王 宇 許學(xué)斌 刁保衛(wèi) 王紅霞 陳 軍 周 玫 華哲云

摘要：[目的]1起沙門菌爆發(fā)的菌株鑒定和分子溯源研究。[方法]收集2007年上海市黃浦區(qū)1起食源性沙門菌爆發(fā)病例的菌株，使用3種不同產(chǎn)地沙門菌分型血清進(jìn)行菌株比對(duì)鑒定，測(cè)試菌株耐藥性并對(duì)部分菌株進(jìn)行多位點(diǎn)基因序列分型(MIST)。通過Pluse Net China非傷寒沙門菌數(shù)據(jù)庫(kù)聚類分析上海市與重慶市爆發(fā)菌株的脈沖凝膠電泳(PFGE)圖譜。[結(jié)果]發(fā)生在上海市黃浦區(qū)某工地爆發(fā)的1起食源性菌株，經(jīng)血清學(xué)和MIST鑒定為湯卜遜沙門菌ST 26型；菌株對(duì)6種抗生素(四環(huán)素、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、氯霉素、萘啶酸、磺胺異惡唑)的耐藥率均為100％。2007年重慶市報(bào)告多起食源性爆發(fā)案例中的C群沙門菌，經(jīng)鑒定亦為湯卜遜沙門菌ST 26型，與上海市的菌株間存在高度遺傳同源性。[結(jié)論]蘭州生物制品研究所和泰國(guó)S&A的沙門菌分型血清的H因子“c”和“k”間存在交叉凝集。2007年上海市黃浦區(qū)發(fā)生的食源性爆發(fā)病例可能為輸入性湯卜遜沙門菌ST26型的多重耐藥克隆株引起。

關(guān)鍵詞：C群沙門菌；鑒別診斷；交叉凝集；分子分型；爆發(fā)；多重耐藥

中圖分類號(hào)：R516.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

上海市黃浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心作為上海市4個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)之一，于2007年加入全球沙門菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)(GSS)，現(xiàn)更名為全球食源性感染性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)(GFN)。實(shí)驗(yàn)室按照方案要求配置泰國(guó)產(chǎn)沙門菌分型血清對(duì)監(jiān)測(cè)點(diǎn)醫(yī)院定期送檢的沙門菌腹瀉病例菌株進(jìn)行血清學(xué)復(fù)核。2007年10月，黃浦區(qū)中心醫(yī)院連續(xù)報(bào)告5例以上疑為同一血清型的沙門菌腹瀉病例，實(shí)驗(yàn)室初步鑒定為豬霍亂沙門菌，高度懷疑為聚集性病例，黃浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心現(xiàn)場(chǎng)人員隨即對(duì)病例進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。爆發(fā)菌株經(jīng)我們使用泰國(guó)產(chǎn)沙門菌分型血清和丹麥SSI分型血清對(duì)菌株作分型比對(duì)、耐藥分析和脈沖凝膠電泳(PFGE)等表型與分子型的綜合分析后，最終確定引發(fā)此次食源性爆發(fā)的病原菌是湯卜遜沙門菌。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株2007年上海市GSS監(jiān)測(cè)的18株湯卜遜沙門菌(包括黃浦區(qū)中心醫(yī)院分離的8株湯卜遜沙門菌爆發(fā)菌株和1株分離自市售豬肚的湯卜遜沙門菌)；大腸埃希菌ATCC25922為藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株；布倫登盧普沙門菌H9812作為PFGE的分子量標(biāo)準(zhǔn)菌株；國(guó)內(nèi)參考株丙型副傷寒沙門菌(CNCC50017-156)、豬霍亂沙門菌(CNCC50018-5)、豬霍亂孔成道夫變種沙門菌(CNCC50732)均來自上海市疾病預(yù)防控制中心菌種保藏室。

1.1.2培養(yǎng)基亞硒酸鹽煌綠增菌液(SBG)、羅伯特增菌液(RVS)、木糖賴氨酸膽酸鹽瓊脂平板(XLD)、CHROMagar(tm)沙門菌顯色瓊脂平板(CAS)、水解酪蛋白瓊脂平版(M-H)、H相誘導(dǎo)軟瓊脂平板來自上?？片敿慰萍加邢薰荆荒c道雙支糖綜合鑒別管和其他輔助生化鑒定試劑由本中心供應(yīng)室配置。以上增菌液和平板均避光10℃以下保存，在有效期內(nèi)使用。

1.1.3試劑和儀器血清有沙門菌分型診斷血清50種(蘭州生物制品研究所)、沙門菌分型診斷血清79種(S&A，Ltd，泰國(guó))、沙門菌分型血清118種(SSI，丹麥)；抗生素紙片包括四環(huán)素(TET)、頭孢噻呋(EFT)、阿莫西林/克拉維酸(AMC)、氨芐西林(AMP)、復(fù)方磺胺甲嗯唑(SXT)、環(huán)丙沙星(CIP)、氯霉素(C)、氧氟沙星(OFX)、萘啶酸(NA)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、慶大霉素(CN)、鏈霉素(S)、磺胺異惡唑(s3)、甲氧芐氨嘧啶(W)(Oxoid，英國(guó))16種；另有藥敏分配器，VitekAM-60自動(dòng)生化鑒定儀(生物梅里埃，法國(guó))和菌液比濁儀(西門子，德國(guó))；限制性內(nèi)切酶Xba I(TaKaRa，日本)；SeaKem Gold瓊脂糖(Cambraex Bio Rockland，美國(guó))；脈沖凝膠電泳儀CHEF mapper system和凝膠成像系統(tǒng)GEL Doc 2000(Bio-Rad，美國(guó))。血清和抗生素紙片均在有效期內(nèi)使用。

1.2方法

1.2.1GSS監(jiān)測(cè)爆發(fā)病例調(diào)查按照《上海市沙門菌病監(jiān)測(cè)方案2007年》中的定義和流行病學(xué)調(diào)查程序進(jìn)行。

1.2.2菌株鑒定8株爆發(fā)菌株由臨床實(shí)驗(yàn)室使用蘭州生物所的沙門菌分型血清作初步鑒定后，送轄區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室使用泰國(guó)S&A沙門菌分型血清復(fù)核鑒定，結(jié)果存疑者由市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室用丹麥SSI沙門菌分型血清確認(rèn)。玻片凝集屬于直接抗原抗體反應(yīng)的定性試驗(yàn)，根據(jù)抗原抗體產(chǎn)生凝集顆粒的程度進(jìn)行分級(jí)。+：菌體抗原凝集顆粒細(xì)，背景渾濁不清；++：菌體抗原凝集顆粒較粗實(shí)，背景渾濁；+++：反應(yīng)過程快，菌體抗原凝集顆粒細(xì)而均勻，背景較清；#：反應(yīng)過程快，菌體抗原凝集顆粒粗實(shí)，背景清亮。

1.2.3抗生素敏感性試驗(yàn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI，2007年版)的操作規(guī)程采用改良K-B法，根據(jù)抑菌圈直徑判斷敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)。頭孢噻呋(EFT)K-B法的判斷結(jié)果為19≤20～23 1≥24mm(由Oxoid公司提供參考值)。

1.2.4多位點(diǎn)基因序列分析MIST分型(ST型)挑選5株湯卜遜沙門菌，在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家腸道病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定沙門菌基因組上的7個(gè)管家基因(thrA、purE、sucA、hisD、aroC、hemD、dnaN)的部分片段，完成多位點(diǎn)測(cè)序后輸入數(shù)據(jù)庫(kù)分型。

1.2.5PFGE和數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)GSS監(jiān)測(cè)方案要求，將上海市2007年分離的18株湯卜遜沙門菌，在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室按照Pulse Net規(guī)定的PFGE標(biāo)準(zhǔn)方法，獲得脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜，使用Bio Numerics(Version 4.0)軟件進(jìn)行聚類分析，并通過國(guó)家傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室非傷寒沙門菌圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(Pluse Net China)比對(duì)上海市湯卜遜爆發(fā)菌株與重慶市C群沙門菌爆發(fā)菌株的分子圖譜。

2結(jié)果

2.1菌株來源

黃浦區(qū)中心醫(yī)院2007年10月報(bào)告同一菌型沙門菌腹瀉病人均來自黃浦區(qū)制造局路193號(hào)南聯(lián)工地。該工地共有建筑工人百余人，均為浙江紹興來滬務(wù)工人員，飲水為自來水，住宿為簡(jiǎn)屋房，共有2層，約300m²，12人/間。旁邊為白搭廚房以及用餐點(diǎn)。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查核實(shí)，2007年10月4日—13日共發(fā)現(xiàn)11人腹瀉，男性6名，女性5名?；颊甙l(fā)病時(shí)間為5日2人，9日3人，11日1人，13日3人。臨床癥狀表現(xiàn)均有腹瀉癥狀，稀便；發(fā)熱4人，嘔吐5人。發(fā)病后主動(dòng)就診，其中8人分離出沙門菌(經(jīng)最終確認(rèn)為湯卜遜沙門菌)。發(fā)病者有明顯的

可疑食物及共同進(jìn)餐史。調(diào)查中未能獲取可疑污染食品，現(xiàn)場(chǎng)經(jīng)環(huán)境消毒等措施處置后，未見后續(xù)病例。

2.2菌株確認(rèn)

黃浦區(qū)中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室分離的8株爆發(fā)菌株經(jīng)蘭州生物制品研究所的沙門菌分型血清初步鑒定為豬霍亂沙門菌，后經(jīng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心使用泰國(guó)S&A血清復(fù)核后發(fā)現(xiàn)存在H相位的“c”和“k”，因子間的交叉凝集現(xiàn)象，多數(shù)菌株可以根據(jù)交叉凝集結(jié)果的強(qiáng)弱初步判斷為湯卜遜沙門菌。用丹麥SSI血清比對(duì)8株爆發(fā)菌株均與“k”因子呈特異性凝集而“c”因子不凝集，最終確認(rèn)為湯卜遜沙門菌。

2.3國(guó)內(nèi)參考株的血清學(xué)比對(duì)和ST分型

國(guó)內(nèi)參考株丙型副傷寒沙門菌(CNCC 50017-156)的ST型為146，目前在沙門菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中，該ST型菌株均為丙型副傷寒沙門菌；國(guó)內(nèi)參考株豬霍亂沙門菌(CNCC50018-5)為ST 139，數(shù)據(jù)庫(kù)中該型也均為豬霍亂沙門菌；國(guó)內(nèi)參考株豬霍亂孔成道夫變種沙門菌(CNCC 50732)的sT型為145，數(shù)據(jù)庫(kù)顯示該sT型菌株為豬霍亂孔成道夫變種沙門菌或豬霍亂沙門菌；5株爆發(fā)菌株ST型均為26，MLST數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，該型菌株均為湯卜遜沙門菌。MLST結(jié)果與丹麥SSI血清分型結(jié)果完全一致(表1)。

2.4菌株耐藥性

8株爆發(fā)株對(duì)14種抗生素的耐藥譜完全一致，其中對(duì)四環(huán)素、阿莫西彬克拉維酸、氨芐西林、氯霉素、萘啶酸均100％耐藥。

2.5PFGE分型

上海市的18株湯卜遜沙門菌經(jīng)Xba I酶切的電泳圖譜完全一致，屬于同一遺傳克隆。通過中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家非傷寒沙門菌圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(Pluse Net China)，聚類分析上海湯卜遜爆發(fā)菌株與重慶市C群沙門菌菌株的圖譜，兩地菌株的圖譜均符合爆發(fā)菌株的典型特征，重慶的爆發(fā)菌株間有90％的遺傳同源性，與上海爆發(fā)菌株間有85％的遺傳同源性；上海1株湯卜遜食源菌株與爆發(fā)菌株存在70％的遺傳同源性，1株散發(fā)病例菌株與重慶爆發(fā)菌株間有95％的遺傳同源性(圖1)。

3討論

由于8株湯卜遜沙門菌爆發(fā)菌株的最后確診，使湯卜遜沙門菌列上海市2007年非傷寒沙門菌l臨床腹瀉病例的第3位。分析診斷初始被誤報(bào)為豬霍亂沙門菌的原因：①僅有1個(gè)H因子的差異，由于國(guó)產(chǎn)分型血清“k”與“c”因子間存在的交叉凝集，且“c”因子一旦“先入為主”后，很容易產(chǎn)生豬霍亂沙門菌的結(jié)論。②技術(shù)人員缺少對(duì)沙門菌主要菌型致病理論的認(rèn)知是產(chǎn)生錯(cuò)誤的次要因素，除傷寒沙門菌外，甲型副傷寒和豬霍亂沙門菌也屬臨床常見的侵襲性(菌血癥)沙門菌，血培養(yǎng)多見，腸道罕見。由3種沙門菌分型血清的現(xiàn)場(chǎng)比對(duì)說明，沙門菌分型血清的優(yōu)劣是除操作者自身使用技能以外的另一個(gè)對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性有重要影響的客觀因素之一。類似的混淆問題發(fā)生在早些時(shí)候(2007年7—9月，重慶市)報(bào)告數(shù)起丙型副傷寒沙門菌引起食源性爆發(fā)的診斷中。當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心的結(jié)論因未檢測(cè)到相應(yīng)Vi基因而被中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室否定，后經(jīng)泰國(guó)S&A、丹麥SSI血清和MLST鑒定亦為湯卜遜沙門菌ST26型。

C群沙門菌中有多個(gè)血清型因抗原式相同導(dǎo)致難以鑒別，本次研究發(fā)現(xiàn)的確存在豬霍亂與湯卜遜沙門菌、丙型副傷寒與湯卜遜沙門菌之間的多重混淆。對(duì)此，技術(shù)人員除依賴高質(zhì)量的診斷血清及科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊蜃予b定流程外，還要輔以某些特殊生化反應(yīng)。丙型副傷寒沙門菌Vi抗原有不穩(wěn)定性，即Vi為陰性也無法排除丙型副傷寒沙門菌，必須對(duì)Vi進(jìn)行多次誘導(dǎo)后方可排除丙型副傷寒沙門菌，有條件者可用PCR方法檢測(cè)Vi基因，這樣就不會(huì)將豬霍亂沙門菌(包括豬霍亂孔成道夫變種和得揆忒變種)誤判成丙型副傷寒沙門菌。其次單純的血清分型無法鑒別豬霍亂、豬霍亂孔成道夫變種以及豬霍亂得揆忒變種3種沙門菌血清型，簡(jiǎn)易生化試驗(yàn)?zāi)軌蜩b別(見表2)，前提是因子的鑒定須正確。類似的情況也存在乙型副傷寒與爪哇沙門菌的鑒定中。兩者抗原式完全相同，僅靠酒石酸鹽反應(yīng)即可甄別：爪哇沙門菌陽性而乙型副傷寒沙門菌為陰性。但最終報(bào)告在法定傳染病疫情管理中的意義卻顯著不同，乙型副傷寒沙門菌可引起類傷寒樣癥狀，屬國(guó)家乙類報(bào)告和管理傳染病，而爪哇沙門菌導(dǎo)致的腸炎屬丙類報(bào)告?zhèn)魅静　Ｓ纱吮砻?，正確的血清型鑒定結(jié)果能體現(xiàn)腸道傳染病早期防控的科學(xué)價(jià)值。

基于基因組差異的分子分型技術(shù)已得到越來越多的應(yīng)用。在本研究中，我們利用Pluse Net China數(shù)據(jù)庫(kù)將上海爆發(fā)菌株與重慶的“丙型副傷寒”沙門菌爆發(fā)菌株的圖譜進(jìn)行聚類對(duì)比，并使用多位點(diǎn)基因序列分型(MIST)，最終確認(rèn)不同時(shí)間、不同空間的病例菌株同屬湯卜遜沙門菌克隆株。因存在高度遺傳同源性，使我們有理由懷疑該ST 26型克隆株存在外源性輸入的流行病學(xué)特征。

早期國(guó)外開展的沙門菌監(jiān)測(cè)不太強(qiáng)調(diào)臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)沙門菌的分型能力，而GSS項(xiàng)目開始轉(zhuǎn)變這種依靠公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室診斷沙門菌的模式。開始逐步推廣到哨點(diǎn)的臨床實(shí)驗(yàn)室。這種循序漸進(jìn)的方式值得國(guó)內(nèi)即將建立的沙門菌監(jiān)測(cè)體系借鑒，更為重要的是，此能力建設(shè)需要得到臨床實(shí)驗(yàn)室在技術(shù)與管理體系上的重視并加大投入。因此，我們建議臨床實(shí)驗(yàn)室與轄區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室之間合理互補(bǔ)、優(yōu)化配置沙門菌的分型血清，共享血清鑒定程序，避免誤判現(xiàn)象。

1999年3月6—31日，美國(guó)加洲曾發(fā)生因食用被污染的鮮香菜造成76人湯卜遜沙門菌感染發(fā)病(其中35人的流調(diào)特征屬散發(fā)病例)；2000年8月，美國(guó)加洲南部出現(xiàn)持續(xù)增多的湯卜遜沙門菌腹瀉病例，最后確認(rèn)源于1名隱性感染的食品從業(yè)人員不斷加工生產(chǎn)的“帶菌”面包。以上信息充分說明正確的沙門菌血清分型是沙門菌感染流行病學(xué)分析、分子分型的先決條件，我國(guó)已開始較大范圍的沙門菌監(jiān)測(cè)，必將發(fā)現(xiàn)更多公共衛(wèi)生新問題，所以要求實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格診斷血清的質(zhì)量控制和鑒定程序，準(zhǔn)確的分型結(jié)果可促進(jìn)對(duì)沙門菌病的溯源調(diào)查和科學(xué)防控。