樊黎麗， 孟 泳， 趙潤楊， 王艷梅， 唐引引

[河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)，河南 鄭州 450000]

肺癌是我國發(fā)病率和致死率第一位的惡性腫瘤，肺癌的治療手段有免疫、手術(shù)及化療等[1]。研究表明，傳統(tǒng)中藥及其成分在肺癌的治療中具有較大優(yōu)勢，可提高肺癌療效[2-3]。肉蓯蓉是我國名貴藥材，其主要成分包括苯乙醇總苷、多糖、環(huán)烯醚萜類、生物堿和木脂素類等。研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉苯乙醇總苷能降低肝癌H22荷瘤小鼠肝臟損傷，并對其腫瘤生長有抑制作用[4]。肉蓯蓉活性成分麥角甾苷能夠抑制裸鼠移植瘤模型腫瘤生長及大腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。肉蓯蓉多糖可能通過增加自然殺傷細(xì)胞和白細(xì)胞介素2(IL-2)的活性抑制Lewis肺癌和S180肉瘤細(xì)胞[6]。然而，肉蓯蓉多糖在肺癌中的潛在功能、生物發(fā)生過程和潛在機(jī)制仍不清楚。研究表明，lncRNA在肺癌中常失調(diào)表達(dá)，并且在肺癌的發(fā)生、發(fā)展和治療中具有重要作用[7]。LINC01410在宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，影響子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后[8]；LINC01410過表達(dá)通過抑制miR-532-5p促進(jìn)胃癌血管生成和轉(zhuǎn)移[9]；抑制LINC01410表達(dá)可抑制膽管癌細(xì)胞和乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[10-11]，而LINC01410在肺癌中的作用尚不明確。本實驗旨在研究肉蓯蓉多糖及LINC01410對肺癌細(xì)胞惡性表型的影響，以及LINC01410是否參與肉蓯蓉多糖對肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控，以期為肉蓯蓉多糖的深入研究提供依據(jù)。

1 材料

肺癌細(xì)胞A549購自美國菌種保藏中心(ATCC)。肉蓯蓉多糖(純度≥98%，貨號D3281)購自上海寶曼生物科技有限公司。胎牛血清購自廣州碩恒生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自杭州仟諾生物科技有限公司；MTT試劑盒購自上海美軒生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；凋亡試劑盒購自德國PromoCell公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自上海善然生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 A549細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別用質(zhì)量濃度為100、200、400 ng/mL的肉蓯蓉多糖處理對數(shù)生長期細(xì)胞，記為肉蓯蓉多糖100、200、400 ng/mL組；未用肉蓯蓉多糖處理的A549細(xì)胞為對照組。A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-NC或si-LINC0141，記為si-NC組、si-LINC01410組；si-NC、si-LINC01410轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后用400 ng/mL肉蓯蓉多糖處理，記為肉蓯蓉多糖400 ng/mL+pcDNA組、肉蓯蓉多糖400 ng/mL+pcDNA-LINC01410組。

2.2 MTT法檢測A549細(xì)胞增殖率 將A549細(xì)胞分別用質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250、300、350、400 ng/mL的肉蓯蓉多糖處理。收集各組A549細(xì)胞置于96孔板，每孔加入MTT 20 μL，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，于490 nm波長處檢測各組細(xì)胞光密度(OD)值，計算細(xì)胞增殖率。

2.3 克隆形成實驗檢測A549細(xì)胞克隆能力 收集各組A549細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105/mL，每孔100 μL接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)直至出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆團(tuán)，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄菌落數(shù)(>50個細(xì)胞)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡率 收集各組A549細(xì)胞重懸于100 μL磷酸鹽緩沖鹽水緩沖液(1×106/mL)，試管中加入1 mL細(xì)胞懸液和10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，避光孵育30 min，收集細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

2.5 Transwell法檢測A549細(xì)胞遷移及侵襲能力 將各組A549細(xì)胞懸液(2×104/200 μL，無血清培養(yǎng)基)均勻鋪于Transwell小室上室，將含有10% FBS的500 μL RPMI-1640培養(yǎng)基加入小室下室，37 ℃培養(yǎng)24 h，擦除上室殘留細(xì)胞，下室細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞，隨機(jī)選擇5個視野計數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗，將Matrigel預(yù)涂在Transwell小室上室，其余步驟同遷移實驗。

2.6 RT-qPCR法檢測A549細(xì)胞中LINC01410 mRNA表達(dá) 采用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。反應(yīng)體系為2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μL SYBR Green Mix、正反向引物各0.5 μL、7 μL無菌水。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算LINC01410 mRNA相對表達(dá)。引物序列為LINC01410正向5′-GT GACAAGAATGGCCCAAGC-3′，反向5′-ACTGTGCACC TGTTACACCA-3′；內(nèi)參GAPDH正向5′-TGTTGCCATC AATCACCCCTT-3′，反向5′-CTCCACGACGTACTC AGCG-3′。

3 結(jié)果

3.1 肉蓯蓉多糖對A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與對照組比較，肉蓯蓉多糖各劑量組A549細(xì)胞增殖率升高(P<0.05)，IC50為319.8 ng/mL，見表1。與對照組比較，肉蓯蓉多糖100、200、400 ng/mL組A549細(xì)胞增殖率降低(P<0.05)，克隆形成數(shù)減少(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖1、表2。

表2 肉蓯蓉多糖對A549細(xì)胞增殖率、克隆形成及凋亡率的影響

表1 肉蓯蓉多糖對A549細(xì)胞增殖率的影響

3.2 肉蓯蓉多糖對A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 與對照組比較，肉蓯蓉多糖各劑量組A549細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)均減少(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖2、表3。

表3 肉蓯蓉多糖對A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

3.3 肉蓯蓉多糖對A549細(xì)胞中LINC01410 mRNA表達(dá)的影響 與對照組比較，肉蓯蓉多糖各劑量組A549細(xì)胞中LINC01410 mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見表4。

表4 肉蓯蓉多糖對A549細(xì)胞中LINC01410 mRNA表達(dá)的影響

3.4 抑制LINC01410表達(dá)對A549細(xì)胞增殖凋亡的影響 與si-NC組比較，si-LINC01410組A549細(xì)胞增殖率降低(P<0.05)，克隆形成數(shù)減少(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，見圖3、表5。

表5 抑制LINC01410表達(dá)對A549細(xì)胞增殖率、克隆形成及凋亡率的影響

3.5 抑制LINC01410表達(dá)對A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 與si-NC組比較，si-LINC01410組A549細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，見圖4、表6。

表6 抑制LINC01410表達(dá)對A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

3.6 過表達(dá)LINC01410與肉蓯蓉多糖對A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與肉蓯蓉多糖400 ng/mL+pcDNA組比較，肉蓯蓉多糖400 ng/mL+pcDNA-LINC01410組A549細(xì)胞增殖率升高(P<0.05)，克隆形成數(shù)增加(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，見圖5、表7。

表7 過表達(dá)LINC01410與肉蓯蓉多糖對A549細(xì)胞增殖率、克隆形成及凋亡的影響

3.7 過表達(dá)LINC01410與肉蓯蓉多糖對A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 與肉蓯蓉多糖400 ng/mL+pcDNA組比較，肉蓯蓉多糖400 ng/mL+pcDNA-LINC01410組A549細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)，見圖6、表8。

表8 過表達(dá)LINC01410與肉蓯蓉多糖對A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

4 討論

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，提高患者生存期和生活質(zhì)量已成為肺癌臨床研究重點。中醫(yī)藥在治療中晚期肺癌上取得一定的成果[12]。研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等活性，且對人體毒副作用較小，是潛在的新型抗腫瘤藥物資源[13]。玉竹多糖可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路表達(dá)，抑制細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，從而阻止肺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]；苦參多糖能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[15]；苦蕎茶多糖能夠促進(jìn)活性氧生成、降低線粒體膜電位，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞A549增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。肉蓯蓉多糖是肉蓯蓉的主要活性成分，可用于腸道炎癥性增生和乙醇引起的肝損傷，具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤等作用，可以用作抗炎、抗疲勞、和抗腫瘤試劑[17-18]。然而，肉蓯蓉多糖在肺癌中的作用尚不清楚。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉多糖可以抑制肺癌細(xì)胞A549增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性，表明肉蓯蓉多糖可能通過抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移來阻礙肺癌的發(fā)展。

lncRNAs是長度大于200個核苷酸的非編碼 RNA，雖然lncRNAs不能被翻譯成蛋白質(zhì)，但其參與多種生理活動，包括染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活和干擾以及細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和凋亡[19-20]。研究表明，lncRNAs在癌癥中差異表達(dá)，且異常表達(dá)的lncRNAs與癌癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)[21-23]。重要的是，lncRNAs與肺癌發(fā)展密切相關(guān)，參與癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，LINC01410在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，與患者預(yù)后不良有關(guān)；LINC01410表達(dá)降低可以抑制HT-29、SW620細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并抑制細(xì)胞周期[26]。LINC01410表達(dá)在宮頸癌組織和細(xì)胞系中的升高與不良預(yù)后相關(guān)；LINC01410沉默可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[27]。胰腺癌組織和細(xì)胞中LINC01410表達(dá)升高，降低癌細(xì)胞中LINC01410表達(dá)可破壞細(xì)胞的遷移和生長[28]。本實驗發(fā)現(xiàn)，降低LINC01410表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉多糖處理的肺癌細(xì)胞A549中LINC01410表達(dá)降低；而過表達(dá)LINC01410可逆轉(zhuǎn)肉蓯蓉肉多糖對A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。

綜上所述，肉蓯蓉多糖可能通過下調(diào)LINC01410表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞增殖、克隆形成及遷移侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。