張　童

摘要：闡述了幾種禾本科植物離體再生體系研究現(xiàn)狀。著重介紹了外植體選擇、褐化現(xiàn)象及其防治措施以及離體再生體系建立的主要步驟，最后對離體再生培養(yǎng)技術(shù)做了展望。

關(guān)鍵詞：外植體；離體再生；愈傷組織；褐化現(xiàn)象

0 前言。在20世紀(jì)60年代和70年代，隨著植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)方法的增多，人們已開始將其應(yīng)用于研究許多重要的作物。在早期的工作中，由于使用相對成熟而復(fù)雜的外植體，因此限制了植株的形態(tài)發(fā)生和表達(dá)。組織培養(yǎng)植株再生中器官發(fā)生包括由莖尖、腋芽、原球莖、球莖、塊萃、鱗莖等外植體直接分化成器官的直接發(fā)生和外植體先脫分化形成愈傷組織再分化成器官的間接器官發(fā)生，筆者主要是做前者。白茅為禾本科白茅屬多年生草本，根可吃，也可入藥，根狀莖十分發(fā)達(dá)，在生長地塊上縱橫交錯(cuò)，可防風(fēng)固堤，能在其它植物難以生長的純沙地上生長。白茅根的化學(xué)成分以三萜類化合物為主：蘆竹素(Amndoin)、白茅素(Cylindrin)、羊齒烯(Ferrleno1)、喬木萜烷(Arborane)、異喬木萜烷(Isoarborino1)、西米杜鵑醇(Simiareno1)、喬木萜醇(Arborino1)、喬木萜醇甲醚(Arborinol methyl ether)、喬木萜酮(Arborinone)和木栓酮(Filedelin)等。其莖含有果糖、甘露醇、檸檬酸等成分。白茅根實(shí)際為白茅的根狀莖。其性寒、味甘，能清熱涼血、利尿通淋，關(guān)于白茅根的降溫作用早在清代已有記載。如張錫鈍在《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中這樣說"茅根稟少陽最初之氣，涼而能散。其涼散之力，能將臟腑經(jīng)絡(luò)間之毒熱盡數(shù)排出" 且把單味鮮白茅根列為治療溫?zé)岵〉闹匾絼1]。近年來，在白茅根的化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用與炮制等研究方面已取得了一定進(jìn)展，但還存在一些問題，目前對其藥理作用研究還停留在表面，在炮制工藝方面缺乏行之有效的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化操作方法，今后需利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與方法對白茅根化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究探索。其主要化學(xué)成分與生理活性的關(guān)系，同時(shí)進(jìn)一步完善白茅根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究內(nèi)容，建立一種國內(nèi)外均可接受的完整的質(zhì)量控制系，為其走向國際市場

奠定堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)利用植物脫毒、離體快繁、人工種子等技術(shù)可以解決一些植物種質(zhì)退化、珍稀名貴植物快速繁殖等問題。隨著人們對離體條件下誘導(dǎo)植物外植體再生植株的機(jī)理及影響因素、外植體褐變及其抑制等研究的不斷深入，植株再生體系的建立已經(jīng)取得了快速發(fā)展。

1 外植體選擇

對于離體再生體系的建立，選擇合適的外植體尤為重要。植物細(xì)胞具有全能性, 任何組織、細(xì)胞、器官都能再生植株, 但事實(shí)上, 不同品種、器官之間分化能力差異很大, 外植體的制備和培養(yǎng)又是建立在無菌操作基礎(chǔ)上的一門技術(shù), 選擇適宜的外植體是確保外植體培養(yǎng)成功的一個(gè)重要因素, 把好材料的滅菌關(guān)是提高接種成功率的關(guān)鍵。對于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇外植體的方法也不一樣，下面介紹幾種禾本科外植體的不同選擇方法及要求。

據(jù)了解，在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中,幼胚是應(yīng)用最早的外植體。許多研究認(rèn)為,幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生能力高于幼穗和成熟胚,目前獲得成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株大多數(shù)來自于幼胚或幼胚愈傷組織。然而,陳梁鴻等,林剛、李根英、趙林姝等在比較幼穗和幼胚為受體的轉(zhuǎn)化研究后認(rèn)為,幼穗的轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于幼胚,幼穗較幼胚更耐繼代,更易形成再生植株。而對于麻竹的離體快速繁殖而言，選取枝條剛停止生長，枝稍展葉3～7片，基部枝箕枯黃或者開始剝落，末萌側(cè)芽或剛萌側(cè)芽作為外植體為佳。在水稻不同外植體的組織培養(yǎng)研究中，研究最多的為花藥、幼穗、幼胚、成熟胚(種子)4種外植體。玉米的外植體最常選用幼胚、幼葉、幼雌（雄）穗、下胚軸和成熟胚。白茅主要是莖生長點(diǎn)和根狀莖的節(jié)，最好的外植體材料是地上部與地下部交接處，因?yàn)榇颂幯奎c(diǎn)最多，利于誘導(dǎo)出更多叢生芽。

植物組織培養(yǎng)要能在各個(gè)方面得到有效的應(yīng)用，首先取決于實(shí)驗(yàn)材料培養(yǎng)效果的優(yōu)劣，而影響培養(yǎng)效果的主要因素是基因型和外植體種類。

2 離體再生系統(tǒng)的建立

廣義的植物組織培養(yǎng)不僅包括在無菌條件下利用人工培養(yǎng)基對植物組織的培養(yǎng)，而且包括對原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞和植物器官的培養(yǎng)。因?yàn)榕囵B(yǎng)的器官已經(jīng)脫離了母體，所以也稱之為離體培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)研究自德國植物生理學(xué)G．Haberlandt的工作開始，及1934年美國學(xué)者White等用番茄根進(jìn)行組織培養(yǎng)，首次建立了活躍生長的無性繁殖系以來，至今已有100多年的歷史?，F(xiàn)在植物組織培養(yǎng)技術(shù)已在科研和生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，成為最常用的生物工程技術(shù)之一。植物組織培養(yǎng)可以進(jìn)行植物離體快繁、無病毒苗木培育、培育新品種或創(chuàng)制新物種、次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)、植物種質(zhì)資源的離體保存、人工種子等方面的應(yīng)用。其中離體快繁是組織培養(yǎng)在林木生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛、最成功的一個(gè)領(lǐng)域。離體再生體系建立關(guān)鍵是外植體的選擇、培養(yǎng)基和無菌體系的建立，前文筆者已將外植體的選擇做了介紹，這里不再贅述，不同植物所需要的生長條件不同,所用的培養(yǎng)基也有所不同。較常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有MT、MS、SH、N6 、White 等。

無菌體系的建立主要有外植體的脫毒、所需培養(yǎng)基和操作工具的高壓滅菌、 超凈工作臺(tái)。外植體脫毒通常是通過莖尖處理、莖尖結(jié)合熱處理、冷處理、化學(xué)藥劑處理及愈傷組織處理等方法可以去除植物病毒[2]。培養(yǎng)基用常壓或高壓蒸煮等濕熱滅菌、器械采用灼燒滅菌、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌、不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌、植物材料表面用消毒劑滅菌、物體表面用藥劑噴霧滅菌、接種室等空間采用紫外線或熏蒸滅菌。

3 影響愈傷組織形成的激素

植物組織培養(yǎng)是在無菌條件下,將離體的植物器官(根尖、莖尖等)、組織(形成層、花藥組織等)、細(xì)胞(體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生質(zhì)體等在人工配制的培養(yǎng)基上培養(yǎng),給予適宜的培養(yǎng)條件,誘發(fā)其產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽或長成完整的植株的技術(shù)[3]，其原理是細(xì)胞全能性。在組織培養(yǎng)中,愈傷組織和胚狀體能否形成是培育出新植株的關(guān)鍵。通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基里添加一定濃度的外源激素,可誘導(dǎo)出愈傷組織、胚狀體、不定芽、根等器官,最終獲得再生植株或次生物質(zhì)。最常用的誘導(dǎo)愈傷組織的生長素是IAA、NAA和2 ,4 - D ,所需濃度為0. 01～10 mg/ L 。最常用的細(xì)胞分裂素是KT和ABA ,使用濃度為0. 1～10mg/ L 。KT的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂和愈傷組織分化。ABA對植物體細(xì)胞胚的發(fā)生與發(fā)育具有重要作用。各類植物激素的生理作用雖有相對專一性,但是植物的各種生理效應(yīng)是不同種類激素之間相互作用的綜合表現(xiàn)。

4 植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及其防止措施

4.1 褐化現(xiàn)象的原因及其特性

褐化是植物組織培養(yǎng)中較為常見的一種現(xiàn)象，也稱為褐變，在植物組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)中常有發(fā)生。褐變現(xiàn)象原因主要有非酶促褐變和酶促褐變。非酶促褐變是由于細(xì)胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細(xì)胞程序化死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。在外植體再生分化過程中會(huì)有很多因素造成的細(xì)胞程序化死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡，但這種褐變?nèi)舨扇∵m當(dāng)措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生。多數(shù)認(rèn)為，植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象主要是由酶促褐變引起的，即由多酚氧化酶(PPO，Poly-phenol Oxidase)作用于天然底物酚類物質(zhì)而引起的。一般認(rèn)為，褐化是指外植體或培養(yǎng)材料接種后在組織培養(yǎng)過程中，由于切割造成機(jī)械損傷，傷口處分泌出酚類化合物，在有氧條件下，切面細(xì)胞中的酚類物質(zhì)為多酚氧化酶催化，氧化為醌，醌再通過非酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)而導(dǎo)致組織褐變，變成棕褐色或暗褐色，并逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，抑制細(xì)胞內(nèi)其它酶的活性，影響細(xì)胞的正常代謝，毒害整個(gè)組織，導(dǎo)致組織死亡。

4.2 褐化現(xiàn)象的防治措施

褐化現(xiàn)象的防治措施主要是根據(jù)導(dǎo)致褐化的原因來解決。最直接的防治措施就是在培養(yǎng)基中添加防褐劑，選用適宜的抗氧化劑與吸收劑種類及含量。其它防治措施還有改變培養(yǎng)基的狀態(tài)、選擇適宜的接種方式、通過試驗(yàn)選擇適宜的消毒方式等。

5 小結(jié)

21世紀(jì)是生物技術(shù)迅速發(fā)展的世紀(jì)，而植物組織培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中的重要內(nèi)容，可以用于植物育種、脫毒和離體快繁、種質(zhì)資源的保存及其交換，在遺傳、生化、生理、病理等研究上均有應(yīng)用。組織培養(yǎng)是生物工程的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，并且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中越來越廣泛，發(fā)揮的作用越來越大。據(jù)了解，現(xiàn)在市場對組培苗的需求量逐步遞增，這為植物組織培養(yǎng)離體快繁技術(shù)提供了廣闊的前景。當(dāng)然，現(xiàn)在的離體再生培養(yǎng)技術(shù)與理論還有待更好的完善，如污染、褐化現(xiàn)象等問題的有效防治措施，隨著科技的進(jìn)步，這項(xiàng)技術(shù)會(huì)發(fā)揮巨大的作用。

參考文獻(xiàn)

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