洪曉婭 綜述，徐靖宏 審校

[摘要]脂肪干細(xì)胞(Adipose-Derived Stem CellsADSCs)具有一般干細(xì)胞的特點(diǎn)，即多向分化潛能和穩(wěn)定的體外多代增殖能力，其免疫相容性好，來(lái)源豐富，易于獲得，可反復(fù)取材，無(wú)倫理學(xué)問(wèn)題，作為組織工程的種子細(xì)胞有著非常重要的實(shí)際研究和應(yīng)用價(jià)值。本文著重對(duì)脂肪干細(xì)胞在生物學(xué)特性、體外成脂誘導(dǎo)分化，以及與之相配的生物學(xué)載體支架方面的最新進(jìn)展進(jìn)行闡述。

[關(guān)鍵詞]脂肪干細(xì)胞；誘導(dǎo)分化；載體支架

[中圖分類(lèi)號(hào)]R622[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2008）10-1540-03

Application of adipose tissue-derived stem cells in subcutaneous soft tissue filling

HONG Xiao-ya，XU Jing-hong

（Department of Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital，College of Medicine，

Zhejiang University，Hangzhou 310003，Zhejiang，China）

Abstract: Adipose tissue is an abundant， accessible， and replenishable source of adult stem cells. Adipose-derived stem cells(ADSCs) can be isolated from liposuction waste tissue by collagenase digestion and differential centrifugation. They are multipotent， differentiating along the adipocyte， chondrocyte， myocyte， neuronal， and osteoblast lineages. ADSCs cells have potential applications for the filling of subcutaneous soft tissue. Additional pre-clinical safety and efficacy studies will be needed before the promise of these cells can be fully realized.

Key words:ADSCs; differentiate;support

皮下軟組織充填一直是整形外科常見(jiàn)的治療手段，對(duì)于體表的皮下軟組織欠豐滿(mǎn)、凹陷、萎縮畸形目前常采用自體游離脂肪或各種人工材料進(jìn)行充填。人工材料因存在排異、創(chuàng)傷大及安全性等問(wèn)題難以滿(mǎn)足臨床需要，而自體游離脂肪的移植成活率僅為40%～50%，這使得其臨床應(yīng)用受到很大限制。脂肪移植物被吸收的原因之一是成熟脂肪細(xì)胞對(duì)缺氧、損傷的耐受力低，且不能增殖更新[1]。而脂肪干細(xì)胞（ADSCs）則具有強(qiáng)大的增殖分化潛力，對(duì)缺氧耐受力更強(qiáng)，且自體干細(xì)胞用于移植可避免排異反應(yīng)，更加安全。2001年Zuk[2]等從脂肪細(xì)胞抽吸物中成功分離培養(yǎng)出具有骨、軟骨、脂肪、肌肉等多向分化潛能的細(xì)胞，cronthos[3]等于同年也證實(shí)脂肪來(lái)源細(xì)胞中的確存在具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的細(xì)胞。2002年Zuk[4]等又證實(shí)了人的脂肪組織是多能干細(xì)胞的一個(gè)來(lái)源，具有分化為所有中胚層起源細(xì)胞的能力，還可分化為部分內(nèi)外胚層起源的細(xì)胞，自此脂肪干細(xì)胞(ASCs)以其來(lái)源豐富、易于獲得、能在體外多代穩(wěn)定增殖、具有多向分化潛能、免疫相容性好、取材對(duì)患者損傷小等優(yōu)點(diǎn)而日益成為研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)將其成脂誘導(dǎo)及誘導(dǎo)后復(fù)合生物支架材料用于軟組織填充修復(fù)研究現(xiàn)狀綜述如下。

1取材、提取、體外擴(kuò)增

取材部位最好能配合患者身體塑形的需要，做到一舉兩得。平均每300ml脂肪組織可獲得2×lO8～6×l08個(gè)干細(xì)胞，從不同個(gè)體的脂肪抽吸組織中提取的平均脂肪干細(xì)胞數(shù)目有所不同，但從同一個(gè)體不同部位的脂肪中所獲得的干細(xì)胞數(shù)目卻比較近似?；颊吣挲g越大，成脂分化率越低，同一患者不同部位來(lái)源的脂肪抽吸組織中的脂肪干細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)分化能力上存在差異[5]。

目前常采用電動(dòng)負(fù)壓吸脂術(shù)或注射器手工抽脂術(shù)獲取無(wú)菌脂肪組織，一般認(rèn)為注射器手工抽取的脂肪損傷較小。利用分層純化法將脂肪混合物靜置片刻，分別去除上下兩層。將獲得的脂肪用PBS緩沖液洗4次，以去除紅細(xì)胞和細(xì)胞碎片。清洗后用適量的0.075%膠原酶Ⅰ在振動(dòng)器37℃下消化1h。膠原酶Ⅰ活性用等量DMEM(含10%的胎牛血清)中和，后離心1200轉(zhuǎn)(10min)，細(xì)胞即被懸浮在DMEM中，用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，離心10min以沉淀細(xì)胞，重新懸浮細(xì)胞加至培養(yǎng)瓶，在37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)24h，更換培養(yǎng)液將未貼壁細(xì)胞和殘?jiān)怀?。后每周換液2次，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用0.25胰酶37℃消化，按1:3的比例進(jìn)行傳代。體外擴(kuò)增10代，平均每代倍增數(shù)目為1.59±0.224，累計(jì)倍增數(shù)目為15.53[6]。消化所得細(xì)胞除用于延續(xù)培養(yǎng)和進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)外，其余可按照一般方法凍存。凍存后6個(gè)月內(nèi)，以37℃水浴快速?gòu)?fù)蘇細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中可繼續(xù)傳代擴(kuò)增。

脂肪干細(xì)胞至少能保持20代的傳代活性，且細(xì)胞倍增時(shí)間與年齡呈正相關(guān)，即年輕人較年老者的脂肪干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力[7]。自分泌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF-2）對(duì)于人體脂肪干細(xì)胞的自我增殖具有關(guān)鍵性意義[8]。脂肪干細(xì)胞在體外的倍增時(shí)間按照培養(yǎng)基的類(lèi)型和傳代數(shù)目的不同大致為2～4天[9]，且在傳代中保持其端粒酶的長(zhǎng)度[10]。但也有報(bào)道稱(chēng)端粒酶在遞進(jìn)式傳代過(guò)程中會(huì)逐漸失去活性并縮短[11]。此類(lèi)研究涉及ASCs移植的安全性問(wèn)題，有報(bào)道稱(chēng)觀測(cè)到人類(lèi)ASCs在經(jīng)歷長(zhǎng)期傳代（>4個(gè)月）后發(fā)生惡變[12]。提示對(duì)于ASCs移植必須建立一套嚴(yán)格的安全性檢測(cè)體系，其中應(yīng)包含染色體組型測(cè)定。

2ASCs生物學(xué)特性

從肉眼上脂肪組織可被區(qū)分為，骨髓內(nèi)脂肪、棕色脂肪、乳房脂肪、機(jī)械充填脂肪、白色脂肪等至少5種類(lèi)型。每種脂肪各自具有不同的生物學(xué)特性及功能。因各類(lèi)脂肪皆有內(nèi)分泌功能可分泌瘦素、抵抗素等激素參與全身生理調(diào)節(jié)，脂肪組織做為整體目前傾向于被認(rèn)為是一個(gè)內(nèi)分泌器官。從人脂肪組織中提取的ASCs，以DMEM培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原，以集落形成能力和群體倍增時(shí)間來(lái)評(píng)估增殖潛力，油紅0染色來(lái)觀察ASCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后中性脂類(lèi)的蓄積，發(fā)現(xiàn)ASCs表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105，不表達(dá) CD14、CD31、CD45，具有很高的增殖潛力和多向分化潛能，且良好的免疫相容性類(lèi)似于BMSCs[13]。中性脂肪干細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，CD11b、CD45、CD49d、CD80、CD86表達(dá)陰性，MHC I、MHC lI表達(dá)弱陽(yáng)性，CD29、CD44、CD54的表達(dá)陽(yáng)性。第l1代以前的脂肪干細(xì)胞有較強(qiáng)的活力和增殖能力，體外培養(yǎng)至第10代，其細(xì)胞仍穩(wěn)定為二倍體核型BrdU可標(biāo)記其核。說(shuō)明ASCs具有較強(qiáng)的自我更新能力，其形態(tài)和表面標(biāo)志均類(lèi)似于BMSCs[14]?；诹魇郊?xì)胞儀分析和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)hADAS細(xì)胞不表達(dá)一些其它干細(xì)胞群表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括端粒末端轉(zhuǎn)移酶、CD133、膜轉(zhuǎn)運(yùn)ABCG2[15]。另有研究對(duì)三種來(lái)源（骨髓、臍血、脂肪組織）的干細(xì)胞在分離成功率、增殖能力、分化潛力、免疫表型等方面進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)三種來(lái)源的干細(xì)胞在組織形態(tài)和免疫表型上無(wú)顯著差異，而在其他生物學(xué)特性方面差異明顯，如脂肪來(lái)源的干細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于另外兩者，臍血來(lái)源干細(xì)胞增殖能力最弱且不具備向脂肪組織分化能力 [16]。相關(guān)研究還表明ASCs較BMSCs具有更好的遺傳穩(wěn)定性[17]。

3體外誘導(dǎo)分化

ASCs具有多向分化潛能，不僅能分化為中胚層細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞，還能分化為外胚層及內(nèi)胚層細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等。目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)方案，也都未能得到成熟細(xì)胞。由于脂肪組織常用于皮下軟組織充填，故將成脂誘導(dǎo)情況總結(jié)如下：

成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基1：高糖(含25 mmol/L D-葡萄糖)－DMEM、10%FBS（胎牛血清）、1μmol/L地塞米松、100μmol/L IBMX（異丁甲基黃嘌呤）、5μmol/L胰島素和60μmol/L吲哚美辛。

成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基2：高糖-DMEM、10%FBS、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L IBMX、10μmol/L胰島素、200μmol/L吲哚美辛、100U/ml鏈霉素、100U/ml青霉素。

成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基3：高糖－DMEM、10%胎牛血清、0.5mmol/L IBMX、1μmol/L地塞米松、10μmol/L胰島素、1%青鏈霉素原液。

各方案大同小異，經(jīng)2周的誘導(dǎo)后，用油紅染色鑒定細(xì)胞內(nèi)皆有脂滴聚集，但都未能得到成熟脂肪細(xì)胞。如果同時(shí)用DMEM/MCDB培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)較α-MEM培養(yǎng)基更有利于細(xì)胞的增殖和分化[18]。過(guò)氧化物酶增殖物活化受體和C/EBP家族，兩者是控制脂肪細(xì)胞分化的中心環(huán)節(jié)[19]。

一般而言，利用脂肪干細(xì)胞充填皮下軟組織，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)皆為在體外用以上培養(yǎng)基誘導(dǎo)至一定階段后再?gòu)?fù)合支架材料植入體內(nèi)，細(xì)胞移植成功率為50%～80%不等。因其移植成活率較低且不穩(wěn)定，尚未達(dá)到臨床應(yīng)用要求水平，有學(xué)者設(shè)想可在體外模擬體內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)干細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟從而提高移植存活率。也有意見(jiàn)認(rèn)為分離得到的干細(xì)胞無(wú)需體外誘導(dǎo)，直接復(fù)合支架植入體內(nèi)，體內(nèi)的微環(huán)境即可自行確定分化方向并可能以此提高移植細(xì)胞存活率，以上觀點(diǎn)均需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4載體支架材料

組織工程技術(shù)主要包括生物材料載體、種子細(xì)胞及訊息因子。理想的生物載體材料應(yīng)具有良好的生物相容性，對(duì)細(xì)胞和組織等無(wú)毒性，能以適當(dāng)速度被吸收降解，強(qiáng)度適中，利于細(xì)胞生長(zhǎng)和周?chē)M織長(zhǎng)入。因不同材料對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和黏附均有不同的影響，不同的細(xì)胞對(duì)支架的要求也不盡相同，因而種子細(xì)胞能否在支架材料上良好生長(zhǎng)并表達(dá)自身特異性功能取決于二者的適配程度。

理論上講，可用于復(fù)合脂肪干細(xì)胞的生物支架按材料分為三大類(lèi)：①天然生物材料，如膠原、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等，此類(lèi)材料以仿生原理模擬細(xì)胞外基質(zhì)組成；②合成生物材料，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚（乳酸－乙醇酸）共聚體等，此類(lèi)材料具有的優(yōu)勢(shì)為可控的降解性；③復(fù)合生物材料，為兩種或多種天然生物材料或（與）合成生物材料復(fù)合而成，具有仿生及可控性的多元優(yōu)勢(shì)。按支架的構(gòu)建方式可分為：三維多孔支架，如PLA多孔支架、膠原/殼聚糖多孔支架，可廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞及干細(xì)胞的復(fù)合移植；凝膠填充支架，如水凝膠填充支架，可用于軟骨等的修復(fù)；薄膜支架，多用于血管的修復(fù)重建；微粒支架，如PLLA微粒支架等。對(duì)于支架的生物相容性研究，也經(jīng)歷了生物惰性材料、可調(diào)控細(xì)胞行為功能的生物活性可吸收材料、具有激活機(jī)體再生潛能的組織誘導(dǎo)型生物材料等發(fā)展階段。

目前脂肪干細(xì)胞復(fù)合支架移植仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，移植后細(xì)胞生長(zhǎng)變化過(guò)程及相關(guān)影響因素尚不十分清楚，所用材料主要以天然生物材料為主，與新型組織誘導(dǎo)型材料復(fù)合的研究較少，移植存活率不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差很大，其最適材料仍有待于進(jìn)一步研究與選擇。

有研究者將ADSc與海綿狀透明質(zhì)酸支架材料復(fù)合，經(jīng)體外成脂誘導(dǎo)后有脂質(zhì)蓄積，檢測(cè)到脂肪形成的標(biāo)志酶甘油-3-磷酸脫氫酶[20]。Stosich[21]等將誘導(dǎo)得到的脂肪細(xì)胞分為6組，每組6份樣品，第一組將細(xì)胞植入圓柱形水凝膠，外層用乙烯－乙二醇多聚體包裹；第二組只將細(xì)胞植入水凝膠；第三組將細(xì)胞植入多孔膠原海綿；第四組單用無(wú)細(xì)胞水凝膠；第五組只用細(xì)胞；第六組只用無(wú)細(xì)胞膠原海綿。將六組全部植入無(wú)胸腺小鼠4周，結(jié)果所有有支架的組都有實(shí)質(zhì)脂肪組織生成，其中第一組效果最好，保有量最高，幾乎100%的細(xì)胞量次被保留，而第二組的細(xì)胞量次保留程度只有35%～65%，證明了預(yù)先定形的支架可最大限度地維護(hù)植入細(xì)胞的存活數(shù)量。

5需解決的問(wèn)題

關(guān)于脂肪干細(xì)胞的應(yīng)用，目前仍有許多重要問(wèn)題有待探索、解決。首先脂肪干細(xì)胞在無(wú)免疫力的移植受體上表現(xiàn)出的腫瘤樣無(wú)限增生特性，在進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)前仍需尋找并建立合適的動(dòng)物模型進(jìn)行長(zhǎng)期觀測(cè)以確定其移植后安全性。其次，在批量提取生產(chǎn)脂肪干細(xì)胞的過(guò)程中，如何保障細(xì)胞質(zhì)量的均一穩(wěn)定仍然有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，ASCs具有來(lái)源豐富、易于獲得、具有多向分化潛能、免疫相容性好、可反復(fù)取材、對(duì)患者損傷小等優(yōu)點(diǎn)，相較BMSCs具有更加強(qiáng)大的體外多代增殖能力，相較胚胎干細(xì)胞而言可避開(kāi)倫理學(xué)問(wèn)題。取材時(shí)可結(jié)合美容塑形的要求取得一舉兩得的效果。因此是可利用的種子細(xì)胞，有望在一定條件下，定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，提高自體脂肪移植存活率，達(dá)到臨床治療目的。

[參考文獻(xiàn)]

[1]von Heimburg D， Hemmrich K， Zachariah S，et al. Oxygen consumption in undifferentiated versus differentiated adipogenic mesenchymal precursor cells[J]. Respir Physiol Neurobiol， 2005，146:107-116.

[2]Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et a1.Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies[J]. Tissue Engineering，2001，7(2):211-228.

[3]Gronthos S， Franklin DM，Leddy HA，et al.Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells[J]. Cellular Physiology，2001，189:54-63.

[4]zuk PA， Zhu M， Ashjian P，et a1．Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J]．Mol Biol Cell，2002，13(12):4279-4295.

[5]嚴(yán) 笠，馬桂娥，曹 蕊，等．不同來(lái)源的人脂肪干細(xì)胞體外成脂誘導(dǎo)分化能力的比較[J]．中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10(29)：44-46.

[6]張 英，周廣東，楊 平，等. 脂肪來(lái)源細(xì)胞體外增殖規(guī)律及定向誘導(dǎo)分化研究[J]．分子生物學(xué)報(bào)，2006，39（2）：152-162.

[7] Lei L， Liao W， Sheng P，et al. Biological character of human adipose-derived adult stem cells and influence of donor age on cell replication in culture[J]. Science in China Series C， 2007，50(3): 320-328.

[8]Zaragosi LE， Ailhaud G， Dani C. Autocrine fibroblast growth factor 2 signaling is critical for self-renewal of human multipotent adipose-derived stem cells[J]. Stem Cells[J/OL]，2006， 24 (11):2412-2419.[2008-4-15] http://www.StemCells.com.

[9]Mitchell JB， McIntosh K， Zvonic S，et al. The immunophenotype of human adipose derived cells: temporal changes in stromal- and stem cell-associated markers[J]. Stem Cells，2006，24:376-385.

[10]Izadpanah R， Trygg C， Patel B，et al. Biologic properties of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and adipose tissue[J]. J Cell Biochem，2006，99: 1286-1297.

[11]Estes BT， Wu AW， Storms RW，et al. Extended passaging， but not aldehyde dehydrogenase activity， increases the chondrogenic potential of human adipose-derived adult stem cells [J]. J Cell Physiol，2006，209:987-995.

[12]Rubio D， Garcia CJ， Martin MC，et al. Spontaneous human adult stem cell transformation [J]. Cancer Res，2005，65: 3035-3039.

[13]Jun Ho Jang， Hyun Woo Lee， Young Woo Eom，et al. Characteristics of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells[J]. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts)， 2006，108: 4251-4253.

[14]江 麗，朱家愷，劉小林，等.大鼠脂肪干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究[J].中華顯微外科雜志，2007，30(3):189-192.

[15]Katz AJ， Tholpady A， Tholpady SS，et al.Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells[J].Stem Cells，2005，23，412-423.

[16]Susanne Kern， Hermann Eichler， Johannes Stoeve，et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow， umbilical cord blood， or adipose tissue[J].Stem Cells，2006，24，1294-1301.

[17]Ogawa R， Fujimura J， Hanawa H，et al. Comparison of stem cells harvested from adipose tissue and bone marrow[J].Blood (ASH Annual Meeting Abstracts)， 2005，106: 4221.

[18]Lee RH， Kim B， Choi I， et al.Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue[J].Cell Physiol Biochem， 2004，14:311-324

[19]Bordii K．Grillassa JP，Gouze JN．et al．Evidence for the presence of proliferator.Activated receptor(PPAR 1 alpha and gamma and retinoid Z receptor in cartilage.PPAR gamma activation modulates the effects of interleukin-1 be taon rat chondrocytes[J]．J Boil Chem，2000：275(16)：43-50.

[20]Halbleib M，Skurk T，De Luca C，et al. Tissue engineering of white adipose tissue using hyaluronic acid-based scaffolds.I:invitro differentiation of human adipocyte precursor cells on scaffolds [J]. Biomaterials，2003，24:3125-3132.

[21]Stosich MS， Mao JJ. Adipose tissue engineering from human adult stem cells: clinical implications in plastic and reconstructive surgery[J].Plast Reconstr Surg， January 1，2007，119(1): 71-83，discussion 84-85.

[收稿日期]2008-07-11[修回日期]2008-10-08

編輯/張惠娟