史光軍 陳斌 欒紹海 于江 張磊 許評

·綜述·

胰島移植現(xiàn)狀及展望

史光軍 陳斌 欒紹海 于江 張磊 許評

糖尿病 (diabetes mellitus, DM) 是一種嚴重威脅人類健康和生命的高發(fā)性的代謝性疾病。臨床分為1型(T1DM)、2型(T2DM)、特殊型、妊娠糖尿病4種類型。目前常用的糖尿病治療方法包括胰島素注射、胰島素泵、全胰腺移植和胰島移植。雖然注射外源性胰島素可以有效控制血糖，但無法改善血糖的生理性代謝和根本解決DM并發(fā)癥的問題。而全胰腺移植和胰島移植均可使受者獲得接近生理狀態(tài)的胰島素分泌。與全胰腺移植相比，胰島移植手術(shù)簡單、安全、并發(fā)癥少,可糾正糖代謝紊亂，尤為重要的是可以防止、減緩甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病性微血管病變,減少心、腎等臟器并發(fā)癥的發(fā)生,降低病死率。近些年來,隨著胰島分離純化技術(shù)提高、新型免疫抑制劑問世等,胰島移植已從實驗階段進入了臨床實踐,取得了令人鼓舞的效果。

一、胰島細胞移植技術(shù)發(fā)展史

1894年,英國醫(yī)師Williams 采用部分羊胰腺成分移植治療臨床糖尿病，開創(chuàng)了胰島移植的歷史。1967年Lacy等[1]采用消化酶從大鼠胰腺中分離出完整胰島，開展了人類首例異種胰島移植。1972年Ballinger等[2]報道大鼠異體胰島移植實驗獲得成功。1980年Agren等采用胚胎胰島或胚胎胰組織移植于人類,獲得了短期胰島素分泌功能,部分患者甚至撤除了外源性胰島素。1989年Ricordi等報道了胰腺消化自動化操作方法，稱之Ricordi方法,并廣泛應用于實驗研究與臨床研究。1990年Scharp等采用胰島細胞移植治療T1DM后,患者撤除胰島素達 1個月之久。從那時起,不論移植后用什么免疫抑制方案，大多數(shù)使用1個胰腺分離的胰島進行移植的患者都只有短期甚至沒有脫離胰島素。2000年加拿大Edmonton Alberta大學的Shapiro領導的研究小組探索了一種胰島移植方案——Edmonton方案。他們對 7 例有嚴重低血糖史和代謝不穩(wěn)定的 T1DM患者使用2～4個胰腺進行分離、多次移植，并調(diào)整免疫抑制方案，術(shù)后平均隨訪11.9個月,均不需胰島素治療,未再發(fā)生嚴重低血糖。此后,世界范圍內(nèi)再次掀起了成人胰島細胞移植的研究熱潮。2000年至今,全世界有15個國家47個機構(gòu)開展該項研究[3]。目前，國內(nèi)多家醫(yī)院開展了胰島移植，如南京軍區(qū)福州總醫(yī)院和上海市第一人民醫(yī)院開展成人胰島細胞移植(其中3例與腎臟聯(lián)合移植),哈爾濱開展了1例成人胰島與胚胎胰組織混合移植,無錫開展了1例肝臟移植與未純化成人胰島組織聯(lián)合移植,長沙開展了豬胰島異種移植等。

二、胰島的分離純化

胰島分離純化方法很多,一般采用膠原酶灌注-連續(xù)密度梯度法分離胰島。將尸體胰腺經(jīng)腹主動脈灌注4℃的UW液后切取胰腺,置0℃的UW液中保存。在無菌條件下切取胰體尾部(因胰體尾部含大量胰島且膽汁污染機會少),經(jīng)主胰管灌注膠原酶。通過機械擴張和酶的消化將胰島組織分離出來,然后移入全自動細胞分離機分離純化胰島,在體外嚴格篩查和鑒定,進一步離析雜質(zhì),達到純化的目的[4]。分離純化后的胰島采用雙硫腙 (DTZ) 染色法檢測胰島純度,用臺盼藍染色檢測細胞活性。原位整體灌注法獲得的細胞團塊較多,單細胞較少,移植效果好。

近來德國Bucher等[5]研制出一種用于成人胰島分離的新型消化酶,稱為 Serva膠元酶NB1,胰島獲得率與以前使用的釋放酶類似,但胰島的形態(tài)學得到改善,細胞凋亡比例減少,且無批號間酶活性變異,有望成為人胰島分離的專用消化酶。Huang等[6]使用UW液配制Euro-Ficoll的連續(xù)密度梯度離心法純化胰島,可進一步提高胰島的純度至95%以上,胰島的收獲量由每次分離218 000個提高到435 318,胰島細胞活力由65.4%上升到92.1%。一些中心改進了胰腺保存、分離培養(yǎng)技術(shù),結(jié)合新型免疫抑制方案如抗CD3抗體,使最初Edmonton方案中平均2個供胰供給1個受者,每個受者平均接受 2次移植,進步到單個供胰、單次移植[7-8]。

三、胰島移植

理想的胰島移植部位的選擇應兼顧以下3方面：①手術(shù)安全、簡單；②有利于維持代謝穩(wěn)定；③免疫耐受。經(jīng)門靜脈肝內(nèi)移植曾被認為是較理想的部位,但后來人們發(fā)現(xiàn),胰島會隨門靜脈血流丟失,口服藥物也會影響肝內(nèi)胰島的功能,不純的胰島移植物還可導致肝內(nèi)靜脈栓塞。目前國內(nèi)外臨床移植最常用的部位以腹腔內(nèi)及肌肉內(nèi)最多[9],主要包括三角肌、腹直肌、小網(wǎng)膜內(nèi)、門靜脈內(nèi)、體靜脈內(nèi)和腎脂肪囊內(nèi)等,較少見的有顱內(nèi)移植。肌肉內(nèi)移植方便、安全、創(chuàng)傷小,但肌肉不是免疫耐受區(qū),影響長期療效。小網(wǎng)膜因血供團(ICC)豐富、寬敞、外科手術(shù)簡便安全,胰島素釋放至門靜脈系統(tǒng)符合胰島分泌途徑等特點,應該是理想的移植部位。腎包膜下、顱內(nèi)、睪丸是體內(nèi)的免疫耐受區(qū),此處移植胰島可能避免移植排斥。

有研究估計，超過三分之二的移植胰島在移植后早期即被破壞。移植胰島在新生血管形成前兩周的缺氧應激是最主要的損傷機制,其他的影響因素還包括組織因子介導的炎癥反應和血小板激活、移植部位的炎癥因子釋放和激活、免疫排斥反應介導的損傷等。為提高臨床胰島移植的效果，針對胰島細胞凋亡進行了一些干預研究，如抑制凝血酶和組織因子可以減少胰島細胞凋亡。也有很多研究在尋找可以促進胰島細胞生長的因子或細胞分子以提高移植胰島的存活和功能，如在嚙齒類動物模型中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝細胞生長因子(HGF)可以促進移植胰島的存活和功能,可以節(jié)約胰島,但HGF半衰期極短,需要持續(xù)靜脈滴注。轉(zhuǎn)基因小鼠在HGF表達增加的同時伴有其他部位組織的腫瘤發(fā)生增加,在人胰島移植中的作用及長期安全性的研究無疑存在轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及倫理學方面的障礙[10]。

四、胰島移植類型

1．同種異體移植：同種異體胰腺的胰島是提供臨床胰島移植的主要來源。腦死亡供體的成人胰腺可供分離的胰島較多,分泌胰島素穩(wěn)定,但胰島免疫原性強,耐免疫排斥差,需終生采用免疫抑制。死嬰胎胰島免疫源性弱,增殖力強,但胎胰島含量少,數(shù)個供體方能滿足一個受體需要。這些來源的胰島遠遠不能滿足臨床移植的需要。

2．活體移植：由于胰腺手術(shù)并發(fā)癥多且嚴重而且供者將胰腺部分供出后要承受患糖尿病的風險,為此這一直是胰腺或者是胰島活體移植的禁區(qū)。但在2004年,日本Matsumoto等[11]首先比較了胰頭及胰尾部胰島細胞活力及產(chǎn)量的差異,結(jié)果認為胰尾部胰島細胞適合做活體移植。2005年他們進行了第 1例活體胰島移植[12]。從供者胰腺中共分離出胰島408 144 IEQ,未經(jīng)純化立即移植入受者體內(nèi) ,移植后22 d受者不依賴胰島素注射,37 d后口服葡萄糖耐量試驗陰性,供體術(shù)后血糖保持穩(wěn)定。但在這個報道中受者為慢性胰腺炎患者,而不是自身免疫性的1型糖尿病患者。活體供者來源的胰腺與尸體胰腺相比具有以下優(yōu)勢：①不會產(chǎn)生細胞因子釋放綜合征；②胰腺組織的損傷較??；③若胰腺來源于相關供者，則組織相容性好[13]；④縮短了熱缺血和冷缺血時間,可以獲得更多更高質(zhì)量的胰島細胞。但活體胰島移植供、受者的長期療效如何目前尚不得而知，而且供者存在一定的風險，必須謹慎選擇。

3．異種移植：由于同種胰島細胞來源短缺，想方設法增加胰島供體來源是當前追求的目標，利用動物的胰島細胞是可能取得突破的途徑之一。異種移植不僅存在免疫排斥反應,這可以采用微囊化等技術(shù)加以解決，更重要的是動物體內(nèi)存在尚不為人類知道的病原體,這些病原體在移植后不知是否能導致嚴重后果。豬胰島素與人胰島素的氨基酸序列僅有一個氨基酸不同，應是臨床胰島移植的最佳異種供體之一。1998年 Heneine等[14]報道了 10例患者接受豬胰島細胞異種移植后未能檢測到致命病毒的存在依據(jù)。為此我們有可能利用異種供體特別是豬作為異種供者?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)在異種胰島細胞移植中的應用更使異種胰島細胞移植具有令人鼓舞的前景[14-16]。

4．干細胞移植：胰島干細胞理論上可以取之不盡且可以進行免疫修飾等處理，是最理想的胰島來源。最近研究者發(fā)現(xiàn)，造血干細胞、胚胎干細胞、肝干細胞、脾干細胞、胰腺導管上皮細胞等在一定條件誘導下可分化為分泌胰島素的胰島樣細胞,移植入糖尿病大鼠模型體內(nèi)可以逆轉(zhuǎn)高血糖狀態(tài)并保持血糖穩(wěn)定。胚胎干細胞作為最有前景的胰島細胞替代治療途徑是近年來的研究熱點，但目前對其分化為胰島細胞的過程及調(diào)節(jié)機制尚不清楚,誘導分化過程難于控制,誘導的細胞中胰島細胞比例較低,分泌的激素種類( 如胰高血糖素、生長抑素等) 也較多 ,而且存在致腫瘤的危險,在一些國家還存在倫理學爭論。近年來發(fā)現(xiàn)成體干細胞可以從自體切除的胰腺( 胰腺導管壁干細胞和胰島) 或肌干細胞分離出來,在一定誘導方式下向胰島細胞方向發(fā)展。它所形成的移植物是自體移植物,可以不應用免疫干預。如果能夠達到有效的誘導、分化、培養(yǎng)與提取,恰當?shù)囊浦膊课?合理的促移植物血管新生的方法,將會達到長期發(fā)揮功能,永久性脫離外源性胰島素的效果。但胰島干細胞在誘導分化同時，細胞過度增殖的潛在可能性是學界擔憂的問題[17]。

五、胰島移植免疫抑制及免疫隔離

胰島移植與其他器官如肝、腎移植的一個顯著不同點在于移植目的不同。1型糖尿病患者接受胰島移植的目的在于改善血糖控制、提高生活質(zhì)量而不是救命,因此對免疫抑制劑不良作用的耐受也比其他器官移植要差,部分患者甚至因嚴重不良反應而停用免疫抑制劑,這在其他器官移植中是非常罕見的。

應用皮質(zhì)類固醇激素是器官移植的傳統(tǒng)方法,但對胰島素具有抵抗作用,有明顯的胰島毒性,是影響胰島移植物存活和功能的重要因素之一[18]。Edmonton方案采用無糖皮質(zhì)激素、低劑量的FK506(鈣調(diào)磷酸酶抑制劑)、雷帕霉素及抗CD25單克隆抗體等取得較好的效果,雖有一定不良作用,結(jié)果顯示其不失為胰島無毒或低毒性優(yōu)化的免疫誘導與抑制方案。在新的免疫抑制方案中,最值得關注的是FTY720[19]。該藥無誘發(fā)糖尿病的不良反應,無腎毒性,并有助于胰島細胞的擴增。西羅莫司是 Edmonton方案中首次被引入的新型免疫抑制劑，可以在體內(nèi)和體外促進胰島素的分泌,并能減少細胞的凋亡[20]。但由于它也可抑制血管內(nèi)皮生長因子,故可能并不利于胰島的長期存活[21]。最近報道的CTLA4-Ig突變分子-LEA29Y是一種新型的免疫抑制劑,LEA29Y的結(jié)構(gòu)與CTLA4-Ig類似,但其與 B7-1和B7-2分子的結(jié)合活性更高。在靈長類動物的同種腎移植和胰島移植模型中的結(jié)果表明,LEA29Y免疫抑制效果較CTLA4-Ig更好，而且與常規(guī)的免疫抑制劑有協(xié)同作用。Kirk等[22]應用人源化的抗 B7分子也得到了類似的效果。為此 Shapiro等[23]認為，LEA29Y及FTY720這兩種新型免疫抑制劑將會取代目前我們所使用的免疫方案。

胰島移植的免疫隔離是利用人工裝置將胰島同受者免疫系統(tǒng)隔離，包括微囊包被、半透膜技術(shù)或?qū)⒁葝u植入腦內(nèi)、胸腺、睪丸等免疫耐受區(qū)域。

六、胰島移植的展望

近年來胰島細胞移植治療1型糖尿病的研究取得了長足的進展,它具有穩(wěn)定病情、減少外源性胰島素的用量、防止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生與進展、提高生活質(zhì)量等優(yōu)點,并有成為糖尿病最終治療方案的趨勢,但它尚有一定的局限性：①胰島細胞來源不足；②胰島細胞的分離與純化技術(shù)的復雜性；③移植后的免疫排斥反應以及隨時間而呈現(xiàn)出的移植物功能衰退；④胰島移植的成功率低；⑤成人胰島細胞移植的長期效果尚難確定。

雖然胰島移植仍存在很多困難和爭議,道路仍會很艱辛,但胰島細胞移植治療糖尿病已經(jīng)顯示了巨大的臨床價值和前景。隨著技術(shù)的進步和新型低毒乃至無毒免疫抑制方案的建立,相信胰島移植會發(fā)展成為理想的根治糖尿病的方法 ,使更多的患者受益。

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2009-02-27)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.026

266071 山東青島，青島市市立醫(yī)院 肝膽胰外科