業(yè)大學，廣州，510642；2.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院）

運用菌絲生長速率抑制法測定了42種植物甲醇提取物對番茄灰霉病的抑菌活性。試驗結果表明，心籽絞股藍、海南五針松、水馬桑3種植物提取物對番茄灰霉病菌的抑菌作用較好，在5 mg/mL濃度下抑制率分別為83.68%，76.21%，60.88%；并進一步測定心籽絞股藍、海南五針松及水馬桑對番茄灰霉病的毒力，其分別為1.000 mg/mL，3.275 mg/mL及5.050 mg/mL。心籽絞股藍表現(xiàn)出對番茄灰霉病菌有較好的抑制作用，但其抑菌活性成分還需進一步深入研究。

番茄灰霉病 植物甲醇提取物 心籽絞股藍 抑菌活性

番茄是世界上最主要的蔬菜作物之一，由于含有豐富的營養(yǎng)成分，在人們?nèi)粘Ｉ钪姓加信e足輕重的地位。番茄灰霉病是番茄生產(chǎn)過程中的主要病害之一，常造成果實腐爛，一般減產(chǎn)20%～30%，嚴重的高達50%以上，對番茄生產(chǎn)構成極大威脅[1]。目前，在防治灰霉病上主要選用苯并咪唑類的多菌靈、甲基硫菌靈，二甲酰亞胺類的腐霉利，異菌脲以及N-苯氨基甲酸酯類的乙霉威等藥劑。長期單一的使用該類藥劑使得番茄灰霉病菌對其產(chǎn)生了嚴重的抗藥性，同時加大劑量防治導致農(nóng)藥殘留的問題越來越嚴重[2～4]。因此，開發(fā)高效、低毒、低殘留的“環(huán)境和諧農(nóng)藥”（environment acceptably/friendly pesticides），有效防治番茄灰霉病已經(jīng)成為當務之急[5]。

植物源農(nóng)藥由于對人畜安全無毒，對環(huán)境安全及對病蟲的殺傷特異性強等[6]，已受到社會的廣泛關注。科學研究工作者對其進行了大量的研究，如我國曾以大蒜素分子結構為模板衍生合成了乙蒜素，成功開發(fā)出“抑菌素401”和“抑菌素402”，用來防治甘薯黑斑病、小麥腥黑穗、棉花苗期病害等[7]；黃樂平等[8]通過對新疆幾十種植物抑菌活性的測定，發(fā)現(xiàn)了7種植物對黃瓜霜霉病有較好的防效，并進一步對其中的4種植物抑菌活性研究后，復配出抗病增產(chǎn)劑I號、Ⅱ號、Ⅲ號；孟昭禮等[9]經(jīng)過對銀杏抑菌活性十幾年的潛心研究，現(xiàn)已通過仿生合成開發(fā)出“綠帝乳油”，并已經(jīng)獲得專利。另外，還采用人工模擬技術合成一種農(nóng)用殺菌劑銀泰。Dev U等[10]研究發(fā)現(xiàn)，植物芳香成分中的丁子香酚、甲基丁子香酚、檸檬醛、2-苯乙醇等6種化合物對5種種子病原真菌的菌絲生長有強烈的抑制作用，在植物病害防治和檢疫中具有潛在的應用價值。

因此，對植物進行殺菌活性篩選，尋找具有高效殺菌活性的特有植物，對探索結構新穎的可直接應用于農(nóng)業(yè)病害防治或進行仿生合成尋找先導化合物，具有重要意義。本研究對42種藥用植物甲醇提取物對番茄灰霉病進行了生物測定，為從植物中分離出對番茄灰霉病具有高活性的化合物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

②供試植物材料 除峨眉菝葜采自峨眉山之外，其余41種植物均采自重慶金佛山國家自然保護區(qū)。品種如下：蛇足石杉（Thunb.ex Murray）峨眉菝葜、檫木海南五針松巖木瓜Corner）、珍珠蓮Oliv.）Corner）、南川木菠蘿

③供試溶劑 丙酮（AR級），甲醇（AR級），無菌水。

④供試儀器 DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱，LDZX-50FA立式電熱壓力蒸汽滅菌器，SPX生化型培養(yǎng)箱，F(xiàn)Z-102型粉碎機，EYELA-1000型濃縮儀，DPH-6123型真空干燥箱，CP224S電子分析天平。

1.2 試驗方法

①植物樣品前處理與活性物質的提取a.植物樣品的干燥與粉碎。將采集的各種樣品約500 g自然風干，再利用真空干燥箱干燥，箱內(nèi)溫度為55℃，壓力為0.05 Pa，直到植物樣品完全干燥為止。用粉碎機進行粉碎，得到60目（孔徑0.246 mm）篩的植物樣品粉末備用。

b.植物甲醇提取物的提取。采用冷浸法進行提?。悍Q取50 g供試植物干粉裝入大型廣口瓶 （體積1000 mL）中，然后加入500 mL甲醇進行提取，5 d后濾出浸提液，采用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮。采用以上方法再重復提取2次，合并所得的甲醇浸膏，稱重存儲于冰箱中備用[11]。

②植物甲醇提取物的抑菌活性篩選 采用菌絲生長速率抑制法[7]。分別準確稱取每種植物甲醇浸膏0.5 g溶解于2 mL丙酮中，然后加無菌水至10 mL，配成50 mg/mL母液，用20 W紫外燈照射30 min備用。配制母液過程中，如果浸膏溶解性不好，可加入2～3滴吐溫80進行攪拌，同時輔助超聲波處理10 min增加其溶解性，形成均一穩(wěn)定的藥液備用。

用1 mL的移液管取1 mL母液轉移到培養(yǎng)皿中（Φ=9.0 cm），然后用10 mL移液管移取9 mL熔融培養(yǎng)基（50～60℃）到培養(yǎng)皿，形成5 mg/mL的含毒培養(yǎng)基，對照為0.2 mL丙酮+0.8 mL無菌水+9 mL培養(yǎng)基，每處理重復3次。最后在冷卻培養(yǎng)基表面接種菌餅（Φ=0.5 cm），然后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后采用“十”字交叉法測定菌落直徑。

③抑菌活性較好的提取物對番茄灰霉病毒力的測定 每個提取物設置5個濃度梯度處理，其余同②。

④數(shù)據(jù)處理 計算各處理抑制率。將濃度轉化為濃度常用對數(shù)，抑制率轉化為幾率值，建立毒力回歸方程（=a+b），求出毒力及95%的置信區(qū)間。

抑制率（%）=[（對照菌落擴展直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.5×菌餅直徑）]×100%。

2 結果與分析

2.1 42種植物甲醇提取物對番茄灰霉病菌的生物活性

試驗結果表明，心籽絞股藍、海南五針松及水馬桑對番茄灰霉病菌表現(xiàn)出較強的抑制活性，其抑制率分別為83.68%，76.21%及60.88%，且與其余處理差異顯著；在試驗中也發(fā)現(xiàn)有些植物提取物對菌絲不但沒有抑制作用，反而還具有促進作用，比較顯著的是金線草，其抑制率為-22.55%；其次為冬桃（枝葉），為-14.40%，川牛膝也達到了-11.66%（表1）。

2.2 抑菌活性較好的提取物對番茄灰霉病毒力測定

表1 42種植物甲醇提取物對番茄灰霉病的抑菌活性

毒力測定結果表明，心籽絞股藍、海南五針松及水馬桑對番茄灰霉病的分別為1.000 mg/mL，3.275 mg/mL和5.050 mg/mL（表2）。

3 結論與討論

3.1 結論

通過測定42種植物甲醇提取物對番茄灰霉病的生物活性，篩選出心籽絞股藍、海南五針松、水馬桑對番茄灰霉病具有較好的抑制作用，其抑制率均達到60%以上；通過對這3種植物提取物進行毒力測定，其有效中濃度分別為：心籽絞股藍1.000 mg/mL、海南五針松3.275 mg/mL、水馬桑5.050 mg/mL。綜合以上結果表明，心籽絞股藍對番茄灰霉病的抑菌效果最好。

3.2 討論

本試驗中發(fā)現(xiàn)某些植物甲醇提取物對番茄灰霉病菌有促進作用，如在5 mg/mL濃度下，金線草、冬桃（枝葉）及川牛膝的提取物對番茄灰霉病菌的抑制率分別為-22.55%，-14.40%及-11.66%。針對這種情況，其原因可能是在植物中同時存在抑菌、促菌2類活性物質。隨著濃度的降低，其抑菌、促菌活性物質比例不同，導致結果不同[12]。但具體原因目前還未見報道，值得進一步研究。

心籽絞股藍是葫蘆科絞股藍屬多年生攀緣草本植物。有相關研究表明同屬植物絞股藍具一定的廣譜抗菌活性[13]，其主要成分為皂苷、多糖、黃酮類化合物、有機酸和微量元素等多種化學成分[14]。廣泛研究表明，皂苷與黃酮類化合物具有較強的抑菌活性，如空心蓮子草皂苷類物質對細菌和真菌均有一定程度的抑制作用，對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、黑曲霉和根霉有明顯的抑菌作用[15]；水溶性海參皂苷對黃瓜枯草病原菌和葡萄炭疽病菌，以及黑曲霉菌也具有顯著的抑菌活性[16]；節(jié)節(jié)草地上部含有豐富的黃酮類化合物，其對大腸桿菌和八疊球菌等有明顯的抑制作用[17]；苦參中黃酮類化合物也對細菌和真菌有抑制作用[18]。所以，心籽絞股藍對番茄灰霉菌表現(xiàn)出抑菌效果，可能與該種植物中含有豐富的黃酮和皂苷類次生代謝物質有關，但活性物質的分離和結構的鑒定還需要進一步深入研究。

表2 3種植物甲醇提取物對番茄灰霉病菌的毒力測定

[1]姜巍，王德爽.番茄灰霉病的綜合防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2007（8）：22.

[2]丁中，劉峰，慕立義.不同抗性型灰葡萄孢對不同作用機制殺菌劑的敏感性研究[J].農(nóng)藥學學報，2001，3（4）：59-63.

[3]徐作珽，李林，于建壘，等.蔬菜灰霉病對腐霉利抗藥性變異及其治理[J].植物保護學報，2001，28（1）：33-38.

[4]楊濤，關天舒.保護地番茄灰霉病菌抗藥性治理策略的理論模型與實踐[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2002，35（8）：1030-1032.

[5]操海群，岳永德，花日茂，等.植物源農(nóng)藥研究進展（綜述）[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2000，27（1）：40-44.

[6]周仕濤.我國植物源農(nóng)藥的研究及前景[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2004，17（4）：525-529.

[7]趙善歡.植物化學保護.3版[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：301-312.

[8]黃樂平，田黎，師聽.植物性殺菌劑防治溫室黃瓜霜霉病研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學，1997（1）：34-36.

[9]孟昭禮，袁忠林，羅蘭，等.人工模擬農(nóng)用殺菌劑銀泰對5種植物病害的藥效試驗[J].萊陽農(nóng)學院學報，2001，18（4）：302-305.

[10]Dev U,Devakumar C,Mohan J,et al.Antifungal Activity of Aroma Chemicals Against Seed-borne Fungi[J].Essent Oil Res，2004(16)：496-499.

[11]黃桂榮，李有志，徐大高，等.9種湘西植物甲醇提取物的抗真菌活性[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術學院學報，2005，18（4）：49-52.

[12]韓建華.植物源抑菌活性物質初步研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2002.

[13]曾曉黎.絞股藍的體外抗菌活性試驗[J].中成藥，1999，21（6）：308-310.

[14]劉欣，葉文才，蕭文鸞，等.絞股藍的化學成分研究[J].中國藥科大學學報，2003，34（1）：21-23.

[15]程超，秦恩華，朱玉昌，等.空心蓮子草皂苷類物質功能特性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，33（12）：60-62.

[16]叢日山，袁文鵬，樊廷俊，等.仿刺參水溶性海參皂苷的分離制備及抗真菌活性的研究[J].中國海洋大學學報，2006，36（6）：959-964.

[17]李國慶，艾尼娃爾·艾克木，李佳，等.節(jié)節(jié)草黃酮類化合物的提取及抑菌活性研究[J].生物技術，2008，18（4）：34，44，54.

[18]鄭津輝，王威，黃輝.苦參提取液中黃酮類化合物的抑菌作用[J].武漢大學學報：理學版，2008，54（6）：439-442.

Preliminary Studies on the Antifungal of 42 Medical Plant Species Methanol Extracts against

The antifungal activities of 42 species medical plant methanol extracts were tested on thePers. with a growth rate method.The results showed that the antifungal activities against thePers.ofCogn.ex Oliv.,Hand.-Mazz.andWall.(5 mg/mL)were better than other treatments,and the inhibition rates were 83.68%,76.21%,60.88%,respectively.Also deeply detected the toxicities of three plants againstPers.and theof them were 1.000 mg/mL,3.275 mg/mL and 5.050 mg/mL.So G. cardiospermum Cogn.ex Oliv.has shown good antifungal activity against thePers.and the active ingredients would be worthy of further study.

Pers.;Plant methanol extracts;Cogn.ex Oliv.;Antifungal activity

WANG Xuegui1,2,WU Zhihua2,SHEN Litao1,TIAN Yongqing1

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.18.028

王學貴（1976-），男，博士研究生，講師，主要從事植物源農(nóng)藥研究。E-mail:wanderwxg@sican.edu.cn

2009-03-10