中圖分類號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X(2008)07-0014-02

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)自1985年建立以來，經(jīng)過了20余年的發(fā)展，應(yīng)用日益廣泛，體現(xiàn)了其強(qiáng)大的生命力。對(duì)病原體核酸的擴(kuò)增被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物病原體的檢測(cè)中。并在動(dòng)物檢疫中發(fā)揮著越來越大的作用。

PCR作為現(xiàn)代分子生物學(xué)的核心技術(shù)，在科學(xué)研究和臨床診斷中都發(fā)揮了巨大的作用。這項(xiàng)技術(shù)經(jīng)過不斷的開發(fā)和改進(jìn)，已經(jīng)應(yīng)用到動(dòng)物檢疫領(lǐng)域的各個(gè)環(huán)節(jié)。給我們的工作帶來極大的便利。在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上衍生出很多新技術(shù)，在動(dòng)物檢疫中逐漸被采用的PCR技術(shù)主要有多重PCR和熒光PCR技術(shù)。

1 多重PCR技術(shù)

多重PCR最先被用于疾病的診斷是1988年Chamber-lain將其應(yīng)用于人的杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)基因外顯子的檢測(cè)。隨后，在人醫(yī)上被廣泛應(yīng)用于各種疾病的診斷。1993年，WirzB將其用于豬瘟病毒和其他瘟病毒屬的鑒別診斷，從而拉開了在獸醫(yī)診斷領(lǐng)域應(yīng)用多重PCR的序幕。隨后該技術(shù)不斷的被報(bào)道用于動(dòng)物細(xì)菌性、病毒性、寄生蟲性疾病等的診斷，被公認(rèn)為是一種方便、快速、敏感、特異的診斷方法。

1.1 方法的特點(diǎn)

多重PCR是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。因此，其基本原理和常規(guī)PCR沒有差別，所不同的是多重PCR技術(shù)是在同一個(gè)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)序列的存在。理論上講，引物條數(shù)可以不加限制，但是實(shí)際操作中，由于隨著引物條數(shù)的增加，引物之間的相互作用變得更為復(fù)雜，二聚體和錯(cuò)配的幾率大大增加，優(yōu)化各種條件變得更為困難，從而影響引物的擴(kuò)增效果。雖然目前已有同時(shí)用9對(duì)引物擴(kuò)增出相應(yīng)目標(biāo)片段的報(bào)道，但是實(shí)際工作中通常以使用引物不超過5對(duì)為好。在把單重PCR合并成多重PCR之前要進(jìn)行不同擴(kuò)增子之間引物的分析，條件進(jìn)一步優(yōu)化。

1.2 方法的應(yīng)用

多重PCR在動(dòng)物中使用相當(dāng)普遍，主要用于病原體強(qiáng)弱毒株的區(qū)分、鑒別診斷和分型鑒定等。

1.2.1 毒力強(qiáng)弱分析 新城疫是家禽的一種烈性傳染病。但有時(shí)卻表現(xiàn)出慢性疾病的特點(diǎn)，無典型的臨床癥狀。因而需要一種不僅能夠診斷該病而且能快速區(qū)別病原是強(qiáng)毒株還是弱毒株的方法。早期的研究多集中在RT-PCR擴(kuò)增結(jié)合序列分析的方法上，雖然也不失為鑒別診斷新城疫的準(zhǔn)確可靠的方法，但測(cè)序比較煩瑣，成本也較高，難以進(jìn)行大批量操作。20世紀(jì)80年代末到90年代初。新城疫基因組結(jié)構(gòu)的闡明為建立這種鑒別診斷方法提供了可能。通過對(duì)大量不同毒力新城疫基因核苷酸序列的分析，根據(jù)強(qiáng)弱毒株FO裂解位點(diǎn)的序列差異設(shè)計(jì)合成了3對(duì)引物，建立了快速診斷新城疫并能鑒別其強(qiáng)弱毒株的反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該方法具有快速特異和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，不僅適用于對(duì)雞胚毒的檢測(cè)，而且適用于對(duì)病雞組織勻漿液的檢測(cè)，是新城疫鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查的頗具潛力的分子診斷方法。

1.2.2 鑒別診斷 雞傳染性支氣管炎(IB)、禽流感(AI)、雞傳染性喉氣管炎(ILT)、雞新城疫(ND)是嚴(yán)重危害雞群的4種主要呼吸道傳染病。這些傳染病感染不同年齡雞群，具有較高的發(fā)病率和死亡率，曾給養(yǎng)雞業(yè)造成沉痛的打擊和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于這些病原引起雞表現(xiàn)相似的臨床癥狀和病理剖解變化，用傳統(tǒng)的臨床診斷方法難以區(qū)別，并且這些方法常受臨床病料新鮮度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁瑣費(fèi)時(shí)。根據(jù)4種傳染病的各自保守序列設(shè)計(jì)4重PCR，由擴(kuò)增后得到的特異性片段的大小來診斷是哪種疾病引起。

豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)、典型豬瘟病毒(CS，F(xiàn)V)、圓環(huán)病毒(PCV)、細(xì)小病毒(PPV)、流行性乙型腦炎病毒(JEV)和豬偽狂犬病毒(PRV)是引起豬繁殖障礙的常見病原，在臨床上常呈混合感染。多重PCR技術(shù)用于PRRSV、CSFV、PCV、PPV和JEV感染的診斷能同時(shí)檢測(cè)5種病毒的感染。

1.2.3 動(dòng)物病原體的分型鑒定 豬鏈球菌分為35個(gè)莢膜血清型，1、2、1/2、7、9和14型從發(fā)病豬和死豬體內(nèi)最常分離到的血清型。其中以2型致病性和毒力最強(qiáng)，其他血清型有的毒力偏弱、危害較少。有的甚至在臨床上并不導(dǎo)致疾病。因此，在實(shí)踐中。需要將2型豬鏈球菌與其他型分開。2型和1/2型豬鏈球菌的毒力基因cps基因中有幾段是其他血清型豬鏈球菌沒有的(cps2F、cps2H、cps2I和cps2J)。建立同時(shí)檢測(cè)這些獨(dú)有基因和共有基因的多重PCR就可以將2型、1/2型豬鏈球菌與其他型分開。

流感病毒的基因組極易發(fā)生變異，其中以編碼血凝素(HA)的基因的突變率最高，其次為神經(jīng)氨酸酶(NA)基因。迄今已知有16種HA和10種NA，不同的HA和NA之間可能發(fā)生不同形式的隨機(jī)組合，從而構(gòu)成許許多多不同亞型。據(jù)報(bào)道，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的流感病毒亞型至少有80多種，其中絕大多數(shù)屬非致病性或低致病性，高致病性亞型主要是含H5和H7的毒株，特別是H5亞型禽流感病毒可以導(dǎo)致人的死亡，具有重要的公共安全意義。鑒別診斷H5與其他亞型的多重PCR技術(shù)已經(jīng)在動(dòng)物檢疫中廣泛使用。

2 熒光PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosys-terns公司推出，可以分為探針法和SYBR Green I熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上更為嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確。熒光PCR把PCR的靈敏度和特異性大大提高，靈敏度接近檢測(cè)方法的極限，熒光探針增加了檢測(cè)的特異性。

2.1 熒光PCR技術(shù)特點(diǎn)

第一是實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)檢測(cè)。能在反應(yīng)結(jié)束后得到PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。從而很直觀地反映整個(gè)PCR過程的動(dòng)態(tài)變化。檢測(cè)點(diǎn)以Ct值為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)熒光信號(hào)達(dá)到Ct值時(shí)，PCR反應(yīng)體系內(nèi)各種成分均處于最佳飽和狀態(tài)。受各種干擾因素的影響最少，最能反應(yīng)體系中模板的起始含量。第二是具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，Gerard報(bào)道用熒光定量PCR方法，重復(fù)40次反應(yīng)。其Ct值的變異系數(shù)為1，6％。如使用電泳后凝膠掃描定量。其變異系數(shù)高達(dá)31％，兩者相差19倍多。第三是用熒光信號(hào)的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，能獲得較高的檢測(cè)精度，因?yàn)闊晒鈾z測(cè)的靈敏度顯著高于肉眼觀察電泳條帶的靈敏度。第四是在熒光定量PCR過程中，除加樣一次開蓋外，其余過程在閉管情況下進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后在電腦上顯示，不需要后期的凝膠電泳，有效杜絕了產(chǎn)物污染造成的假陽性問題，同時(shí)避免了溴化乙錠或同位素對(duì)人體及環(huán)境的危害。第五是操作簡(jiǎn)單、快速，工作效率高。整個(gè)過程由電腦控制，從加樣到結(jié)果出來只需要2h左右，內(nèi)置9600型PCR擴(kuò)增儀，可同步完成96個(gè)樣品的擴(kuò)增及定量，適宜于大批樣品的檢測(cè)處理，有利于操作規(guī)程的標(biāo)準(zhǔn)化。

熒光PCR也可以設(shè)計(jì)多重，即多重?zé)晒釶CR，通過不同的探針標(biāo)記不同的發(fā)光集團(tuán)實(shí)行熒光分類從而實(shí)行多重檢測(cè)的目的。目前，市面上流行的熒光PCR儀中，ABI公司的7500最多可以檢測(cè)5個(gè)通道的熒光，也就是說最多可以進(jìn)行5重?zé)晒釶CR檢測(cè)。

2.2 熒光PCR的應(yīng)用

熒光PCR由于具備更多的優(yōu)勢(shì)，因此在動(dòng)物檢疫中受到更多的青睞。除了需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行下游處理的試驗(yàn)外，幾乎所有PCR進(jìn)行的工作都可以由熒光PCR來完成。進(jìn)出口檢驗(yàn)中對(duì)方法的靈敏度要求很高，要求有微量的病原體就能夠檢出，熒光PCR正好可以發(fā)揮它的優(yōu)勢(shì)。

2.2.1 動(dòng)物病毒檢測(cè) 熒光定量PCR技術(shù)在動(dòng)物病毒性疾病的診斷及定量檢測(cè)中已經(jīng)被廣大臨床診斷實(shí)驗(yàn)室所接受，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多實(shí)驗(yàn)室都建立了快速檢測(cè)病毒的方法，病毒分離結(jié)果一致。英國(guó)科學(xué)家Schweiger報(bào)道應(yīng)用熒光PCR對(duì)咽喉拭子等呼吸道標(biāo)本中禽流感病毒進(jìn)行型別、亞型鑒定，結(jié)果表明敏感性高于常規(guī)的病毒分離、培養(yǎng)方法。深圳四基生物工程公司與北京出入境檢驗(yàn)檢疫局研制出了AIV熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒。基于該技術(shù)的檢測(cè)試劑在全國(guó)各個(gè)出入境檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室得到了廣泛使用，為有效控制禽流感疫情在國(guó)際間的傳播起到顯著的作用。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由FMDV感染引起的偶蹄動(dòng)物共患的急性、熱性、接觸性傳染病?；疾?dòng)物的口、舌、唇、蹄和乳房等部位出現(xiàn)水泡，破潰并形成爛斑。該病一經(jīng)檢出，相應(yīng)的家畜及畜產(chǎn)品就禁止運(yùn)輸和出口，造成巨大的經(jīng)濟(jì)和政治影響。FMD的暴發(fā)和流行除了對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失外，對(duì)人民生活所需要的奶品、肉品供應(yīng)也造成很大的影響，故各國(guó)對(duì)FMD的檢驗(yàn)檢疫非常嚴(yán)格。FMD檢測(cè)可以通過病毒分離、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)(CFF)、病毒中和實(shí)驗(yàn)(VNT)和動(dòng)物接種實(shí)驗(yàn)等方法。然而，這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。特異性和靈敏度也無法滿足需要。急需一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)。在我們國(guó)家，檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)中首先建立了口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，之后形成檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，成為進(jìn)出口動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的重要檢疫規(guī)范。

此外，熒光PCR新城疫病毒和豬藍(lán)耳病病毒的檢測(cè)方法已經(jīng)建立。部分口岸實(shí)驗(yàn)室也在應(yīng)用。

2.2.2 動(dòng)物細(xì)菌病檢測(cè) 2005年6月，四川省資陽、內(nèi)江相繼暴發(fā)豬鏈球菌病，截止到8月20日，累計(jì)報(bào)告人感染豬鏈球菌病病例204例。死亡38例。這些事件不但造成了人員傷亡，而且引發(fā)了全國(guó)性的食品安全恐慌，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。全國(guó)多個(gè)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室建立了熒光PCR檢測(cè)2型豬鏈球菌的檢測(cè)技術(shù)，其中珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局建立的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)技術(shù)同時(shí)檢測(cè)2型豬鏈球菌的莢膜多糖基因cps2I和溶菌素釋放蛋白基因MRP，對(duì)于控制疫情、減少擴(kuò)散起到積極作用。

炭疽是由炭疽芽孢桿菌引起的一種人獸共患病，炭疽芽孢桿菌可通過消化道、呼吸道及皮膚接觸感染人和動(dòng)物，具有高度致病性，特定條件下炭疽芽孢桿菌可以形成芽孢，抵抗力強(qiáng)，在外界環(huán)境中可存活數(shù)十年。2002年美國(guó)出現(xiàn)的炭疽生物恐怖事件更是給人們敲響了警鐘，快速準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于炭疽的監(jiān)測(cè)和控制具有重大意義。張玲建立了SYBR GREEN I染料法熒光PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了炭疽桿菌的快速檢測(cè)。2005年陳蘇紅等針對(duì)炭疽桿菌的pX01和pX02質(zhì)粒建立了Taqman探針熒光PCR檢測(cè)技術(shù)，使檢測(cè)的特異性和靈敏度大大提高。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，他們的研究都取得了不錯(cuò)的效果，有望在實(shí)踐中，特別是進(jìn)出口檢驗(yàn)中發(fā)揮越來越大的作用。

另外，大腸桿菌0157、霍亂沙門氏菌也都建立了相應(yīng)的熒光PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)保障進(jìn)出口動(dòng)物健康和食品安全具有重要作用。

3 小結(jié)

新技術(shù)的出現(xiàn)往往給生產(chǎn)和應(yīng)用帶來巨大的便利，PCR技術(shù)作為現(xiàn)代分子生物學(xué)的核心技術(shù)，已經(jīng)在實(shí)踐中發(fā)揮出無法替代的作用。然而，所有的檢測(cè)方法都有自身的不足，基于核酸擴(kuò)增的PCR技術(shù)也不例外。RNA病毒的快速變異使我們無法知道下一個(gè)突變發(fā)生在什么地方，如果新的毒株在我們的檢測(cè)區(qū)域發(fā)生突變，就可能出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。特別是熒光PCR技術(shù)，如果在探針位置出現(xiàn)不匹配，檢測(cè)很可能出現(xiàn)假陰性。我們?cè)?jīng)在實(shí)驗(yàn)中使用過10多套引物、探針檢測(cè)口蹄疫病毒，并且在一些位點(diǎn)使用了兼并堿基，然而。沒有一套可以從理論上兼顧到所有的毒株。也就是說，沒有一套引物可以成功擴(kuò)增迄今為止出現(xiàn)的所有口蹄疫病毒，只能在盡可能保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物、探針，進(jìn)而隨著病毒變異不斷嘗試新的檢測(cè)區(qū)域。特別是型特異性引物、探針的設(shè)計(jì)，必須是在型內(nèi)高度保守、型間易于區(qū)分的區(qū)域，給研究人員帶來了一定的挑戰(zhàn)。實(shí)際上，一些研究者在進(jìn)行單個(gè)病原體的檢測(cè)時(shí)已經(jīng)開始使用多重PCR或者多重?zé)晒釶CR，只要有一個(gè)特異性片段出現(xiàn)就可以判斷結(jié)果陽性。生產(chǎn)實(shí)踐中的需要使PCR技術(shù)已經(jīng)得到了很大的改進(jìn)和發(fā)展，相信隨著新問題的出現(xiàn)，新的技術(shù)方法和原有方法的新應(yīng)用會(huì)不斷出現(xiàn)。