沈 強 朱莉勤 張夢寒 姜 韜

賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲(合稱兩蟲)都是原蟲類寄生蟲，其中可感染人的主要有腸賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲。由于賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的卵囊、孢囊的表面包裹著一層較厚的囊壁，因此，在環(huán)境中具有非常強的抵抗力。常規(guī)消毒工藝的氯濃度不能有效滅活隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲，它們可通過水廠構(gòu)筑物進入供水管網(wǎng)，威脅人們健康。美國環(huán)?？偩?999年就開始對原水進行兩蟲的檢測，中國衛(wèi)生部在2006年12月29日發(fā)布的《生活飲用水衛(wèi)生標準》(GB5749—2006)中增加了賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的微生物指標。要求：＜1個/10L水，規(guī)定兩蟲的回收率需≥10％。我們采用Filta-Max Xpress快速法檢測兩蟲，現(xiàn)對結(jié)果進行分析。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器設(shè)備儀器設(shè)備有Masterflexmode 177601-10蠕動泵、Filta-Max xpress(tm)一過濾淘洗系統(tǒng)、Het-tieh Rotanta 460大容量離心機、Bead Retriever(tm)全自動微生物磁珠分選系統(tǒng)、德國Zeiss熒光顯微鏡、fiha-max xpress快速過濾模塊、BeadRetriver試管和tip頭、filta-max xpress取樣和洗脫快速連接裝置、filta-max xpress濾室。

1.1.2試劑實際有免疫磁分離試劑盒Dynabeads GC-Comb(挪威Dynal公司)、AIOOFLK.Aqua-Glo G/C熒光染色試劑盒、DAPI染色試劑。緩沖液：在容器中加入8g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄以及0.24g KH₂PO₄溶在0.9L的試劑級水中，調(diào)pH值至7.4，加0.1mL Tween 20溶液到容器中再攪拌10min，用純水定容到1.0L。

1.1.3水樣水樣來源于本地自來水公司采集的50份原水和30份出廠水。

1.2方法

1.2.1過濾和淘洗因水樣中的卵囊數(shù)量很少，因此需要濃縮較大體積的水樣，一般原水取樣20L，處理水100L。通過蠕動泵將過濾裝置(filta-max xpress快速過濾器)連接到需采樣的水源，進行過濾。每個樣品準備400mL的緩沖液，打開500mL離心管的蓋子，把它放在淘洗系統(tǒng)的離心管支架上，把分流裝置連接到濾器上，把濾器連接到壓力淘洗裝置上，確保緩沖液已經(jīng)放在緩沖池中，開始洗脫。洗脫結(jié)束將離心管蓋上蓋子從支架上取出進行下一步離心。

1.2.2離心濃縮將裝有淘洗液樣本的500mL離心管置于離心機2 000 g離心15min，慢慢地減速以免攪起沉淀物，記錄沉淀物體積。

1.2.3免疫磁珠分離樣品離心后吸出上清液，留3mL進行免疫磁珠分離。采用Bead Retriever(tm)全自動微生物磁珠分選系統(tǒng)將隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊分離出來，置于玻片上。

1.2.4染色鏡檢玻片放到42℃培養(yǎng)箱內(nèi)蒸發(fā)干，然后用甲醇固定，靜置3～5min，加入1滴A100 FLK.Aqua-Glo G/C兩蟲單克隆抗體染色劑染色和DAPI溶液染色，吸去玻片上多余染液，用PBS(pH 7.4)沖洗玻片，風干，計數(shù)并密封。用藍色濾光片(激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長510nm)檢測FITC單抗標記的卵囊，放大倍數(shù)為200～400倍；DAPI染色用紫外光濾光片(激發(fā)波長400nm，發(fā)射波長420nm)放大200～400倍觀察。

1.3計算

①水樣中包囊/卵囊數(shù)(個/10L)：Y=(X×W)/(V×Z)×10

Y—每10L水樣中包囊/卵囊的個數(shù)；X—玻片井內(nèi)計數(shù)包囊/卵囊的個數(shù)；W—水樣離心后沉淀物的體積；

V—免疫磁分離取沉淀物的體積；Z—過濾水樣的總體積。

②Filta-Max xpress快速法回收率的測定：用超純水加標的模擬水樣對淘洗離心、免疫磁分離、染色計數(shù)3個階段測定(重復4次，空白對照1次)。

賈第鞭毛蟲/隱孢子蟲回收率(％)=回收孢囊/卵囊個數(shù)×100％

2結(jié)果

2.1兩蟲檢測結(jié)果

本次共檢測原水50份，出廠水30份，其中原水中有1份檢出賈第鞭毛蟲值為2個/L。

2.2回收率

實驗各階段的加標回收率為4次平行實驗的平均值，結(jié)果見表1。

3討論

實驗結(jié)果表明，淘洗離心階段損失孢/卵囊數(shù)最多，有效提高回收率的措施為采用自動淘洗裝置，離心減速設(shè)置勿用制動器，須慢慢減速，以免攪起沉淀物，實驗操作中輕拿輕放離心管，吸出上清時的操作要熟練等。免疫磁分離階段孢/卵囊數(shù)損失約為20％左右，分析原因，與免疫反應(yīng)過程的溫度和時間的控制，免疫磁珠和卵/孢囊抗原是否充分結(jié)合及其提純程度，解離后卵/孢囊的轉(zhuǎn)移操作技術(shù)等因素有關(guān)。染色計數(shù)階段回收率的影響一是和免疫熒光染色試劑盒和DAPI染液的質(zhì)量有關(guān)，所以應(yīng)進行陽性對照和陰性對照的染色觀察，二是計數(shù)誤差，可采取多人同時計數(shù)以減少人為誤差。

生活飲用水106項指標，按照要求2012年全部開展，目前由于兩蟲檢測要求的儀器設(shè)備條件比較高，江蘇省內(nèi)疾控系統(tǒng)蘇州還是第一家采用Filta-Max xpress(r)快速法進行兩蟲檢測的單位。Filta-Max xpress(r)快速法雖然作為檢測的第3種方法，但是在淘洗階段全過程僅需2min，相對于Filta-Max法和Enviroehek HV法分析隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲，F(xiàn)ilta-Max xpress快速法將顯著提高樣品處理量，同時減少勞動量，有效提高回收率。我國現(xiàn)行的《生活飲用水標準檢驗方法》GB/T 5750—2006中規(guī)定兩蟲的回收率需≥10％，本方法的平均回收率都超過了35％，表明本實驗室的技術(shù)成熟，該方法所使用的設(shè)備功能正常，試劑有效。Fiha-Max xpress快速法可廣泛應(yīng)用于各種水質(zhì)的兩蟲檢測。