孫 雪 梁建慶 何建成 馬利芳

帕金森病(parkinson disease，PD)是一種以靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)減少及體位障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。黑質(zhì)-紋狀體多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失和胞質(zhì)內(nèi)路易小體(Lewy body) 的形成是PD主要病理改變[1]。目前，PD確切的病因病機(jī)尚未可知，而隨著PD發(fā)生率的不斷攀升，該領(lǐng)域的研究備受人們關(guān)注。論及PD的研究必離不開實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備。PD的動(dòng)物模型主要分為神經(jīng)毒素模型和轉(zhuǎn)基因模型兩大類。神經(jīng)毒素模型作為PD經(jīng)典模型，主要針對(duì)DA信號(hào)模擬PD大部分病理和表型[2]。與基因模型比較，神經(jīng)毒素動(dòng)物模型病理機(jī)制更加清楚，造模方法更加完善。遺傳基因動(dòng)物模型的制備不僅復(fù)雜耗時(shí)且極易產(chǎn)生不良反應(yīng)[3,4]。各種動(dòng)物模型的制備都是模擬PD部分病理改變，有其各自的優(yōu)勢(shì)和局限性。本文針對(duì)國(guó)內(nèi)外PD神經(jīng)毒素實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的制備方法及相關(guān)原理進(jìn)行綜述，以期能進(jìn)一步了解PD病理過程，為科研實(shí)驗(yàn)提供最優(yōu)方案。

一、6-羥基多巴胺損傷動(dòng)物模型

6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)是特異性的兒茶酚胺能神經(jīng)毒素。6-OHDA雖受血-腦脊液屏障阻擋，但其對(duì)DA質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有高親和力，可通過觸發(fā)氧化應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞毒性和小膠質(zhì)細(xì)胞依賴性DA神經(jīng)元炎癥，發(fā)揮毒性作用[5]。

1.作用機(jī)制：目前6-OHDA神經(jīng)毒素作用的確切機(jī)制并未完全明了，已有研究表明6-OHDA的機(jī)制與氧化應(yīng)激和抑制線粒體呼吸鏈有關(guān)。6-OHDA可與DA轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合進(jìn)入黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元，經(jīng)過多重氧化，最終損傷細(xì)胞。6-OHDA還可通過抑制線粒體呼吸酶復(fù)合體，阻斷電子傳遞鏈，增加氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈被抑制，最終細(xì)胞內(nèi)ATP耗盡引起細(xì)胞死亡[6,7]。

2.6-OHDA損傷動(dòng)物模型：6-OHDA因受血-腦脊液屏障阻礙，造模需要腦內(nèi)注射。腦內(nèi)注射為立體定向注射，注射部位多為黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta，SNc)、紋狀體(corpora striate，CS)、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventraltegmental area，VTA)、前腦內(nèi)側(cè)束(medial forebrainbundle，MFB)，通常采用單點(diǎn)或雙點(diǎn)注射法來制備單側(cè)或雙側(cè)損毀的PD模型[8]。6-OHDA的劑量、濃度及損毀位點(diǎn)的選擇都會(huì)影響PD模型的最終呈現(xiàn)。

3.6-OHDA損傷動(dòng)物模型優(yōu)劣性：6-OHDA的單側(cè)損毀方法成熟簡(jiǎn)單，存活率高，模型評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)便。模型動(dòng)物腹腔注射阿樸嗎啡(或苯丙胺)不自主的向健側(cè)(或傷側(cè))旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)行為可評(píng)估6-OHDA對(duì)黑質(zhì)DN損傷程度。單點(diǎn)注射常用方法主要包含SNc、CS、VTA、MFB位點(diǎn)的注射，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。SNc的單點(diǎn)注射可以根據(jù)6-OHDA注入內(nèi)部劑量的多少，而相應(yīng)制作出急性完全和部分損傷的模型。這種方法的劣勢(shì)為SNc的范圍小，定位困難，成功率較低，且難以區(qū)分最后的結(jié)果是毒性損傷還是機(jī)械損傷造成[9]。CS分布廣，易定位，DA能神經(jīng)元末梢吸收6-OHDA后，發(fā)生逆行性變性，從而破壞中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元[10]。VTA是制備PD模型的重要靶點(diǎn)，注入后可增加大鼠模型旋轉(zhuǎn)強(qiáng)度，方法簡(jiǎn)單易成功，但與人類PD病理特征不相符[11]。MFB的位置較深，定位困難，易發(fā)生變異，成功率較低。MFB多點(diǎn)注射可以提高造模的成功率，縮短周期，廣泛的浸潤(rùn)損傷可以大量破壞DA能神經(jīng)元，模擬出中晚期癥狀。此方法雖然提高了模型的穩(wěn)定性和成功率，但其損傷重并不完全符合發(fā)病機(jī)制。6-OHDA的注射劑量決定模型DA紋狀體通路病變及紋狀體DA的顯著下降程度[12]。綜上所述，6-OHDA模型的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在絕佳的評(píng)估方法上，通過一側(cè)損毀，出現(xiàn)對(duì)側(cè)行為癥狀來評(píng)斷模型成功與否。其劣勢(shì)為病死率較高，不能完全模擬PD的發(fā)病機(jī)制。

二、1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶動(dòng)物模型

1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(1-methy l-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydoyndine,MPTP)是一種本身沒有毒性的脂溶性有機(jī)化合物，其能通過血-腦脊液屏障。MPTP在大腦中代謝產(chǎn)生有毒物質(zhì)1-甲基-4-苯基呲啶離子(MPP+)，引起毒性機(jī)制。

1.作用機(jī)制：MPTP作為高親脂性化合物，能有效地透過血-腦脊液屏障。在腦內(nèi)，先是被細(xì)胞線粒體外膜的單胺氧化酶B(MAO-B)催化變成中間代謝產(chǎn)物1-甲基-4苯基-2,3-二氫呲啶離子(MPDP+)，后自發(fā)氧化成毒性的MPP+。MPP+的結(jié)構(gòu)與DA類似，能夠與多巴胺能轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)高度親和，被紋狀體內(nèi)多巴胺能(DAG)神經(jīng)元軸突末梢突觸前膜的DAT運(yùn)載進(jìn)入胞體內(nèi)[13,14]。

2.MPTP動(dòng)物模型優(yōu)劣性：MPTP的PD動(dòng)物模型會(huì)因不同的給藥方式、給藥時(shí)間呈現(xiàn)出不同的病理特征。MPTP動(dòng)物模型通常采用腹腔內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射的方式制備。這種給藥方法操作相對(duì)簡(jiǎn)便易行，模型代表性好，成功率也高。目前MPTP最常用的PD動(dòng)物是小鼠動(dòng)物模型，因其病理生理機(jī)制與PD吻合度較高，備受青睞。各種PD小鼠模型根據(jù)注射劑量、間隔時(shí)間、方式以及時(shí)間長(zhǎng)短的不同來制備不同研究目的模型，主要分為急性模型、亞急性模型和慢性模型[15]。急性模型是采用腹腔或皮下注射，間隔時(shí)間短，建模速度快，損傷嚴(yán)重，但其模型并不符合PD慢性發(fā)病的特點(diǎn)，并且這種建模方法并非神經(jīng)元慢性凋亡而是快速損傷壞死，病死率相對(duì)較高。亞急性模型同樣也采用腹腔注射或皮下注射的方式，間隔時(shí)間較急性長(zhǎng)，建模速度一般，成活率較高，損傷比急性輕，并且具有PD一定的發(fā)病特點(diǎn)，DAG神經(jīng)元有部分凋亡。亞急性模型的缺點(diǎn)是損傷時(shí)間比急性模型長(zhǎng)，病理機(jī)制與PD患者慢性發(fā)病機(jī)制差別比較大，其損傷的DAG神經(jīng)元有部分凋亡的同時(shí)還有大量壞死[16]。經(jīng)目前研究表明，不管是急性還是亞急性，都只是一個(gè)短暫的對(duì)于黑質(zhì)-紋狀體神經(jīng)元容易發(fā)生逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)毒性作用，這種快速的方法無法與緩慢、漸進(jìn)性的PD相匹配[17]。慢性模型除了給藥時(shí)間間隔長(zhǎng)，其病死率非常低，癥狀典型穩(wěn)定，且病理損傷過程穩(wěn)固不易恢復(fù)，與PD的病理生理過程相符合。綜上所述，不管哪種MPTP方案都只能是部分模擬PD的病理機(jī)制，完全模擬PD的運(yùn)動(dòng)障礙仍存在困難。

三、魚藤酮?jiǎng)游锬Ｐ?/h2>

魚藤酮是屬異黃酮家族的一種植物性殺蟲劑。研究表明，用魚藤酮染毒可誘發(fā)動(dòng)物出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩、僵直、震顫等類似PD的典型臨床癥狀；用魚藤染毒小鼠在黑質(zhì)紋狀體的細(xì)胞中也可出現(xiàn)α突觸蛋白(α-synuclein) 聚集和DA神經(jīng)元的丟失現(xiàn)象[18]。

1.作用機(jī)制：目前關(guān)于魚藤酮導(dǎo)致PD的發(fā)病機(jī)制還不是十分清晰，尚認(rèn)為其可能主要從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、神經(jīng)炎性反應(yīng)方面導(dǎo)致PD的發(fā)生[19]。魚藤酮的脂溶性，可通過血-腦脊液屏障及生物膜，繼而選擇性地與線粒體復(fù)合物Ⅰ結(jié)合，破壞氧化磷酸化，誘發(fā)氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。

2.魚藤酮?jiǎng)游锬Ｐ蛢?yōu)劣性：魚藤酮PD大鼠動(dòng)物模型最大的優(yōu)勢(shì)為PD模型行為學(xué)改變和病理學(xué)特征均與臨床PD相似。魚藤酮模型的慢性暴露方式在病理、生化等各方面均能較好地模擬PD相關(guān)特征[20]。但魚藤酮的全身毒性致使PD動(dòng)物模型存在成模率低、成本高、方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。魚藤酮模型給藥方式較多，優(yōu)劣各異。腦立體定位給藥的造模方法較難，需定位準(zhǔn)確，但其病死率低，成功率高。靜脈給藥方式的存活率相對(duì)其他大劑量的存活率高，方法簡(jiǎn)單，藥物直接進(jìn)入全身循環(huán)，但全身毒性大。腹腔注射造模，吸收面積大，成模率高，操作簡(jiǎn)便，不僅癥狀與PD患者相似，且能制備PD的胃腸功能障礙模型[21]。皮下注射的方式更為便捷，成本低，成模率高，但皮下注射會(huì)引起大鼠全身毒性，導(dǎo)致較高病死率，且不符合PD病變特點(diǎn)?？诜炷７螾D慢性進(jìn)行性病程，還避免了外周毒性，該方式病死率低，成模率高，適于研究PD病機(jī)病程變化及治療藥物的作用機(jī)制。魚藤酮?jiǎng)游锬Ｐ透螾D病理進(jìn)程，黑質(zhì)-紋狀體通路及腸道神經(jīng)元均出現(xiàn)路易小體，其明顯的劣勢(shì)為動(dòng)物病死率過高。由此可見，對(duì)于選擇魚藤酮造模方法要根據(jù)實(shí)際操作進(jìn)一步選擇。

四、百草枯動(dòng)物模型

百草枯(paraquat，PQ)是一種與MPP+結(jié)構(gòu)相似，與MPTP神經(jīng)毒性相似的快速滅生性除草劑。百草枯機(jī)制尚不明確，但其可通過血-腦脊液屏障到達(dá)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，選擇性地破壞黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元，最終產(chǎn)生類似于PD的癥狀[22]。

1.作用機(jī)制：百草枯是PD病因的外源性神經(jīng)毒素，長(zhǎng)期低劑量暴露于百草枯會(huì)造成DA能神經(jīng)易損。PQ的神經(jīng)毒性機(jī)制尚不明確，但就目前研究認(rèn)為可能是：①激活星形膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放致炎細(xì)胞因子：細(xì)胞外基質(zhì)降解加速神經(jīng)元損傷及毛細(xì)血管基膜膠原成分降解破壞血-腦脊液屏障增加通透性，最終腦損害加重；②氧化應(yīng)激：自由基作用形成過氧化物，對(duì)DNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)生氧化損傷；③抑制線粒體功能。黑質(zhì)和紋狀體中線粒體功能障礙，致使細(xì)胞凋亡加速加重，黑質(zhì)區(qū)TH神經(jīng)元數(shù)目減少，甚至腦組織有壞死空腔形成。

2.百草枯動(dòng)物模型的優(yōu)劣性：百草枯動(dòng)物模型的制備主要是模擬了人類暴露于百草枯的方式。這種方法更符合環(huán)境因素誘發(fā)的PD患者。商用百草枯水劑成本低，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，符合PD慢性進(jìn)程的特點(diǎn)。這種模型制備方式若單純使用百草枯造模會(huì)導(dǎo)致小鼠病死率增高，同時(shí)加上抗纖維化的藥物會(huì)使模型更易制備。但部分實(shí)驗(yàn)用百草枯造模時(shí)并未提及它致死率的高低，以及造模時(shí)是否有必要給予抗纖維化的藥物用以預(yù)防其毒性不良反應(yīng)的發(fā)生，其科學(xué)性與可行性有待討論[23]。腹腔、腦內(nèi)或皮下注射以及口服百草枯的方法均可制備百草枯PD模型。單次或短期較高劑量多次注射百草枯可誘導(dǎo)出神經(jīng)元壞死的模型，但這種方式與長(zhǎng)期暴露于百草枯的致病方式相悖，且這種百草枯試劑價(jià)格昂貴。腦內(nèi)注射需借助腦立體定位儀，模型成功率較低，過程復(fù)雜，有一定技術(shù)難度?？诜俨菘莸闹苽浞绞礁臃先祟惖闹饕?jīng)口暴露方式，但這種方式建立PD模型的研究國(guó)內(nèi)報(bào)道較為罕見。而口服百草枯造模和腹腔注射百草枯造模兩者間比較, 腹腔注射造模效果更好，行為學(xué)改變更為顯著。所以運(yùn)用百草枯動(dòng)物模型的具體方法要根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)操作慎重選擇。

五、展 望

4種神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型各有所長(zhǎng)。不同的造模方法、給藥方式及劑量均會(huì)影響模型作用機(jī)制與實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立一個(gè)穩(wěn)定、成功率高、簡(jiǎn)便易行的模型是構(gòu)建PD模型亟待解決的問題。目前PD的致病因素和發(fā)病機(jī)制尚不明確，但基因突變、環(huán)境等多種致病因素與PD密切相關(guān)。神經(jīng)毒性藥物模型在PD的相關(guān)研究中具有廣闊前景，但現(xiàn)在所掌握的模型制備方法都沒有PD明顯的病理改變，僅有局限的生化反應(yīng)，想要模擬出完備的PD動(dòng)物模型仍需要進(jìn)一步探討研究。相信在未來，PD動(dòng)物模型能完全符合PD這一神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病的自然進(jìn)程。隨著PD“基因時(shí)代”的來臨，基因模型尚未被證實(shí)是否復(fù)制了PD的大部分主要特征，但神經(jīng)毒素和基因模型的結(jié)合對(duì)于挖掘人類PD機(jī)制與治療不可或缺，值得深入探討。