摘要：干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育最主要的逆境因子。干旱脅迫下，植物體內(nèi)的內(nèi)源激素發(fā)生變化，其中ABA在植物抵御干旱脅迫反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)功能。系統(tǒng)闡述了ABA在干旱脅迫下的最新研究現(xiàn)狀和幾類(lèi)干旱脅迫下的代謝產(chǎn)物及其相關(guān)基因的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：干旱脅迫；ABA代謝；調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q943.2；Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439—8114(2009)06—1504—06秋水仙素誘導(dǎo)觀賞植物多倍體研究進(jìn)展

宋 平 王學(xué)鳳 蔡 明 任翔翔 潘會(huì)堂 張啟翔

摘要：綜述了秋水仙素在觀賞植物多倍體育種上的應(yīng)用概況，探討了多倍體誘導(dǎo)效果的影響因素，總結(jié)了多倍體的鑒定方法。

關(guān)鍵詞：秋水仙素，多倍體，觀賞植物

中圖分類(lèi)號(hào)：S68；S349⁺.51

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439—8114(2009)06—1510—04

多倍體指具有3套或3套以上完整染色體組的生物個(gè)體。由于染色體數(shù)目加倍，個(gè)體外形往往具有巨大性，并且有適應(yīng)不利自然條件的能力，在生物進(jìn)化與育種上有重要意義。多倍體往往具有植株粗壯、葉大、花器官增大、花色更嬌艷、耐貯藏運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，增加了花卉的觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。

多倍體植株具有許多優(yōu)良的特性，而自然界產(chǎn)生多倍體的過(guò)程相當(dāng)漫長(zhǎng)，因此人們常用人工誘導(dǎo)的方法獲得多倍體植株，分為物理方法和化學(xué)方法，物理方法效率太低，不能被廣泛利用，因而在多倍體的誘導(dǎo)研究中通常是用化學(xué)方法。誘導(dǎo)多倍體的化學(xué)藥劑很多，主要有秋水仙素、水合三氯乙醛、笑氣、富民隆等。被廣泛采用且最有效的藥劑是秋水仙素，因?yàn)榍锼伤氐淖饔弥痪窒抻谧璧K處于細(xì)胞分裂中期的紡錘絲的形成，而對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)并無(wú)顯著影響，在遺傳上很少發(fā)生其他不利的變異。

1 誘導(dǎo)方法

1.1 整體植株誘導(dǎo)

常用的方法有處理種子、胚根和生長(zhǎng)點(diǎn)。

1.1.1 處理種子 用秋水仙素溶液直接浸泡種子，此方法簡(jiǎn)便易行，但加倍功效較低，且容易產(chǎn)生嵌合體。用秋水仙素溶液處理金魚(yú)草種子，鏡檢發(fā)現(xiàn)變異植株的染色體多為嵌合體：用秋水仙素處理虞美人種子，產(chǎn)生多種變異類(lèi)型，有四倍體、八倍體及嵌合體：用秋水仙素處理新疆雪蓮種子，變異植株全部為嵌合體，生長(zhǎng)后期，絕大部分嵌合體由于根部畸形，無(wú)法吸收營(yíng)養(yǎng)，最終死亡，存活下來(lái)的少量嵌合體幼苗在不同程度上發(fā)生了回復(fù)突變。

1.1.2 處理胚根 種子萌發(fā)后，用秋水仙素溶液浸泡種子胚根，該方法對(duì)材料有一定的傷害，不同植物種類(lèi)對(duì)秋水仙素的敏感度不同。應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意濃度和處理時(shí)間的選擇。用秋水仙素處理發(fā)芽1～2cm的枸杞種子，50％的植株具變異性狀，但大部分生長(zhǎng)緩慢，最后死亡，四倍體只占6.7％。

1.1.3 處理生長(zhǎng)點(diǎn) 常用脫脂棉包裹幼芽，每日滴秋水仙素溶液，連續(xù)處理或間歇處理數(shù)日?；?qū)⑸L(zhǎng)點(diǎn)浸泡在秋水仙素溶液中。與處理種子、胚根相比，處理更加直接，同時(shí)對(duì)材料的傷害較輕，誘變效果較好，以用濃度為0.5％的秋水仙素處理枸杞小苗的生長(zhǎng)點(diǎn)，連續(xù)處理72h或間歇處理36h，誘變率達(dá)27％，成苗的四倍體占13％和20％，與處理胚根法相比誘變效果顯著。將荷花種子破殼催芽，待第二葉開(kāi)始長(zhǎng)出后選擇長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)正常的種苗，用脫脂棉包裹幼芽，每天滴0.05％秋水仙素溶液3～4次，處理96h，加倍效果不理想；但將荷花種子及芽全部浸泡在0.05％秋水仙素溶液中48h和72h，均獲得了良好的加倍效果。

此外，將秋水仙素直接注射到郁金香花苞中下部的子房位置，也獲得了多倍體。

1.2 離體誘導(dǎo)

在無(wú)菌條件下用經(jīng)過(guò)濾滅菌的秋水仙素溶液浸泡離體植物組織，處理結(jié)束后用無(wú)菌水漂洗數(shù)次轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或?qū)⑼怆x體植物組織接種到添加了秋水仙索的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，一段時(shí)間后，再轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的培養(yǎng)基中，使其分化成苗。離體的植物組織包括小苗、莖段、叢生芽、愈傷組織、葉片等任何可分化成苗的器官及組織。

1.2.1 浸泡法 浸泡處理是秋水仙素對(duì)外植體作用最為直接的一種，材料的生長(zhǎng)和分化在不同程度上受到抑制，甚至部分死亡。篩選適宜的處理濃度、時(shí)間組合是多倍體誘導(dǎo)的關(guān)鍵。以0.2％秋水仙素溶液處理番木瓜無(wú)菌苗72h效果好，誘導(dǎo)率最高達(dá)36.7％。將香石竹帶芽莖段浸泡在0.05％的秋水仙素溶液中50h，變異率達(dá)21.0％。用0.2％秋水仙素溶液浸泡花葉綠蘿叢生芽24h，誘變率達(dá)14.0％。將彩色馬蹄蓮的愈傷組織在0.05％秋水仙素溶液中浸泡24h，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率最高達(dá)52.0％。葉片也可作為多倍體的誘導(dǎo)材料，取鄂柿的無(wú)菌葉片，沿中脈橫切成3～4塊，隨即放至0.5％的秋水仙素溶液中，在黑暗條件下振蕩處理96h，隨即轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)獲得十二倍體再生植株。

1.2.2 秋水仙素加入培養(yǎng) 基用秋水仙素液體浸泡處理對(duì)外植體的傷害較直接，多次沖洗增加了外植體受污染的機(jī)會(huì)，秋水仙素加入培養(yǎng)基法避免了外植體的直接傷害，沖洗次數(shù)降低，也降低了受污染的幾率，所以日益受到科學(xué)工作者的青睞。

將大巖桐葉片接種到20mg·L^-1秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周。誘變率達(dá)62.5％，誘變效果優(yōu)于浸泡處理。將紅千層莖段接入含0.2％秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d和20d誘變效果最佳，達(dá)100％。用含有0.05％秋水仙素的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)紅果冬青的叢生芽48h，變異率最高。達(dá)40.0％。

2 影響因素

秋水仙素的濃度是誘導(dǎo)多倍體的成敗關(guān)鍵之一，濃度過(guò)低，不能產(chǎn)生加倍效應(yīng)，濃度過(guò)高則抑制植物材料生長(zhǎng)甚至死亡，處理的濃度、時(shí)間因不同植物和同一植物的不同組織而異。在一定范圍內(nèi)，秋水仙素濃度與處理時(shí)間同誘變效果呈正相關(guān)，同植物材料存活率呈負(fù)相關(guān)。光照情況是影響多倍體誘導(dǎo)效果的第二顯著因素，試驗(yàn)探索得到，無(wú)光條件更利于多倍體誘導(dǎo)。溫度影響藥劑的水解速度，低溫條件下藥效減弱，高溫條件下藥效增強(qiáng)但對(duì)植物組織的損傷較大。變溫處理可提高誘導(dǎo)效果同時(shí)減輕對(duì)植物的傷害。滲透劑二甲基亞砜(DMSO)能促進(jìn)秋水仙素快速浸透到植物組織中，能減輕秋水仙素的藥害作用，顯著提高秋水仙素的加倍效果并降低嵌合體的發(fā)生率，在作物的多倍體研究中得到了驗(yàn)證。此外，植物的不同組織、誘導(dǎo)方法及誘導(dǎo)前的狀態(tài)對(duì)誘導(dǎo)率也有影響。

2.1 同一植物不同器官誘導(dǎo)效果不同

用秋水仙素溶液浸泡百合的鱗片、無(wú)菌試管苗、不定芽、叢生芽，均獲得了多倍體，濃度為0.02％～0.10％，誘變率在13.3％～50.0％，處理不定芽的誘導(dǎo)效果最佳，誘變率達(dá)50.0％。用秋水仙素溶液處理桔梗的愈傷組織，濃度為0.2％、處理時(shí)間為15h誘變效果最佳。但誘導(dǎo)率也不過(guò)為20.0％：用0.1％的秋水仙素處理其帶芽莖段40h，誘導(dǎo)率達(dá)50.0％。用0.05％秋水仙素溶液浸泡處理小葉綠蘿的不定芽72h，不定芽無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生，誘導(dǎo)率達(dá)12.5％：而浸泡愈傷組織72h。死亡率可高達(dá)90.0％，且誘導(dǎo)完全不成功。用0.5％秋水仙素處理桉樹(shù)的單芽和叢生芽進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，處理單芽120h時(shí)誘變率最高，達(dá)42.9％，死亡率也最高，達(dá)65.0％；處理叢生芽96h時(shí)誘變率最高，達(dá)38.5％。死亡率35.0％。叢生芽的誘導(dǎo)效果比單芽好。

與莖段、葉柄相比較，葉片是毛泡桐和白花泡桐四倍體誘導(dǎo)的最佳材料，經(jīng)秋水仙素處理后葉片最高存活率略低，但四倍體誘導(dǎo)率明顯高于莖段和葉柄。以庫(kù)拉索蘆薈的叢生芽、微塊莖、愈傷組織為材料，用秋水仙素濃度為0.05％的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，愈傷組織誘變的效果最差；叢生芽誘導(dǎo)效果較理想。

2.2 誘導(dǎo)方法

2.2.1 同一植物材料的不同處理方法 在培養(yǎng)基中添加一定濃度的秋水仙素，或者用秋水仙素浸泡處理植物材料一段時(shí)間再轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均可誘發(fā)多倍體的產(chǎn)生，不同植物種類(lèi)的最佳誘導(dǎo)方法存在差異。

用0.1％的秋水仙素處理貝母的愈傷組織24h，誘導(dǎo)率為47.0％；將其接種到含1000mg·L^-1，秋水仙素的培養(yǎng)基中處理5d，誘導(dǎo)率最高達(dá)70.0％，誘變效果優(yōu)于浸泡處理。以不定芽為材料對(duì)金銀花進(jìn)行多倍體的誘導(dǎo)，將其接種到添加秋水仙素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個(gè)月，以添加40mg·L^-1秋水仙素處理組誘導(dǎo)率最高，為20.0％：用0.2％秋水仙素浸泡不定芽72h的誘導(dǎo)率僅15.0％。以種子為材料進(jìn)行杜仲多倍體的誘導(dǎo)，研究表明。用秋水仙素處理后再進(jìn)行試管萌發(fā)處理，其多倍體的誘導(dǎo)率高于培養(yǎng)基中添加秋水仙素直接進(jìn)行試管萌發(fā)的處理。

2.2.2 培養(yǎng)基類(lèi)型 用秋水仙素加入培養(yǎng)基法進(jìn)行多倍體的誘導(dǎo)，不同培養(yǎng)基的類(lèi)型誘導(dǎo)效果有所不同。

將紅掌愈傷組織放人含200mg·L^-1秋水仙素的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)14d，誘導(dǎo)率為45.45％，高于同體培養(yǎng)基處理的四倍體誘導(dǎo)率。在毛泡桐和白花泡桐四倍體誘導(dǎo)研究中，雙層培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最好。剪秋羅的莖段接入含400mg·L^-1秋水仙素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基比固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)率和存活率高。

2.3 預(yù)先黑暗培養(yǎng)

由于秋水仙素見(jiàn)光易分解，誘導(dǎo)處理需在黑暗環(huán)境進(jìn)行，誘導(dǎo)前將材料置入黑暗環(huán)境進(jìn)行預(yù)處理的時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)效果有一定的影響。在毛泡桐和白花泡桐四倍體誘導(dǎo)研究中，外植體的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)外植體存活率、芽誘導(dǎo)率和四倍體誘導(dǎo)率的影響皆達(dá)到極顯著水平。

將茶樹(shù)幼苗先遮光黃化3d后再用秋水仙素處理生長(zhǎng)點(diǎn)效果較好。

3 多倍體的鑒定

3.1 形態(tài)學(xué)

最簡(jiǎn)單、最直觀粗放的鑒定方法，主要是觀察株高、莖粗、葉色及厚度、花冠、花藥及花粉、果實(shí)、種子等外部形態(tài)的變化。由于秋水仙素處理后會(huì)引起生長(zhǎng)初期的表型畸變，所以在早期用形態(tài)特征指標(biāo)來(lái)鑒定多倍體是不可靠的。

3.2 染色體計(jì)數(shù)

最直接、也是最準(zhǔn)確的鑒定方法。它不但能區(qū)分倍性而且還能鑒定是整倍性或非整倍性的變異。但技術(shù)性要求高，工作量大，而且實(shí)現(xiàn)的可能因植物而異，

3.3 氣孔觀測(cè)

氣孔的大小、密度，保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度、寬度及葉綠體的數(shù)目可作為多倍體鑒定的間接指標(biāo)。氣孔的大小與倍性呈正相關(guān)，氣孔的密度與倍性呈負(fù)相關(guān)。以氣孔為指標(biāo)間接鑒定杜仲多倍體，與通過(guò)染色體記數(shù)法直接鑒定相比。其誤差不超過(guò)25％。認(rèn)為利用氣孔大小和密度來(lái)鑒定杜仲多倍體是一種相對(duì)可靠的方法。還可以作為鑒別渥丹百合多倍體、紅掌四倍體的可靠方法。如在同一植株或同一表皮上的氣孔大小差異明顯，此植株多為嵌合體，必須通過(guò)再次脫分化誘導(dǎo)不定芽的方法分離獲得純多倍體植株。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)可以直接測(cè)定細(xì)胞核的DNA含量，測(cè)量精確、快速、重復(fù)性好，通過(guò)比較細(xì)胞核DNA含量來(lái)鑒定倍性較準(zhǔn)確，這種方法已被成功地用于蘋(píng)果、草莓、白花泡桐、美人梅、剪秋羅的倍性鑒別上。

此外，李涵等用指紋圖譜分析法對(duì)齒瓣石斛多倍體進(jìn)行分析，研究表明正常二倍體與多倍體齒之間存在著明顯的差異，推斷在多倍體誘導(dǎo)過(guò)程中，存在著較多的加倍類(lèi)型或少數(shù)染色體結(jié)構(gòu)的變異。

王鴻鶴等對(duì)重瓣大巖桐多倍體進(jìn)行了過(guò)氧化物同工酶酶譜分析比較，但酶譜帶數(shù)與倍性之間無(wú)相關(guān)性，不能作為倍性進(jìn)行鑒定的指標(biāo)。李政等對(duì)綠玉樹(shù)不同倍性的植株進(jìn)行共有譜帶、特有譜帶的比較，研究發(fā)現(xiàn)，二倍體綠玉樹(shù)的過(guò)氧化物酶同工酶譜帶僅有5條，而四倍體譜帶有8條，其中3條明顯加強(qiáng)，僅能說(shuō)明四倍體綠玉樹(shù)的過(guò)氧化物酶同工酶活性增強(qiáng)。

4 存在問(wèn)題與展望

4.1 誘導(dǎo)系統(tǒng)有待完善

秋水仙素的作用機(jī)理在于它能抑制或妨礙細(xì)胞的紡錘絲形成，使分裂的染色體停留在赤道板，不向兩極移動(dòng)，而細(xì)胞質(zhì)不分裂，導(dǎo)致染色體數(shù)目增加。秋水仙素對(duì)外植體有毒害作用，常常使材料的生長(zhǎng)受到抑制或死亡。不同植物對(duì)秋水仙素的敏感程度不同，除處理濃度外還有多種因素共同影響誘導(dǎo)效果，綜合使用各方法可提高材料成活率和誘導(dǎo)率；不同植物或同一植物的不同部位也有差異，各種植物的誘導(dǎo)系統(tǒng)有待完善。

4.2 多倍體的鑒定方法

染色體記數(shù)法是最直接、最準(zhǔn)確的鑒定方法，但技術(shù)性高，工作量大，對(duì)材料的狀態(tài)要求嚴(yán)格，只有處于旺盛分裂期的組織才能用于染色體計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)的可能因植物而異。因此，找到一種簡(jiǎn)單、快速、相對(duì)可靠的間接方法勢(shì)在必行。流式細(xì)胞術(shù)可以直接測(cè)定細(xì)胞核的DNA含量，測(cè)量精確、快速，比較細(xì)胞核DNA含量可確定植物的倍性，這種方法已應(yīng)用在多種植物倍性的鑒定上，可靠性較高。

4.3 嵌合體的分離與穩(wěn)定

在處理過(guò)程中，有的細(xì)胞染色體加倍1次，有的加倍2次，有的不加倍，這就產(chǎn)生了嵌合體現(xiàn)象。在嵌合體中加倍部分的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢而未經(jīng)加倍的細(xì)胞分裂旺盛：加倍部分的組織若不能及時(shí)被分離出來(lái)最終會(huì)被旺盛生長(zhǎng)的未加倍細(xì)胞包圍，植株將恢復(fù)為處理前的倍性。組培技術(shù)的發(fā)展可使嵌合體得到有效分離和穩(wěn)定，組培水平上進(jìn)行多倍體的誘導(dǎo)減少了嵌合體的幾率。

(責(zé)任編輯 昌炎新)