江中央 ，郭沛涌 ，陳麗平 ，許文修 ，萬禁禁 ，李世雄

(1.華僑大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程系，福建 廈門，361021；2.華僑大學(xué) 環(huán)境與資源技術(shù)研究所，福建 廈門，361021)

水體富營養(yǎng)化加劇導(dǎo)致藻類爆發(fā)性生長形成水華，對(duì)水體的生態(tài)功能和飲用水源的安全產(chǎn)生嚴(yán)重影響。向水體中直接投加化學(xué)殺藻劑(如硫酸銅)仍是現(xiàn)有的最常用、最簡(jiǎn)便且效果較好的抑藻方法之一。這類殺藻劑雖能短時(shí)間達(dá)到殺滅藻的效果，但因易形成二次污染等問題，嚴(yán)重危害生態(tài)環(huán)境，甚至危及人類健康[1]。利用植物產(chǎn)生的化感物質(zhì)抑制藻類的生長具有高效、生態(tài)安全性較好等特點(diǎn)，為尋找環(huán)境友好的抑藻方法提供了一種思路[2?3]?；凶饔眉匆环N植物通過向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)(化感物質(zhì))影響其他生物生長的現(xiàn)象[4]。目前，利用植物化感作用及化感物質(zhì)抑制藻類生長的方式主要包括 3類：(1) 在水體中種植植物，使其在水體中分泌化感物質(zhì)抑制藻類生長，如用人工浮島抑藻[5]；(2) 將干燥的植物體投到待處理水體中，植物體腐敗降解后釋放化感物質(zhì)抑藻，如大麥秸稈[6?7]；(3) 從植物體中提取化感物質(zhì)投加到待處理水體中進(jìn)行藻類控制[8?9]。其中，最后一類方式操作簡(jiǎn)便，易工業(yè)化，更受人們推崇[4,10]。但目前該方面的研究主要集中于沉水植物[11?13]、挺水植物[14?16]和浮水植物[17]等水生植物，對(duì)于陸生植物尤其是大型木本植物的研究較少，而基于響應(yīng)面法超聲輔助技術(shù)提取植物抑藻物質(zhì)的研究更少。在此，本文作者以廣泛分布于河岸旁、生物量大、生長快的柳樹為研究對(duì)象，利用該方法最大限度提取植物抑藻物質(zhì)，分析其主要成分，研究化感物質(zhì)對(duì)蛋白核小球藻生長的影響，探討可能的抑藻機(jī)理，以期為利用陸生植物化感物質(zhì)控制水華提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

柳樹葉片采自華僑大學(xué)校園內(nèi)綠化區(qū)?取新采集的柳樹葉片，置于60 ℃烘箱中干燥48 h，用粉碎機(jī)粉碎，保存。蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)購于中國科學(xué)院武漢水生所并培養(yǎng)于SE培養(yǎng)基[18]中?試驗(yàn)前將藻分別接種于新配置的 SE培養(yǎng)基，使之達(dá)指數(shù)生長期后用于試驗(yàn)?

試驗(yàn)中的試劑均為分析純，用于質(zhì)譜檢測(cè)的溶劑甲醇為色譜純。

1.2 柳樹葉化感物質(zhì)的提取方法及分離流程

稱取柳樹葉粉末于具塞錐形瓶中，加入乙醇溶液，超聲波提取(超聲功率為 250 W)。超聲結(jié)束后，提取液先后經(jīng)濾紙抽濾、孔徑為0.22 μm有機(jī)系濾膜抽濾用以去除顆粒物，得到清液。然后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到浸膏，備用。

分離流程：柳樹葉粉末→乙醇超聲提取→過濾濃縮→乙酸乙酯萃取→硅膠柱層析(以三氯甲烷和甲醇為淋洗劑，配比為3∶1)→甲醇重結(jié)晶→化感物質(zhì)(結(jié)構(gòu)鑒定)。

1.3 提取條件優(yōu)化方案

前期單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，時(shí)間為180 min，溫度為50 ℃和液料比為40.03∶1 mL/g時(shí)，柳樹葉活性物質(zhì)有較好的抑藻作用。因此，本實(shí)驗(yàn)以上述4個(gè)因素作為考察對(duì)象，采用Design Expert 7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，以中心組合設(shè)計(jì)(central composite design (CCD))為基礎(chǔ)的響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以獲取最適實(shí)驗(yàn)條件。四因素五水平編碼表見表1。

表1 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表Table 1 Range of different factors investigated with CCD design

1.4 化感組分的氣相色譜?質(zhì)譜(GC-MS)測(cè)定

用GC-MS(Agilent 7890A/5975C)對(duì)化感組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

氣相條件：色譜柱 HP?5 (長×內(nèi)徑×膜厚為30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為He，進(jìn)樣口溫度都為280 ℃。不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL，柱流速為1 mL/min；程序升溫初始爐溫50 ℃保持3 min，然后，以20 ℃/min速度升溫至170 ℃，保持2 min，最后以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜(MS)條件：EI離子源，電子能量為70 eV。樣品各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，參照 NIST02標(biāo)準(zhǔn)譜庫，鑒定各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)?

1.5 抑藻測(cè)試及數(shù)據(jù)處理

采用培養(yǎng)液法對(duì)各提取組分進(jìn)行抑藻活性生物檢測(cè)。培養(yǎng)基經(jīng)過高壓滅菌0.5 h，然后分裝到250 mL錐形瓶中。每瓶中100 mL，其中包括5 mL處于對(duì)數(shù)生長期的藻種液和 0.5 mL待測(cè)液和培養(yǎng)液。在PYX?250Q?B型人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行，培養(yǎng)條件如下：溫度為25 ℃，光照為3 000～4 000 lx，光暗比為14 h∶10 h。每隔24 h取液1次，利用血球計(jì)數(shù)法記錄各個(gè)生長時(shí)期的細(xì)胞數(shù)目。計(jì)算抑制率，以抑制率表示化感物質(zhì)提取率RI，公式如下：

式中：RI為抑制率；N為加入化感組分試驗(yàn)組的藻密度(個(gè)/mL)；N0為對(duì)照組藻密度?

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

以A=(X1?70)/5，B=(X2?180)/20，C=(X3?40)/5 和D=(X4?50)/5為自變量，以柳樹葉化感物質(zhì)對(duì)蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)的抑制率為響應(yīng)值(Y)進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)(X1,X2和X3含義見表1)。采用CCD設(shè)計(jì)方案所得結(jié)果如表2所示。將30個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為2類：第1～24為析因?qū)嶒?yàn)點(diǎn)，自變量取值為各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；第25～30為中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)即零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)。零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

筆者對(duì)美國學(xué)的理解是，這是一門以跨學(xué)科理論與方法為特色，重點(diǎn)考察美國文化價(jià)值觀、重要思想或文化模式在美國歷史與現(xiàn)實(shí)相應(yīng)議題上的作用范式、影響途徑的人文社會(huì)科學(xué)。美國學(xué)者做美國學(xué)是為了傳承與發(fā)展、反思與批評(píng)美國文化價(jià)值觀和美國文明特性，中國學(xué)者做美國學(xué)是為了深度解讀美國文化，深刻評(píng)析美國文明，促進(jìn)不同文明之間的對(duì)話，服務(wù)于國家對(duì)外戰(zhàn)略需求。

利用Design-Expert 7.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到柳樹化感物提取率對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、時(shí)間(B)、液料比(C)和超聲溫度(D)多元二次回歸模型為

上式中，常數(shù)項(xiàng)76表示柳樹葉化感物質(zhì)的平均抑制率在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)處于較高的水平。

利用軟件對(duì)回歸方程可信度分析，其中相關(guān)系數(shù)R2=90.56%，表明90.56%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋，說明方程可靠性較高。信噪比為 9.717，大于4.000，說明模型信號(hào)強(qiáng)，可以用于指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)?？梢姡涸摶貧w方程為優(yōu)化超聲提取化感物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)條件提供了一個(gè)良好的模型。

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表 3。表中模型P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，能夠正確反映柳樹葉化感物質(zhì)的抑制率與乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(B)、液料比(C)和超聲溫度(D)之間的關(guān)系。B和BC對(duì)Y的影響顯著(P＜0.05)；A，C，D，AD，BD，A2，C2和D2對(duì)Y的影響極顯著(P＜0.01)；AB，AC，CD和B2對(duì)Y的影響不顯著(P＞0.05)，表明實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。從表3也可知：各因素對(duì)響應(yīng)值的影響從大至小依次為超聲溫度(D)、液料比(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、時(shí)間(B)。失擬檢驗(yàn)P=0.741 9＞0.05，不顯著，說明模型完全可以用來對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行擬合。

2.2 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖 1(a)～(f)所示可直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。從圖1中軸方向變化的密集程度可以判斷兩因素之間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度，即響應(yīng)面曲線越陡峭，說明該因素對(duì)化感物質(zhì)超聲提取的影響越顯著。這與方差分析結(jié)果相一致。

表2 超聲提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of tests

由圖 1(a)可以看出：乙醇體積分?jǐn)?shù)和時(shí)間交互作用不顯著；不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)具有不同的極性。根據(jù)相似相溶原理可知：不同極性的溶液勢(shì)必會(huì)影響到化感物質(zhì)的提取率，同時(shí)，極性不同的溶液也會(huì)影響超聲破碎的過程。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，易將蛋白質(zhì)、糖等水溶性物質(zhì)提取出來，不利于脂溶性化感物質(zhì)的浸出；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)太大時(shí)，產(chǎn)生很大的滲透壓，脂溶性物質(zhì)溶出增加，但會(huì)使植物細(xì)胞蛋白質(zhì)很快凝固，妨礙乙醇向植物細(xì)胞內(nèi)滲透，影響浸出，提取率反而降低。試驗(yàn)結(jié)果表明：在一定范圍內(nèi)，提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，提取效果最好；而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，提取率有減小趨勢(shì)。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

從圖1(b)可以看出：乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比交互作用不顯著；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的增大，提取率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。液料比是提取過程中的一個(gè)重要因素，根據(jù)傳質(zhì)速率原理，主要表現(xiàn)在影響固相主體和液相主體的體積分?jǐn)?shù)差，即傳質(zhì)推動(dòng)力。料液比越小，兩相間的體積分?jǐn)?shù)差越小，從而傳質(zhì)推動(dòng)力就越小。另外，料液比也會(huì)影響兩相的混合情況。提高液料比盡管會(huì)在較大程度上提高傳質(zhì)推動(dòng)力，但大量的溶劑影響提取體系的傳熱和傳質(zhì)，反而不利于化感物質(zhì)的提取，同時(shí)，提高了生產(chǎn)成本和溶劑回收成本的難度。因此，液料比不宜太高。

從圖 1(c)可以看出：乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度交互作用顯著；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度的增大，提取率先增加后減?。划?dāng)溫度較低時(shí)，物質(zhì)分子平均運(yùn)動(dòng)速率小，擴(kuò)散速率??；當(dāng)溫度升高時(shí)，物質(zhì)分子平均運(yùn)動(dòng)速率越大，擴(kuò)散速率越大，加速了溶劑與溶質(zhì)的混合。另外，溫度升高對(duì)植物組織的浸潤和對(duì)有效成分的溶解也有促進(jìn)作用，能夠使蛋白質(zhì)凝固，破壞酶類有利于物質(zhì)的浸出。當(dāng)溫度過高時(shí)，一方面易加速活性成分的分解，使其受到破壞，降低抑藻活性，且雜質(zhì)的溶出量增加，給后續(xù)操作帶來不便；另一方面使乙醇易揮發(fā)，造成溶劑損失，且降低乙醇體積分?jǐn)?shù)，影響提取率。

從圖1(d)可以看出：時(shí)間和液料比交互作用顯著；提取率隨著液料比的增大而增大，但液料比過高會(huì)降低提取率。而提取率隨著時(shí)間的延長而逐漸降低?？梢姡阂毫媳雀蓴_時(shí)間對(duì)提取率有較大影響。

從圖 1(f)可以看出：超聲溫度和液料比交互作用不顯著；化感物質(zhì)提取率隨超聲溫度和液料比的增大快速增加，但若超聲溫度和液料比過高，會(huì)降低提取率。

圖1 不同因素對(duì)抑制率影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface(3D) that effects of different extraction parameters on inhibition rate

2.3 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證試驗(yàn)

從圖1(a)～(f)所示的響應(yīng)面最高點(diǎn)可以看出：化感物質(zhì)對(duì)蛋白核小球藻的抑制率在一定范圍內(nèi)與乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、時(shí)間、和液料比成正相關(guān)，但是，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%～72.5%、時(shí)間為60～180 min、液料比為42.50∶1 mL/g以及溫度為55 ℃左右時(shí)提取效果最好。由此可知在實(shí)驗(yàn)所選的范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)點(diǎn)的最高值。由上述擬合的二次回歸方程求偏導(dǎo)得出最佳的提取條件參數(shù)如下：乙醇體積分?jǐn)?shù)為72.92%，液料比為40.03∶1 mL/g，時(shí)間和溫度分別為160 min和55 ℃，在此最佳條件下，化感物質(zhì)提取率最高，其對(duì)蛋白核小球藻的抑制率理論值可達(dá)到93.52%。

為檢驗(yàn) RSM 法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行柳樹葉化感物質(zhì)的提取實(shí)驗(yàn)。為對(duì)比超聲提取和常規(guī)浸提法的優(yōu)劣，采用同一種原料在上述相同實(shí)驗(yàn)條件下恒溫振蕩48 h得到提取液用于抑藻測(cè)試，結(jié)果見表4。由表4可知：以擬合條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，化感物質(zhì)抑制率平均值為91.34%，與預(yù)測(cè)值93.52 %較接近，重復(fù)性很好，說明優(yōu)化結(jié)果可靠；與傳統(tǒng)提取法相比，在抑制率相同情況下超聲法提取時(shí)間縮短了17倍，化感物質(zhì)的提取效果也有了一定程度提高。

表4 超聲提取法與常規(guī)溶劑提取法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of ultrasonic and conventional solvent extraction technology

2.4 化感物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

將分離純化后的化感物質(zhì)用甲醇溶解后經(jīng) 0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后，通過上柱檢測(cè)分析，結(jié)果見表5。從表5可見：主要化感物質(zhì)按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)由高到低依次為對(duì)羥基肉桂酸乙酯(Ethyl 4-hydroxy cinnamate)、4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl 4-hydroxy-3-methoxycinnamate)、棕櫚酸(Palmitic acid)、茉莉酸甲酯(Methyl 3-oxo-2-(2-pentenyl)cyclopentaneacetate)、對(duì)羥基肉桂酸甲酯(Methyl 4-hydroxycinnamate)、對(duì)羥基苯甲酸甲酯(Methyl 4-hydroxybenzoate)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.76%，4.97%，3.35%，2.64%，1.88%和1.07%。化感物質(zhì)是供體植物釋放的作用于受體植物的次生代謝物質(zhì)。Rice[19]將化感物質(zhì)分為14類，目前普遍的化感物質(zhì)分類主要是4類[20?21]：(1) 酚類；(2) 萜類；(3)糖和糖苷類；(4) 生物堿和非蛋白氨基酸，其中最為常見的是長鏈脂肪酸、酚酸以及萜類化感物質(zhì)?本研究發(fā)現(xiàn)柳樹葉化感物質(zhì)主要屬于酚酸類衍生物和少量脂肪酸族物質(zhì)(統(tǒng)稱為酚酸類組分，下同)?

近年來,利用植物的化感物質(zhì)來抑制藻類生長的研究較為活躍[22]，其中酚酸類物質(zhì)是活性較強(qiáng)的一類化感物質(zhì)[23]。Greca等[24]報(bào)道馬蹄蓮中的抑藻物質(zhì)為酚類和多酚類物質(zhì)。Nakai等[25]從穗花狐尾藻中分離出單寧酸、鞣花酸、五倍子酸、焦棓酸和兒茶酸等多種酚酸類化感物質(zhì)，并證明對(duì)銅綠微囊藻的生長有較強(qiáng)的抑制作用；Wu等[26]用聚乙烯吡咯烷酮 PVPP將伊樂藻、黑藻和苦草的分泌物中的酚類化合物去除后，發(fā)現(xiàn)3種沉水植物對(duì)無毒銅綠微囊藻株的抑制率分別下降35.7%，43.4%和59.1%，表明這3種沉水植物釋放的酚類化合物是進(jìn)入周圍水中抑制藻類生長的主要化感物質(zhì)。本研究將柳樹葉經(jīng)過多次分離提取和柱層析得到的化感物質(zhì)經(jīng)鑒定主要為酚酸類物質(zhì)，如對(duì)羥基肉桂酸乙酯、4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯等，且這些物質(zhì)能有效地抑制蛋白核小球藻的生長?

2.5 酚酸類組分對(duì)蛋白核小球藻生長的影響

圖2所示為不同體積分?jǐn)?shù)柳樹葉酚酸類組分對(duì)蛋白核小球藻抑制率變化情況。從圖2可見：不同體積分?jǐn)?shù)的酚酸類組分對(duì)蛋白核小球藻抑制率有所不同。各組分在2 d后抑制率都在75%以上(P＜0.05)，表現(xiàn)出快速高效的抑制效果，這與Hong等[16]的研究結(jié)果較相似，這對(duì)于控制水體藻華具有良好的現(xiàn)實(shí)意義。3 d后0.1～0.3 g/L組分抑制率隨時(shí)間的延長都有不同程度下降，0.1 g/L處理組抑制率在7 d僅為21.2%，但0.4 g/L處理組抑制率維持在89.1～98.2%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(7 d)，抑制率隨著體積分?jǐn)?shù)的增大而升高，表明此化感物質(zhì)的抑制效果對(duì)其體積分?jǐn)?shù)具有一定的依賴性，化感物質(zhì)體積分?jǐn)?shù)越大，其抑制效果越好。

表5 柳樹葉化感物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 5 Analytical results of allelochemical from the Leaves of S.babylonica by GC-MS

酚酸類物質(zhì)是一類具有酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物，其對(duì)微藻化感作用的主要機(jī)制可能是酚酸類物質(zhì)的自氧化[23,27]。實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基含有一定量的Cu2+和Fe3+等過渡金屬離子，能與酚酸類物質(zhì)上羥基發(fā)生自氧化，產(chǎn)生 H2O2[28]。H2O2可進(jìn)一步造成細(xì)胞脂質(zhì)過氧化[29]，進(jìn)而使得膜結(jié)構(gòu)和功能受損，細(xì)胞代謝失調(diào)甚至死亡。張庭廷等[30]研究酚酸類物質(zhì)對(duì)水華藻類的化感作用時(shí)發(fā)現(xiàn)：阿魏酸和對(duì)羥基苯甲酸能使水華魚腥藻及蛋白核小球藻的細(xì)胞葉綠素a含量下降，細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基增高，膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)積累，細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)的活力開始時(shí)應(yīng)急性升高?；ㄣ懙萚31]發(fā)現(xiàn)鄰苯三酚和咖啡酸會(huì)引起銅綠微囊藻膜脂過氧化，干擾酯類代謝并抑制酯酶活性，同時(shí)降低膜的完整性，使細(xì)胞固縮，鄰苯三酚還能顯著抑制銅綠微囊藻的SOD酶活性，破壞細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)。本研究中的肉桂酸衍生物、苯甲酸衍生物等一些酚酸類物質(zhì)苯環(huán)上的羥基可能與培養(yǎng)基中的Cu2+和Fe3+等過渡金屬離子結(jié)合，誘導(dǎo)發(fā)生自氧化，產(chǎn)生H2O2，被藻細(xì)胞吸收后破壞細(xì)胞酶活系統(tǒng)，影響細(xì)胞正常生理活性，從而抑制微藻生長。

圖2 酚酸類質(zhì)量濃度對(duì)蛋白核小球藻抑制率的影響Fig.2 Effects of mass concentration of allelopathic fraction on inhibition rate of C.pyrenoidosa

3 結(jié)論

(1) 超聲提取柳樹化感物質(zhì)的數(shù)學(xué)回歸模型為：

其中各變量的編碼為：A=(X1?70)/5；B=(X2?180)/20；C=(X3?40)/5；D=(X4?50)/5；對(duì)柳樹化感物提取的影響程度從大至小依次為超聲溫度(D)、液料比(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、時(shí)間(B)。

(2) 超聲提取柳樹化感物質(zhì)的最佳實(shí)驗(yàn)條件如下：乙醇體積分?jǐn)?shù)為72.92%，液料比為40.03∶1 mL/g，溫度為55 ℃，時(shí)間為160 min，預(yù)測(cè)抑制率為93.52%，實(shí)際抑制率為 91.34%。實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值沒有顯著差異，即該數(shù)學(xué)模型可以較好地預(yù)測(cè)乙醇體積分?jǐn)?shù)、時(shí)間、液料比和超聲溫度這4個(gè)因素與蛋白核小球藻抑制率的關(guān)系，重復(fù)性較好。

(3) 對(duì)柳樹葉化感物質(zhì)分離鑒定得到其主要抑藻活性物質(zhì)為對(duì)羥基肉桂酸乙酯等酚酸類物質(zhì)，且質(zhì)量濃度為0.1～0.4 g/L的酚酸類組分對(duì)蛋白核小球藻抑制率為21.2%～89.1%；抑制作用隨著投加化感物質(zhì)體積分?jǐn)?shù)的增大而增強(qiáng),，抑制作用對(duì)化感物質(zhì)體積分?jǐn)?shù)具有一定的依賴性。

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