陳紹興 李 沁 董 艷 楊權芬 陳 婭 錢麗芳

摘要:以質粒pBR322為對象,在經典的質粒提取方法的基礎上進行了一些改進,將酚氯仿異戊醇抽提和氯仿異戊醇抽提省去。比較了簡便方法和經典方法提取質粒的效果,結果顯示:兩種方法均能夠提取出質粒DNA,RNA的量并沒有比經典方法提出來的多;簡便方法抽取的質粒,蛋白含量稍稍多于后者;簡便方法節(jié)省了大約一半的提取時間及大量的藥品,并且減少了有害的化學物質對人體的危害,是一種經濟實用的方法,完全可以滿足一般實驗需要。

關鍵詞:質粒DNA;提取;方法;pBR322

中圖分類號:Q78文獻標識碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.002

An Improvement Method on Plasmid Extraction

CHEN Shao-xing,LI Qin,DONG Yan,YANG Quan-fen, CHEN Ya, QIAN Li-fang

(Life Science and Technology College, Honghe University, Mengzi, Yunnan 661100, China)

Abstract:Plasmid pBR322 was used in this study and some improvement wew made based on the classical extraction method.The step of extracting by phenol chloroform isoamyl alcohol and chloroform isoamyl alcohol was omitted. Comparing the result of this two extraction method, it can find that the two methods both can get plasmid DNA and the quantity of RNA was no more than it by using the classical way. After omitting the two extraction method, the amount of protein is a little more than classical method. On one hand it will save about a half time, on the other hand it also can save plenty of physic. It will decrease the harm to human. This is an economical and convenient method and it can absolutely match the need of general experiment.

Key words: plasmid DNA; extraction; method; pBR322

質粒的提取作為分子生物學領域的一項基本操作技術,幾乎每天都要用到。盡管現(xiàn)在質粒提取的試劑盒有很多,但是對于普通的實驗室,特別是科研經費不夠充分的實驗室,并不能實現(xiàn)每次都用試劑盒來提取質粒。所以,采用的還都是薩姆布魯克[1]所提出的經典提取方法。本研究是在經典的質粒提取方法的基礎上進行了一些改進,既節(jié)省了一大半時間,還節(jié)省了耗材和藥品,另外,減少了對酚和氯仿等有害化學物質的使用。

1材料和方法

1.1菌種和質粒

大腸桿菌DH5α菌株和質粒pBR322均由武漢大學謝志雄教授饋贈。

1.2質粒提取方法

先將含有質粒pBR322的大腸桿菌DH5α菌株接種到含氨芐青霉素(Amp)濃度為50 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)過夜。經典的質粒提取方法參照文獻[1]進行,簡便方法是在經典方法基礎上,省去酚氯仿異戊醇抽提和氯仿異戊醇抽提兩個步驟。

1.2酶切檢測

將兩種方法所提取的質粒DNA用同樣的限制性內切酶EcoRⅠ進行酶切[2],取3 μL進行電泳檢測,比較兩種方法提取的質粒大小是否一致。

2結果與分析

2.1質粒提取

質粒提取作為實驗室的一項常規(guī)操作,經常占用很多的時間,在經典方法的基礎上,將酚氯仿異戊醇抽提和氯仿異戊醇抽提這兩步省去,大量地節(jié)省了時間,并且質粒pBR322的提取效果也符合實驗要求,如圖1所示,經典方法所提的質粒DNA中含有的RNA較簡便方法的方法多;再比較質粒中蛋白質含量,經典方法的上樣孔無亮帶,表明質粒不含蛋白質,而B的上樣孔出現(xiàn)亮帶,說明有蛋白質存在。分析原因,由于經典的質粒提取方法多出了兩步有機溶解的抽提,幾乎所有的蛋白質被抽提干凈,而簡便的方法由于省去抽提蛋白的過程,導致了最后的質粒中還含有微量的蛋白。

2.2酶切檢測

將圖1中的A前兩管和B的前兩管pBR322質粒用EcoRⅠ酶切,結果如圖2所示,不管是經典方法提取的質粒還是簡便方法提取的質粒,用EcoRⅠ酶切后,其大小均在4.3 kb左右,這與線性的pBR322質粒大小(4.36 kb)相符。所以,將經典方法中的兩步抽提蛋白質的步驟省略,不但不影響質粒的提取,而且同樣都可以被限制性內切酶所切開,可以用于分子生物學后續(xù)的酶切、連接和轉化等操作。

3討論

本研究通過對經典質粒提取方法的改進,將其中的兩步蛋白質抽提操作省去,從所得的試驗結果看,省去蛋白質抽提這兩步后,并沒有影響質粒提取的效果;此外,兩種方法所提取的pBR322質粒均能夠被EcoRⅠ所切開,證明兩種方法所提取的質粒在本質上沒有區(qū)別,都可以用于后續(xù)的酶切、連接和轉化等分子生物操作。通過對兩種方法的比較,很顯然簡便方法具備了很多的優(yōu)點:其一,大大節(jié)省了質粒DNA提取的時間;其二,大大節(jié)省了大量耗材;其三,減少實驗過程中有毒物質的接觸。綜上所述,簡便的質粒提取方法具有很強的實用性。

參考文獻:

[1] J 薩姆布魯克, D W 拉塞爾. 分子克隆實驗指南[M].黃培堂,譯.北京:科學出版社, 2005.

[2] F M 奧斯伯(美).精編分子生物學實驗指南(第五版)[M].北京:科學出版社, 2008.