張選奮　李薈元　魯開化　郭樹忠　李向東

張選奮男，1965年生。蘭州醫(yī)學(xué)院副教授、副主任醫(yī)師?，F(xiàn)在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院整形外科中心從師李薈元教授和魯開化教授攻讀博士學(xué)位。已發(fā)表論文16篇。

［摘要］目的：探討蛋白激酶A在TGF-β₁刺激增生性瘢痕和正常人皮膚成纖維細(xì)胞(HS-FB和NS-FB)合成膠原中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。方法：利用³²P摻入底物法測(cè)定TGF-β₁刺激的HS-FB和NS-FB的PKA活性，³ H-脯氨酸摻入法和放射免疫法測(cè)定膠原合成能力。結(jié)果：NS-FB被TGF-β₁刺激后PKA的活性短暫升高后很快恢復(fù)，HS-FB則在30～60min降低(P＜0.05)。TGF-β₁對(duì)兩種細(xì)胞有加速合成膠原的作用(30min后P＜0.05)，HS-FB的合成能力比NS-FB強(qiáng)(刺激60min后P＜0.05)。cAMP有抑制作用(60min后P＜0.05)，H7則有擬TGF-β₁作用(與對(duì)照比較時(shí)30min后P＜0.05)，而H7可增強(qiáng)TGF-β₁刺激的作用(30～60min時(shí)P＜0.05)。結(jié)論：TGF-β₁刺激兩種細(xì)胞后PKA的活性變化提示cAMP/PKA通道參與介導(dǎo)TGF-β₁信號(hào)：TGF-β₁對(duì)HS-FB的短期刺激作用與PKA活性降低有關(guān)，但長(zhǎng)期刺激作用與PKA通道活性變化無關(guān)；cAMP/PKA活化可以抑制FB合成膠原。［關(guān)鍵詞］信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶A轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β₁成纖維細(xì)胞膠原合成

［中圖分類號(hào)］R619+.6［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A［文章編號(hào)］1008-6455(2001)01-0009-04

THE EFFECTS OF ACTIVITY OF PROTEIN KINASE A IN TGF-β₁ STIMULATING

COLLAGEN SYNTHESIS OF NORMAL SKIN AND HYPERTROPHIC SCAR FIBROBLASTS

ZHANG Xuan-fenLU Kai-huaLI Hui-yuan et al

Center of Plastic Surgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University.(Xian,Shanxi 710032)

［Abstract］Objective：To investigate the effects of protein kinase A(PKA)in TGF-β₁ stimulating collagen synthesis of normal skin and hypertrophic scar fibroblast(NS-FB and HS-FB).Methods：The activity of PKA of HS-FB and NS-FB was detected by 32P incorporation assay.Total collagen synthesis was measured by ³H-proline incorporation assay and radioimmunoassay.Results：The activity of PKA of NS-FB rose temporarily insigmificantly and recovered soon while the ones of HS-FB decreased and recovered at lh the stimulation of TGF-β₁(P＜0.05).TGF-β₁ could enhance collagen synthesis of FB(P＜0.05 at stimulating 30 minutes later) but the effects were stronger in HS-FB(〖WTBX〗P＜0.05 at stimulating 60 minutes later).cAMP could inhibit the changes (P＜0.05 at stimulation 60 minutes) while H7 could improve roles of TGF-β₁(P＜0.05 at 30～60minutes of stimulation).Conclusion：The changes of the PKA activity of the two types of cell after the stimulation of TGF-β₁ might implicate that there was difference in the PKA signal pathway.The effects of TGF-β₁ stimulating collagen synthesis might have partly relation to cAMP/PKA pathway but activating cAMP/PKA signal pathway could abrogate FB to synthesize collagen.

［Key words］Signal TransductionProtein Kinase ATGF-β₁FibroblastCollagen Synthesis

瘢痕增生是血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial Cell,簡(jiǎn)稱EC)^〔1〕、血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cell,簡(jiǎn)稱VSMC)〔2，3〕和成纖維細(xì)胞(Fibroblast簡(jiǎn)稱FB)^〔4〕等瘢痕形成相關(guān)細(xì)胞增埴加速和合成大量細(xì)胞外基質(zhì)所致。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β₁ (TGF-β₁)能強(qiáng)烈刺激FB、EC和VSMC等合成細(xì)胞外基質(zhì)。而cAMP/PKA途徑活化對(duì)許多細(xì)胞合成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)有抑制作用。先前我們研究了TGF-β₁刺激FB增殖中PKA所起的作用^〔5〕，本文的目的是研究TGF-β₁刺激增生性瘢痕和正常人皮膚成纖維細(xì)胞(Hypertrophic Scar Fibroblast,HS-FB和Normal Skin Fibroblast,NS-FB)合成膠原與PKA活性間的關(guān)系。

1材料和方法

1.1材料ケ甌荊涸鏨性瘢痕(HS)和正常人皮膚組織(各4例)來自我院手術(shù)病例。二者在年齡、性別和部位等方面匹配。原代培養(yǎng)用組織塊法。實(shí)驗(yàn)用4～10代細(xì)胞。ナ約粒簂eupeptin、aprotanin、H7和PMSF購自sigma公司。PKA檢測(cè)kit、cAMP和TGF-β₁購自Promega公司。蛋白質(zhì)定量kit購自Bio-RAD公司。³ H-脯氨酸購自北京原子能研究院。［-32 P］ATP(3000ci/m mol)購自北京亞輝生物公司。Ⅲ型前膠原測(cè)定試劑盒購自重慶腫瘤研究所。DMEM購自Hyclone公司。其它試劑均為分析純或更純。ヒ瞧鰨築eckman GS-15R冷凍高速離心機(jī)；Polytron 超聲勻漿儀；Beckman LS6500液閃儀；Perkin Elmer Lambda14紫外可見光分光光度計(jì)等。

1.2方法

1.2.1PKA活性測(cè)定TGF-β₁刺激的時(shí)間為10、30、60和120min，按我們先前的方法^〔5〕測(cè)定。

1.2.2膠原合成測(cè)定³ H-脯氨酸摻入實(shí)驗(yàn)：接種細(xì)胞2.5×107/ml(10%胎牛血清的DMEM制備細(xì)胞懸液)于96孔板，每孔100μl，置于5%CO₂，100%濕度，37℃培養(yǎng)48h。0.5%胎牛血清的DMEM饑餓細(xì)胞24h。分別用0.5%胎牛血清的DMEM稀釋的TGF-β₁5ng/ml、H7250μM、cAMP0.025mM和TGF-β₁5ng/ml+H7 250μM刺激10、30、60和120min，0.5%胎牛血清的DMEM為陰性對(duì)照。刺激后吸棄上清液，直接加入100μl³ H-脯氨酸5m ci/L(含維生素C 50mg/L、β₁-氨基丙腈100mg/L和10%胎牛血清的DMEM)，培養(yǎng)24h，棄上清，消化細(xì)胞，多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上，加閃爍液，液閃計(jì)數(shù)。ゴ送猓為了研究較長(zhǎng)時(shí)間刺激的效應(yīng)，我們還做了刺激12h和24h的反應(yīng)。ド锨逡呵阿笮徒涸(PCⅢ)測(cè)定：細(xì)胞培養(yǎng)和刺激與³ H-脯氨酸摻入實(shí)驗(yàn)相同。刺激后，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)48h，小心吸取培養(yǎng)上清液，-20℃保存，兩周內(nèi)檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，于1.5ml離心管中加入上清液100μl和人PCⅢ抗體200μl，4℃放置20h，加125I-hPCⅢ100μl，4℃放置6h，加分離劑(混勻后)200μl，室溫30min，1400g離心30min，吸棄上清液，沉淀物作放射計(jì)數(shù)。查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到PCⅢ的濃度。

2結(jié)果

2.1PKA活性變化TGF-β₁刺激后PKA的活性變化見圖1。TGF-β₁刺激NS-FB后PKA的活性短暫升高，30min內(nèi)恢復(fù)，但P＞0.05；而HS-FB被刺激后酶活性降低(30～60min時(shí)P＜0.05)，1h內(nèi)恢復(fù)到對(duì)照水平。

圖1TGF-β₁刺激HS-FB和NS-FB后PKA的活性變化

2.2膠原合成能力測(cè)定結(jié)果³ H-脯氨酸摻入結(jié)果：見圖2和圖3。TGF-β₁可增強(qiáng)兩種細(xì)胞的膠原合成(30min后〖WTBX〗P＜0.05)，TGF-β₁對(duì)HS-FB的刺激作用強(qiáng)于NS-FB(刺激60min后P＜0.05)。而cAMP則有抑制作用(60min后P＜0.05)，H7有擬TGF-β₁作用(與TGF-β₁比較：P＞0.05，與對(duì)照比較：30min后〖WTBX〗P＜0.05)，且H7可以部分增強(qiáng)TGF-β₁刺激的作用(30～60min時(shí)P＜0.05)。TGF-β₁等作用后兩種細(xì)胞合成膠原能力在各時(shí)間點(diǎn)沒有顯著性差異。

上清液PCⅢ測(cè)定結(jié)果：見附表。不同時(shí)間刺激后PCⅢ的濃度變化規(guī)律與³ H-脯氨酸摻入實(shí)驗(yàn)一致。

3討論

創(chuàng)傷后組織修復(fù)過程有多種細(xì)胞因子和多種細(xì)胞參與。細(xì)胞因子作用于細(xì)胞后其增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、凋亡、合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)等生物學(xué)行為變化已有較多的研究。在這些研究中，細(xì)胞因子刺激后細(xì)胞內(nèi)(胞膜、胞漿和胞核)的變化過程被作為"黑箱"處理而未予研究。但是，在體內(nèi)細(xì)胞處于的相當(dāng)復(fù)雜的微環(huán)境中，眾多因素的共同刺激如何引起細(xì)胞行為變化?細(xì)胞對(duì)眾多的刺激是如何處理的?這必然涉及細(xì)胞外刺激信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的過程。cAMP/PKA信號(hào)通道是較早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)信息代謝途徑之一。PKA為依賴cAMP的蛋白激酶，廣泛存在于各種細(xì)胞內(nèi)，其活性主要受胞內(nèi)cAMP濃度的影響。毛喉素(Forsklin)活化腺苷酸環(huán)化酶和IBMX(3-isobutyl-1-methyl-xanthene)、茶鹼等抑制磷酸二酯酶而提高cAMP濃度，此外，一些cAMP的類物如8-溴-cAMP、dcAMP(dibutyryl cAMP)等也有擬cAMP作用。生理性的失活主要是被磷酸酶脫磷酸化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)H7、H-89或其假底物肽m-phi等可抑制PKA活化。胞外的多種刺激也可活化或抑制PKA的活性。PKA活化后能影響細(xì)胞蛋白的磷酸化而改變細(xì)胞膜的通透性，調(diào)控細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、合成和分泌物質(zhì)如膠原等細(xì)胞外基質(zhì)等。Berman^〔6〕等發(fā)現(xiàn)己酮可可鹼(Pentoxifylline PTX)能全面抑制皮膚FB合成膠原、糖胺聚糖和FN，還增加膠原酶活性而發(fā)揮抗纖維化的作用。近年來，Chen^〔3〕等也證實(shí)PTX呈cAMP依賴性抑制bFGF和PDGF-AB誘導(dǎo)的VSMC表達(dá)前膠原Ⅰ(α₁)和前膠原Ⅲ(α₁)mRNA，也抑制TGF-β₁引起的膠原合成。8-溴cAMP和毛喉素能模仿PTX的作用而H-89、m-phi PKA能阻斷PTX的作用；顯然，PTX的作用經(jīng)由cAMP/PKA通道介導(dǎo)。ノ頤塹慕峁也支持這些觀點(diǎn)：cAMP可抑制HS-FB和NS-FB的膠原合成和釋放而H7則有促進(jìn)作用，且H7還能增強(qiáng)TGF-β₁的短期刺激作用，而此時(shí)正好是TGF-β₁刺激HS-FB后PKA活性降低的時(shí)期。這提示活化和抑制PKA分別有抑制和增強(qiáng)HS-FB合成和釋放膠原的作用。盡管TGF-β₁刺激NS-FB后短期內(nèi)輕度升高PKA活性而NS-FB合成和釋放膠原增多，而cAMP和H7對(duì)NS-FB的作用與HS-FB完全一致，提示PKA不是主要的TGF-β₁的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)者。TGF-β₁刺激HS-FB后PKA活性相反變化的原因尚進(jìn)一步研究。TGF-β₁的信號(hào)主要通過TGF-β₁受體-SMAD璼轉(zhuǎn)導(dǎo)^〔7〕，TGF-β₁對(duì)FB膠原合成的刺激是否經(jīng)此途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)，也須深入研究。ブ謁周知，多數(shù)生長(zhǎng)因子如EGF、FGF和PDGF等信號(hào)主要通過受體酪氨酸蛋白激酶(Receptor Tyrosine Protein Kinase,RTPK)-Ras…Raf-1…MAPK(絲裂原活化的蛋白激酶Mitogen-Activated Protein Kinase)通道^〔8〕傳遞，刺激細(xì)胞增殖和合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，這既是修復(fù)的基礎(chǔ)，又是瘢痕增生的原因，該通道和cAMP/PKA通道間的"交談(cross-talk)"起負(fù)反饋?zhàn)饔谩Anglo^〔1〕等發(fā)現(xiàn)cAMP能阻止VEGF和bFGF誘導(dǎo)的Raf-1活化，而H-89能逆轉(zhuǎn)cAMP/PKA活化對(duì)MAKP活化和絲裂原誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制作用。Graves^〔2〕等發(fā)現(xiàn)PDGF-BB能呈劑量依賴性升高cAMP和PKA活性，并可被磷酸二酯酶抑制劑增強(qiáng)，可見生長(zhǎng)因子活化Raf的同時(shí)也活化cAMP/PKA，而cAMP/PKA活化可抑制Raf-1，從而使MAPK不能活化而抑制絲裂原和/或生長(zhǎng)因子刺激效應(yīng)。形成負(fù)反饋抑制^〔9〕。這強(qiáng)烈提示活化PKA通道可能有助于抑制或阻止瘢痕的過度增生。而我們先前的研究發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕疙瘩組織中PKA活性沒有變化〔10〕，提示瘢痕增生可能與PKA不能活化而未起副反饋抑制有關(guān)。パ芯恐な擔(dān)琧AMP/PKA通道活化產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)因細(xì)胞種類、分化和功能狀態(tài)而異。Calleja^〔4〕發(fā)現(xiàn)cAMP/PKA通道可抑制MAPK而抑制FB增殖，而對(duì)PC12細(xì)胞則促進(jìn)增殖；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體的FB(NIH3T3)和表達(dá)胰島素受體的FB(NIH3T3)間也存在一些差異。這可能與細(xì)胞參與轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的PKA亞型有關(guān)〔11〕。進(jìn)一步研究FB等與瘢痕形成有關(guān)的細(xì)胞被有關(guān)刺激因子刺激后PKA亞型的變化以及與細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)間的關(guān)系有助于闡明PKA通道在瘢痕形成中相關(guān)細(xì)胞的作用。バ枰指出的是，我們的結(jié)果與先前關(guān)于增殖的研究一致^〔5〕，提示TGF-β₁和PKA通道對(duì)FB的增殖和膠原合成的影響是同步的。兩種不同來源的細(xì)胞在許多方面是極其相似的，可能HS-FB來自于NS-FB，僅前者的個(gè)別行為較后者略強(qiáng)而矣。ヒ虼耍我們認(rèn)為，TGF-β₁刺激FB合成膠原可能與PKA活性變化有關(guān)，而活化PKA則可能有抑制FB合成膠原作用，采用提高胞內(nèi)cAMP水平可用于防治增生性瘢痕。

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收稿日期2000-10-10

編輯/樊延南