姚占軍　王嘉瑞　藺瑞明　馮　晶　徐世昌

摘要本試驗(yàn)對(duì)小麥胚芽鞘體細(xì)胞染色體制片技術(shù)進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明，利用小麥胚芽鞘細(xì)胞可以獲得理想的染色體制片，而且具有切取胚芽鞘對(duì)小麥個(gè)體植株傷害小，胚芽鞘體積大、分裂相多，易于制片，鏡下觀察染色體較大，雜質(zhì)少，背景清晰等特點(diǎn)，可滿足染色體核型分析和染色體分帶的技術(shù)要求。初步建立起以小麥胚芽鞘為取樣對(duì)象的體細(xì)胞染色體制片方法。

關(guān)鍵詞小麥；胚芽鞘；染色體制片

中圖分類號(hào)Q 942

普通小麥通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交等手段獲得外源染色體(質(zhì))后，會(huì)導(dǎo)致個(gè)體的表型、染色體組成和結(jié)構(gòu)特征等多方面的改變，表現(xiàn)為分離大、類型多、穩(wěn)定慢的特點(diǎn)。無(wú)論是轉(zhuǎn)移外源基因還是應(yīng)用外源基因，都需要對(duì)外源染色質(zhì)進(jìn)行可靠、有效的檢測(cè)，因此對(duì)外源染色體(質(zhì))的檢測(cè)貫穿了小麥遠(yuǎn)緣雜交的整個(gè)過(guò)程。外源染色體(質(zhì))檢測(cè)的基本手段是細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。細(xì)胞學(xué)檢測(cè)基礎(chǔ)是染色體制片技術(shù)，而影響制片的因素很多，其中最基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)就是取材。傳統(tǒng)的取材對(duì)象是小麥初生根的根尖(生長(zhǎng)點(diǎn))。由于小麥初生根數(shù)量有限，且對(duì)小麥個(gè)體損傷較大，因此謀求新的取材對(duì)象很有必要。

禾谷類作物種子萌發(fā)有3個(gè)階段，即種子吸脹、細(xì)胞分裂、芽鞘的伸長(zhǎng)。以往研究認(rèn)為成熟小麥種子中胚芽鞘已經(jīng)分化完畢，胚芽鞘伸長(zhǎng)過(guò)程實(shí)質(zhì)是后期的細(xì)胞擴(kuò)大，而沒(méi)有細(xì)胞分裂參與。對(duì)此鄒琦等曾解釋，胚芽鞘細(xì)胞在胚中已分化完成，一旦開(kāi)始生長(zhǎng)便不再進(jìn)行細(xì)胞分裂增殖，胚芽鞘的生長(zhǎng)僅是細(xì)胞伸長(zhǎng)，認(rèn)為胚芽鞘伸長(zhǎng)與膨壓有關(guān)，膨壓增加提供了胚芽鞘伸長(zhǎng)延伸的動(dòng)力。然而，陸長(zhǎng)梅等在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了在黃化小麥(Triticum aestivumL.)胚芽鞘中發(fā)現(xiàn)了正在分裂的細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)為小麥胚芽鞘細(xì)胞學(xué)行為研究提供了新信息。迄今為止，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到針對(duì)小麥胚芽鞘細(xì)胞染色體制片技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)以小麥胚芽鞘為取材對(duì)象，開(kāi)展了體細(xì)胞染色體制片技術(shù)的探索，旨在為細(xì)胞學(xué)研究提供新技術(shù)。

1材料與方法

1.1小麥材料

小麥材料為中國(guó)春ph1b與中4雜交選育出的小麥抗條銹病品系P58-2，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所條銹組提供。

1.2試劑

(1)卡諾固定液V(無(wú)水乙醇)：V(冰醋酸)=3：1；(2)0.1mol/LHC1；(3)45％冰醋酸；(4)染色液：改良苯酚品紅染液。

1.3小麥胚芽鞘細(xì)胞制片

染色體制片采用常規(guī)的壓片技術(shù)結(jié)合去壁低滲火焰干燥技術(shù)，并加以改進(jìn)。

1.3.1小麥種子萌發(fā)

室溫或恒溫箱(25℃)浸泡若干P58—2種子至露白(胚根鞘突破種皮，圖1a)，置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于4℃下處理24～48h后，再移到室溫或恒溫箱(25℃)培養(yǎng)。

1.3.2預(yù)處理

待胚芽鞘長(zhǎng)到種子長(zhǎng)度一半至全長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行離體預(yù)處理。取材時(shí)間在09:00～11:00，用刀片剝開(kāi)胚芽鞘(刀片垂直于胚芽鞘)，用鑷子輕輕捏住胚芽鞘基部上提，取下胚芽鞘置于冰水混合物中，在4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行預(yù)處理12～24h。

1.3.3固定和保存

將預(yù)處理后的胚芽鞘用卡諾氏固定液在4℃冰箱中固定12～24h，轉(zhuǎn)保存于70％乙醇中備用(-20℃冰箱長(zhǎng)期存放)。

1.3.4解離和染色

將固定好的胚芽鞘用蒸餾水清洗20～30min，用濾紙吸干胚芽鞘上的浮水，浸于在60℃的水浴鍋中預(yù)熱的1mol/L HC1，解離3～5min(因材料、季節(jié)而異)去細(xì)胞壁，取出用蒸餾水清洗15～20min；取適量材料用45％冰醋酸直接壓片，火焰干燥后，相差顯微鏡下觀察；或用改良卡寶品紅染色15～20min，取適量材料用45％冰醋酸壓片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

2結(jié)果與討論

通過(guò)與小麥傳統(tǒng)的根尖體細(xì)胞制片相比，觀察發(fā)現(xiàn)胚芽鞘體細(xì)胞制片也是行之有效的，而且具有如下特點(diǎn)：(1)切取胚芽鞘對(duì)小麥個(gè)體植株傷害小。傳統(tǒng)取材對(duì)象是小麥初生根根尖(生長(zhǎng)點(diǎn))，而種子萌發(fā)到離乳期之前，初生根在吸收水分和無(wú)機(jī)鹽等方面作用明顯，一旦截取將嚴(yán)重影響小麥幼苗生長(zhǎng)；胚芽鞘是作物子葉應(yīng)對(duì)生長(zhǎng)初期逆境的保護(hù)組織，自然條件下胚芽鞘見(jiàn)光后即停止生長(zhǎng)，由于胚芽鞘存在時(shí)間短，功能相對(duì)簡(jiǎn)單，營(yíng)養(yǎng)消耗小，因此胚芽鞘剝離后胚芽仍可生長(zhǎng)，且對(duì)小麥個(gè)體植株生長(zhǎng)傷害相對(duì)較小(圖1)。(2)胚芽鞘體積大、分裂相多，便于取材。在小麥種子發(fā)芽過(guò)程中，整個(gè)胚都要萌動(dòng)即都有分裂相。雖然胚根生長(zhǎng)先于胚芽包括胚芽鞘，但胚芽鞘生長(zhǎng)速度會(huì)越來(lái)越快。傳統(tǒng)的根尖取材時(shí)問(wèn)是當(dāng)根尖長(zhǎng)到0.5～1.5cm時(shí)取材，這時(shí)胚芽鞘也長(zhǎng)到接近種子的長(zhǎng)度或稍短，此時(shí)胚芽鞘的體積要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于小麥3條初生根根尖體積的總和，胚芽鞘內(nèi)處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞總數(shù)多于根尖，更利于小麥細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。(3)胚芽鞘體細(xì)胞更易于制片。自然條件下，根需要不斷下扎，由于根尖細(xì)胞長(zhǎng)期的進(jìn)化，使其木質(zhì)化程度提高。而胚芽鞘是一片不完全葉，胚芽鞘細(xì)胞木質(zhì)化程度相對(duì)較低，故而HC1水解或混酶(果膠酶、纖維素酶和解離酶)解離細(xì)胞壁處理時(shí)間相應(yīng)縮短，較根尖細(xì)胞解離時(shí)間縮短一半。因此，胚芽鞘細(xì)胞制片操作方便快捷，染色體易分散，更容易獲得良好制片。(4)與傳統(tǒng)的根尖體細(xì)胞染色體制片相比，胚芽鞘體細(xì)胞鏡下觀察染色體較大，雜質(zhì)少，背景清晰，更適于染色體核型分析和染色體分帶(圖2)的技術(shù)要求。

控制預(yù)處理時(shí)間。預(yù)處理是染色體制片技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。普通小麥通過(guò)遠(yuǎn)緣或近緣雜交后代分離出的類型很多，種子發(fā)芽勢(shì)亦有不同。因此，預(yù)處理時(shí)間應(yīng)根據(jù)材料的不同而異，一般預(yù)處理時(shí)間為24～72h。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，種子萌發(fā)傾向于普通小麥的程度越大，預(yù)處理時(shí)間應(yīng)越短，但不能少于24h；反之，種子萌發(fā)傾向于遠(yuǎn)緣或近緣物種的程度越大，預(yù)處理時(shí)間應(yīng)越長(zhǎng)，但不要超過(guò)72h。對(duì)于具體的某一小麥材料，若要確定其預(yù)處理時(shí)間，可設(shè)不同時(shí)間梯度確定。

控制HC1水解處理時(shí)間。HC1能解離細(xì)胞壁之間的果膠物質(zhì)及部分細(xì)胞質(zhì)。由于HC1直接作用于胚芽鞘細(xì)胞壁，解離充分與否直接關(guān)系到制片的好壞。解離不充分，制片時(shí)細(xì)胞不易分散，染色體集中成團(tuán)；解離過(guò)于充分，制片時(shí)細(xì)胞易破碎，染色體易斷裂，得不到好的制片。本試驗(yàn)將固定好的胚芽鞘用蒸餾水清洗20～30min，放入1mol/LHC1中在60℃水浴鍋中解離3～5min，獲得較為理想的解離效果。但因處理材料、季節(jié)以及水浴鍋精確度等因素而異，應(yīng)設(shè)不同時(shí)間梯度來(lái)確定各自的解離時(shí)間。

小麥胚芽鞘取材過(guò)程中要盡量減少對(duì)萌發(fā)種子的損傷，應(yīng)做到穩(wěn)、準(zhǔn)、狠。(1)已萌發(fā)種子各器官都比較脆弱，特別是胚芽易折斷，取材時(shí)下手一定要穩(wěn)；(2)胚芽鞘緊貼子葉，取材時(shí)下手一定要準(zhǔn)，以免傷到子葉；(3)胚芽鞘取材下手一定要狠，即取材要干脆利落，縮短操作時(shí)間；(4)取材時(shí)間在09:00～11:00，因?yàn)檫@段時(shí)間細(xì)胞分裂最旺盛。

3結(jié)論

研究表明利用小麥胚芽鞘細(xì)胞可以獲得理想的染色體制片，并初步建立起以小麥胚芽鞘為取樣對(duì)象的體細(xì)胞染色體制片方法。該方法具體操作步驟為：(1)在25℃恒溫箱內(nèi)浸泡小麥種子至露白，置于墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)于4℃下處理24～48h，再轉(zhuǎn)到24～25℃下發(fā)芽；(2)待胚芽鞘長(zhǎng)到種子長(zhǎng)度一半至全長(zhǎng)時(shí)，于09:00～11:00取樣，置冰水混合物中預(yù)處理12～24h，再用卡諾固定液固定12～24h后，保存于70％乙醇中備用；(3)固定好的材料用蒸餾水清洗20～30 min，濾紙吸干覆水，放入1mol/L HC1中置于60℃水浴鍋解離3～5min，自來(lái)水清洗15～20min；(4)取適量材料用45％冰醋酸直接壓片，火焰干燥后，相差顯微鏡下觀察；或用改良卡寶品紅染色15～20min，取適量材料用45％冰醋酸壓片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。