范文艷　文景芝　金麗娜　馬　建　陳　瑾

摘要為了明確黑龍江省水稻紋枯病菌遺傳多樣性，為水稻抗病育種和水稻紋枯病的綜合防治提供依據(jù)。本文對(duì)采自13個(gè)水稻種植地區(qū)的29個(gè)水稻紋枯病菌菌株進(jìn)行了致病力測(cè)定和AFLP分析。結(jié)果表明9對(duì)AFLP引物對(duì)供試菌株擴(kuò)增出396條帶，其中多態(tài)性帶187條，占總擴(kuò)增帶數(shù)的47.22％。黑龍江省水稻紋枯病菌的遺傳距離變化在0.50～0.92之間，平均為0.71，群體遺傳多樣性較為豐富。UPGMA法可以將供試菌株分成4個(gè)AFLP聚類(lèi)組群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，相同地理來(lái)源的菌株基本上聚集在同一組群內(nèi)，表明AFLP類(lèi)群劃分與菌株的地理來(lái)源有較強(qiáng)的相關(guān)性。黑龍江省水稻紋枯病菌致病性分化較為明顯，并且AFLP類(lèi)群劃分與菌株的致病性鑒定之間存在一定相關(guān)性。

關(guān)鍵詞水稻紋枯病菌；AFLP；致病力；遺傳多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)S 435.111.42

水稻紋枯病是由立枯絲核菌(Rhizoctonia sola-ni Kuhn)，引起的一種世界性水稻病害，也是目前水稻生產(chǎn)危害最嚴(yán)重的病害之一。水稻是黑龍江省的重要糧食作物，種植面積達(dá)到220萬(wàn)hm²以上，占全省糧食作物種植面積的22％。近些年來(lái)，由于施肥水平的提高和不注重此病的防治，使紋枯病的危害日趨嚴(yán)重，發(fā)病嚴(yán)重地塊，損失達(dá)20％～30％。了解病原菌的遺傳多樣性對(duì)于更好地理解病害的發(fā)生和流行以及進(jìn)一步預(yù)測(cè)病害的發(fā)展是十分必要的。雖然國(guó)內(nèi)外已有一些研究者采用不同的方法對(duì)紋枯病群體進(jìn)行了研究，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于該病原菌的遺傳聚類(lèi)群與其致病力、地理來(lái)源的關(guān)系，至今結(jié)論不一。AFLP(amplified fragment lengthpolymorphism)標(biāo)記技術(shù)是結(jié)合了RFLP的準(zhǔn)確性和PCR的高效性的一種DNA指紋技術(shù)。AFLP技術(shù)以其重復(fù)性好、效率高的特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物研究，也成功地應(yīng)用于植物病原真菌研究中，但在水稻紋枯病菌的研究中未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用AFLP技術(shù)從分子水平上對(duì)黑龍江省水稻紋枯病菌的遺傳分化進(jìn)行分析，并測(cè)定其致病力，探討黑龍江省水稻紋枯病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)特征及地理來(lái)源與致病力之間的關(guān)系，為水稻抗病育種和水稻紋枯病的綜合防治提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

根據(jù)黑龍江省農(nóng)業(yè)氣候生態(tài)區(qū)劃類(lèi)型，按水稻主產(chǎn)區(qū)不同生態(tài)條件，在黑龍江水稻主產(chǎn)區(qū)13市縣的稻田采集了具有典型癥狀的水稻紋枯病病株206份，經(jīng)室內(nèi)常規(guī)分離純化，采用番紅染色法，鏡檢各菌株細(xì)胞核數(shù)目以區(qū)分雙核和多核絲核菌，根據(jù)Parmeter等人描述的立枯絲核菌種的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)核相觀察與形態(tài)觀察對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，共獲得29個(gè)水稻紋枯病菌菌株(表1)。

1.2致病力測(cè)定

采用溫室人工接種測(cè)定不同菌株的致病力。接種方法采用牙簽接種法。具體如下：用經(jīng)過(guò)高壓滅菌的1.0cm長(zhǎng)牙簽接種病菌，在PDB培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d。然后，用鑷子將牙簽嵌入稻株自上向下第3葉鞘內(nèi)側(cè)。病級(jí)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)際水稻研究所的0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。供試水稻品種為粳稻合江19號(hào)。

1.3菌絲培養(yǎng)和DNA提取

將菌株接種到裝有100mLPDB(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，25℃靜置培養(yǎng)4d，在菌核形成前收集菌絲。菌絲基因組DNA的提取參照周而勛等的方法。

1.4 AFLP試驗(yàn)

采用Vos等的方法。選擇性擴(kuò)增用EcoRI和MseI雙酶切，EcoRI引物E-AAC、E-ACT和E-ACG與MseI引物M-CAA、M-CAT和M-CTC組合的9個(gè)組合作為選擇擴(kuò)增引物組合。利用5％聚丙烯酰胺變性膠進(jìn)行電泳，80W恒功率電泳1.5h。銀染檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5數(shù)據(jù)分析

對(duì)電泳結(jié)果采用有帶記為“1”、無(wú)帶記為“0”的方法記錄譜帶。利用NTSYS分析軟件計(jì)算兩兩菌株間的Dice相似系數(shù)，并利用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，建立聚類(lèi)樹(shù)狀圖。

2結(jié)果分析

2.1致病力鑒定

由表1可以看出，供試的29個(gè)菌株對(duì)水稻品種合江19都有致病性，并且水稻紋枯病菌菌株之間的致病力存在不同程度差異，按菌株的平均病級(jí)大小劃分為強(qiáng)、中、弱3種類(lèi)型：強(qiáng)致病力菌株3個(gè)，占10.3％；中等致病力菌株18個(gè)，占62.1％；弱致病力菌株8個(gè)，占27.6％。致病力與地理分布存在一定的相關(guān)性，采自樺川縣、蘿北縣、富錦和慶安縣的菌株致病力相對(duì)較弱。

2.2水稻紋枯病菌株遺傳多樣性分析

試驗(yàn)使用9對(duì)引物對(duì)29個(gè)供試水稻紋枯病菌菌株進(jìn)行AFLP分析，均獲得清晰AFLP譜帶(圖1)。9對(duì)引物組合產(chǎn)生條帶總數(shù)為396條，其中多態(tài)性條帶為187條，占總擴(kuò)增帶數(shù)的47.22％。應(yīng)用NTSYS軟件對(duì)擴(kuò)增出的187條多態(tài)性條帶進(jìn)行分析，結(jié)果顯示黑龍江省水稻紋枯病菌Dice相似系數(shù)在0.5～0.92之間，平均為0.71，說(shuō)明黑龍江省水稻紋枯病菌遺傳分化比較大，群體遺傳多樣性較為豐富。利用AFLP分析得到的分子標(biāo)記可將不同地理來(lái)源的菌株區(qū)分開(kāi)。在Dice相似系數(shù)0.62水平上，供試的29個(gè)菌株可以劃分為4個(gè)類(lèi)群(圖2)。類(lèi)群工分別由來(lái)自勃利、寶清和樺南的6個(gè)菌株組成，BL-1與來(lái)自樺南的2個(gè)菌株HN-1和HN-2關(guān)系較近。類(lèi)群Ⅱ?yàn)閷幇?、尚志和五常菌株，其中?lái)自寧安的2個(gè)菌株分化較大，并且寧安菌株與尚志菌株的關(guān)系較近。來(lái)自虎林、密山和雞東的菌株為類(lèi)群Ⅲ，該類(lèi)群可進(jìn)一步分為3個(gè)亞群，其中HL-2與其他菌株的遺傳距離較遠(yuǎn)，獨(dú)立成為一個(gè)亞群；在其他兩個(gè)亞群中，菌株HL-3與MS-3、JD-1與MS-2、JD-2與MS-1關(guān)系較近。來(lái)自蘿北、樺川、富錦和慶安的菌株組成類(lèi)群Ⅳ，其中樺川和富錦兩地菌株的關(guān)系較近。

2.3 AFLP類(lèi)群分析與菌株致病力關(guān)系

從圖2的聚類(lèi)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在Dice相似系數(shù)0.56水平上，29個(gè)菌株可分為兩大類(lèi)群。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ為一大類(lèi)群，這一類(lèi)群是由中等致病力和強(qiáng)致病力菌株組成；由來(lái)自蘿北、樺川、富錦和慶安的菌株弱致病力菌株組成類(lèi)群Ⅳ。這說(shuō)明菌株的地理分布與菌株的遺傳距離有一定的相關(guān)性。同一類(lèi)群的菌株由于其親緣關(guān)系較近，因而表現(xiàn)出較為一致的致病力，說(shuō)明紋枯病菌的AFLP類(lèi)群與菌株的致病力有一定的相關(guān)性。

3討論

3.1水稻紋枯病菌的遺傳多樣性

基于本試驗(yàn)研究結(jié)果，黑龍江省水稻紋枯病菌的遺傳相似系數(shù)變化在0.50～0.92之間，平均為0.71，從分子水平上證明水稻紋枯病菌群體遺傳多樣性比較豐富。這與廣東、云南和福建省水稻紋枯病菌一樣。導(dǎo)致黑龍江省水稻紋枯病菌遺傳多樣性復(fù)雜原因可能有以下幾個(gè)方面。(1)黑龍江

省水稻種植品種多樣化，主栽品種多達(dá)49個(gè)品種(系)，各地區(qū)主栽品種差異較大。由于寄主與病原菌在進(jìn)化過(guò)程中相互依存，品種的多樣化對(duì)紋枯病菌的長(zhǎng)期選擇使當(dāng)?shù)鼐臧l(fā)生突變，形成了適應(yīng)相應(yīng)品種的菌株。AFLP聚類(lèi)群工的來(lái)源地主栽品種以9031、空育131、綏粳4號(hào)、富士光、系選1號(hào)為主；聚類(lèi)群Ⅱ的來(lái)源地以松粳二號(hào)、龍選93-8、長(zhǎng)粒香、五優(yōu)一號(hào)、五稻三號(hào)作為主栽品種；聚類(lèi)群Ⅲ的來(lái)源地主栽品種為空育131、墾鑒稻7號(hào)、松粳6號(hào)、墾稻10；聚類(lèi)群Ⅳ的來(lái)源地以墾稻12、墾稻10、龍粳14、空育131、牡丹江19、綏粳4作為主栽品種。易潤(rùn)華等研究也證明了紋枯病菌菌株親緣關(guān)系與寄主有一定的相關(guān)性。(2)黑龍江省各稻區(qū)的氣候差異導(dǎo)致形成適應(yīng)當(dāng)?shù)刈匀粭l件的新菌株。黑龍江省稻區(qū)主要分布在3個(gè)農(nóng)業(yè)氣候帶，即溫涼農(nóng)業(yè)氣候帶(樺川、富錦、蘿北、慶安)、溫和農(nóng)業(yè)氣候帶(寶清、樺南、勃利、雞東、虎林、密山和尚志)和溫暖農(nóng)業(yè)氣候帶(寧安、五常)。由于自然環(huán)境和農(nóng)業(yè)生態(tài)條件對(duì)水稻紋枯病菌基因型的分布具有一定的選擇壓力，造成不同地區(qū)菌株的遺傳分化程度高，而同一地區(qū)的菌株所面臨的環(huán)境選擇壓力相同，因而分化程度低，因此，相同地理來(lái)源的菌株間親緣關(guān)系較近，而不同地理來(lái)源的菌株間遺傳差異較大。(3)菌核隨種子傳入其他地區(qū)也可能是導(dǎo)致黑龍江省水稻紋枯病菌遺傳多樣性豐富的原因之一。從圖2可以看到，類(lèi)群Ⅲ的遺傳結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，出現(xiàn)了相同地理來(lái)源菌株的遺傳距離較遠(yuǎn)，而一些不同來(lái)源菌株的遺傳距離反而較近。這一現(xiàn)象與虎林、密山和雞東三地水稻互相調(diào)種較為頻繁有很大關(guān)系。頻繁的引種過(guò)程增加了兩地菌株的遷移，從而使紋枯病菌的群體間產(chǎn)生隨機(jī)遺傳漂變效應(yīng)，使這個(gè)群體菌株與原群體產(chǎn)生較大差異。

3.2 AFLP類(lèi)群與紋枯病菌致病力之間的關(guān)系

植物病原菌的遺傳宗譜與其致病譜之間是否有一定的關(guān)系是植物病理學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。在分子水平上研究紋枯病菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)可以從DNA水平探究病原菌的變異規(guī)律，尋找病菌系譜與致病性的關(guān)系，克服依據(jù)鑒別寄主來(lái)區(qū)分病菌生理小種的方法的局限性。目前人們對(duì)水稻紋枯病菌遺傳多樣性的了解較少，國(guó)內(nèi)外只有少數(shù)報(bào)道，且結(jié)論不一。Pascual等研究結(jié)果表明，紋枯病菌菌株間毒力差異和RAPD聚類(lèi)有一定程度的一致性，而易潤(rùn)華等研究表明紋枯病菌菌株的致病力與菌株的親緣關(guān)系不大。本研究結(jié)果表明，在Dice相似系數(shù)0.56水平上，紋枯病菌菌株間毒力差異和AFLP聚類(lèi)有一定程度的一致性。

由于R.solani的異核現(xiàn)象導(dǎo)致了其多變性，即使是屬于同一融合亞群的水稻紋枯病菌的菌株間也存在致病性變異與生理分化現(xiàn)象。盡管目前對(duì)紋枯病菌克服水稻抗病性可能是由于遺傳改變導(dǎo)致新致病性類(lèi)型產(chǎn)生的推論還沒(méi)有充足的證據(jù)，但是病菌遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜的群體顯然更容易克服寄主的抗病性，因此揭示紋枯病菌的真實(shí)遺傳背景必然有助于減少水稻抗紋枯病育種的盲目性，提高品種布局的合理性，從而利于增加抗病品種的持久性。目前，運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)水稻紋枯病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但是要解決水稻紋枯病抗性弱的問(wèn)題，必須進(jìn)一步監(jiān)測(cè)水稻紋枯病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，掌握其變化動(dòng)態(tài)和潛在的變化趨勢(shì)，同時(shí)也要明確水稻抗性品種的防御機(jī)制，并將水稻紋枯病菌遺傳結(jié)構(gòu)和水稻抗病品種遺傳特性結(jié)合起來(lái)進(jìn)行研究，這種研究策略才更科學(xué)、更有意義。