中圖分類號：S917 文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-3188（2025）03-057-08

貝類精子及幼蟲超低溫保存技術(shù)是一項有價值的技術(shù)，通過超低溫冷凍保存這項技術(shù)實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的長期穩(wěn)定保存，在種質(zhì)資源保護和遺傳改良領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。該技術(shù)的核心在于建立標(biāo)準(zhǔn)化貝類種質(zhì)資源庫，顯著降低瀕危物種與受過度捕撈影響種群的遺傳多樣性衰減風(fēng)險，同時為遺傳育種工程提供可溯源的配子與胚胎生物樣本，顯著提升種質(zhì)資源利用效率和遺傳改良研究可行性。

1超低溫冷凍保存原理與損傷機制

低溫生物學(xué)是研究生物體系在低溫環(huán)境中生理響應(yīng)機制及其應(yīng)用技術(shù)的交叉學(xué)科，涵蓋從分子尺度到生態(tài)系統(tǒng)的多層次低溫適應(yīng)規(guī)律解析。低溫指 0^°C 至-80^°C 區(qū)間，而超低溫特指 ?-150^°C 的極端低溫環(huán)境（如液氮 -196^°C ）。該學(xué)科理論表明，生命中的一切生命過程都需要酶的參與，盡管每一種生命過程都是以各種方式進行的，但它們的活力都是受溫度變化的，當(dāng)它們的溫度降到一定程度時，它們就會短暫地“失活”，進入一種能量消耗最小的階段，這樣就可以將它們儲存起來，然后在解凍之后再被喚醒，從而達到長期保存的目的。1949年，英國生物學(xué)家Ploge和 Smith^[1] 在《自然》發(fā)表里程碑論文，首次證實甘油作為冷凍保護劑可使禽類精子在 -79^°C 長期存活，此舉奠定現(xiàn)代生殖細(xì)胞低溫保存的理論基礎(chǔ)。

低溫常被應(yīng)用于細(xì)胞和組織的短時貯存，而超低溫常被應(yīng)用于長時貯存。低溫生物學(xué)作為生物醫(yī)學(xué)工程的核心支撐學(xué)科，其技術(shù)外延涵蓋再生醫(yī)學(xué)（干細(xì)胞庫）、保護遺傳學(xué)（種質(zhì)資源庫）及航天生物學(xué)（地外生命保存）等前沿領(lǐng)域。例如：在醫(yī)療領(lǐng)域，超低溫冷凍可以保存血液、精子、皮膚等組織；應(yīng)用超低溫冷凍法進行小白鼠的早期胚胎的長期保存也在農(nóng)業(yè)方面被廣泛應(yīng)用[2-3]

雖然低溫保存技術(shù)可以延長精子的壽命，但是如果操作不良（如應(yīng)用于組織樣本時），仍可能造成不可逆損傷。因此，在低溫保存過程中，需添加保護劑并控制適宜的冷卻速率，以最大限度減少損傷。研究發(fā)現(xiàn)，大部分凍結(jié)損傷發(fā)生于 0～-60^°C 的臨界溫度區(qū)間，其中冰晶損傷、滲透壓損傷、過冷休克、抗凍劑毒害等是凍結(jié)損傷的主要原因[2]。

（1）冰晶損傷

在超低溫冷凍生物樣本的過程中，冰晶損傷是最常見的損害因素之一。其根本原因在于快速冷卻：當(dāng)溫度低于零攝氏度時，細(xì)胞無法及時排出內(nèi)部水分，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成冰晶[4-5]，從而對細(xì)胞器和細(xì)胞膜造成機械性損傷。研究表明，鯉魚精子經(jīng)低溫保存復(fù)蘇后，電鏡掃描顯示其頭部和尾部細(xì)胞膜的破裂主要源于細(xì)胞內(nèi)冰晶[6]。此類損傷多發(fā)生于 -3～-60^°C 之間，在快速降溫實驗中尤為顯著。當(dāng)溫度低于 -60^°C 時，游離水分完全凍結(jié)抑制了水分流動，細(xì)胞損傷隨之減輕。添加抗凍保護劑可縮小冰晶危害的溫度范圍，顯著降低組織樣本損傷程度[7-12]

（2）滲透壓損傷

滲透壓損傷同樣源于冰晶形成。在超低溫冷凍生物樣本時，細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓差異會引發(fā)電解質(zhì)失衡：當(dāng)胞外溶液凍結(jié)導(dǎo)致溶質(zhì)濃度升高時，細(xì)胞通過水分外流試圖維持滲透平衡，這種劇烈的水分遷移會造成機械損傷[5.8-9，13]。具體而言，在低溫環(huán)境下，胞外溶液優(yōu)先凍結(jié)使得未凝固部分的電解質(zhì)濃度急劇上升，高滲環(huán)境不僅破壞細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，還會引發(fā)滲透性脫水一細(xì)胞內(nèi)水分通過滲透作用持續(xù)外流，脫水程度與細(xì)胞膜通透性及降溫速率呈正相關(guān)。研究表明，緩慢冷卻法會延長溶質(zhì)濃縮過程，使?jié)B透壓損傷顯著加劇。

（3）過冷休克

在生物樣本的超低溫冷凍過程中，細(xì)胞與培養(yǎng)液均會發(fā)生凍結(jié)，且細(xì)胞的凍結(jié)程度通常較培養(yǎng)液更深。由于細(xì)胞膜對溫度變化高度敏感，當(dāng)環(huán)境溫度降至 0～-16^°C 時，其磷脂分子會發(fā)生相變并重排，形成剛性凝膠態(tài)結(jié)構(gòu)。這一過程導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性異常、胞內(nèi)物質(zhì)外滲及膜完整性喪失，最終引發(fā)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的不可逆損傷[3，5.8-9，14-15]。 。

（4）抗凍劑毒性

在超低溫冷凍生物樣本過程中，低溫保護劑（CPA）能有效減輕細(xì)胞損傷。其通過維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性并抑制冰晶生長，顯著降低低溫對細(xì)胞的直接傷害。然而，部分保護劑如二甲基亞砜（DMSO）具有細(xì)胞毒性：高濃度下會破壞膜蛋白結(jié)構(gòu)，且滲透壓應(yīng)激可能引發(fā)線粒體功能異常。保護劑對細(xì)胞的損傷程度呈濃度依賴性，且受冷凍方式（快速凍結(jié)加劇滲透損傷，慢速凍結(jié)加重冰晶損傷）、保護劑濃度（濃度gt;10% 時化學(xué)毒性顯著升高）、平衡時間（短時暴露引發(fā)滲透休克，長時暴露導(dǎo)致代謝抑制）這三類關(guān)鍵參數(shù)調(diào)控[5，8-9，14，16] 。

（5）pH損傷

在生物樣本的超低溫冷凍過程中，冷凍或復(fù)溫階段可能引發(fā)胞內(nèi)液體短暫喪失緩沖性能，導(dǎo)致胞內(nèi)pH值失衡，進而造成細(xì)胞代謝異?；虿豢赡娴慕Y(jié)構(gòu)損傷。研究表明，當(dāng)細(xì)胞懸浮液在 0～-55^°C 的共晶溫度范圍內(nèi)冷卻時，其組分凝固并形成致密晶體混合物。此類相變過程會破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄，最終引發(fā)細(xì)胞功能障礙[3，5.8-9，12，14-15]。

（6）細(xì)胞容積效應(yīng)

超低溫冷凍過程中，細(xì)胞經(jīng)歷滲透性脫水導(dǎo)致體積收縮；復(fù)溫解凍時，水分快速內(nèi)流又引發(fā)細(xì)胞膨脹。這種雙向體積波動是低溫保存的核心挑戰(zhàn)。當(dāng)體積變化幅度突破臨界閾值（通常為原生體積的 ± 25% ），細(xì)胞膜因張力超限發(fā)生不可逆破裂，最終導(dǎo)致程序性壞死。值得注意的是，在添加低溫保護劑的滲透平衡階段，細(xì)胞首先因胞外高滲溶液脫水收縮；隨著保護劑跨膜擴散，胞內(nèi)滲透壓升高驅(qū)動水分回流，此過程中反復(fù)的體積震蕩可造成亞致死性膜損傷[3，5，8-9，15] O

（7）重結(jié)晶損傷

生物樣本在冷凍保存期間會經(jīng)歷兩個階段的冰晶動態(tài)演變：初始凍結(jié)階段中，當(dāng)溫度降至 -80^°C 以下時，小冰晶通過奧斯特瓦爾德熟化機制逐漸融合增大；復(fù)溫解凍階段中，在 -50^°C 至 0^°C 溫區(qū)內(nèi)，殘留的微冰晶會重新排列聚集形成更大晶體。這種冰晶重結(jié)晶現(xiàn)象通過雙重機制加劇細(xì)胞損傷一—增大的冰晶直接刺破細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜（機械損傷），同時因晶體生長改變局部溶質(zhì)濃度梯度而引發(fā)二次滲透壓震蕩（滲透損傷）[17]。值得注意的是，此類損傷在以下場景中尤為顯著：慢速復(fù)溫（ gt;2%gt;2min ）導(dǎo)致樣本在 -30～-10^°C 危險溫區(qū)滯留時間延長；長期儲存在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以上（如液氮氣相區(qū) -130^°C 環(huán)境），這為冰晶重組提供了持續(xù)的熱力學(xué)驅(qū)動力[5，8-9，12，14] O

2貝類精子超低溫冷凍保存的研究現(xiàn)狀

與哺乳類（1750年）和魚類（1953年）精子凍存相比，超低溫冷凍精子保存在貝類研究起步較晚，發(fā)展緩慢。從1970年代開始，由美國Hughes首次采用低溫冷凍的方法，在世界范圍內(nèi)實現(xiàn)了對長牡蠣精子的冷凍保存[18]。自那以后，科研人員圍繞貝類精子冷凍保存技術(shù)開展系統(tǒng)研究，逐步優(yōu)化凍存方案，最終在實踐應(yīng)用中取得顯著進展（表1）。近年來，國內(nèi)對貝類的低溫保存也有了一定的進展，貝類精子的超低溫冷凍保存中最廣泛使用的抗凍劑為 10% ～20% （V/V）濃度的二甲基亞砜，最長可以保存30d，精子的存活率最高可達67%[19]

3貝類幼蟲、胚胎超低溫冷凍保存的研究現(xiàn)狀

貝類精子低溫冷凍保存技術(shù)已成功應(yīng)用于種質(zhì)資源庫建設(shè)，但其卵子及胚胎的冷凍保存研究仍遠(yuǎn)滯后于精子。盡管卵子與胚胎的冷凍損傷機制與精子相似，但其體積龐大、卵黃物質(zhì)豐富且膜滲透性低，致使冰晶更易形成并造成不可逆損傷，技術(shù)難度顯著增加。因此，當(dāng)前研究聚焦于幼蟲階段的冷凍保存[31]

近年研究表明，貝類幼蟲冷凍保存取得了不小的進展（表2），乙二醇與丙二醇因毒性較低成為優(yōu)選冷凍保護劑，而二甲基亞砜和甘油在高濃度時易引發(fā)膜系統(tǒng)損傷[32-34]。發(fā)育階段篩選顯示，D形幼蟲因具備完整幾丁質(zhì)外殼，可有效緩沖滲透壓變化，凍存存活率最高；擔(dān)輪幼蟲雖處于更早期發(fā)育階段且細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，但因缺乏外殼保護及膜系統(tǒng)未成熟，對冷凍保護劑毒性極為敏感，即使縮短處理時間，存活率仍不足30%[32，35-37] 。

表1貝類精子超低溫冷凍保存研究方法

4.1稀釋液

4貝類超低溫保存影響因素與改進

在生物樣本超低溫冷凍過程中，精子冷凍效果受多重參數(shù)調(diào)控：稀釋液類型、抗凍保護劑種類及濃度、凍存程序與解凍方法。其中，稀釋液體系與抗凍保護劑篩選是核心控制要素。

稀釋液配方具有顯著物種差異。針對貝類精子冷凍，研究多采用滅菌天然海水或改良D-Hank's液（細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)液[39]）作為基液[40]，其離子組成可模擬生殖腺內(nèi)環(huán)境。Kawamoto等[41]優(yōu)化珠母貝（Pinctadafucatamartensii）精子冷凍體系表明，含10% 甲醇的復(fù)合抗凍液（稀釋液組成為 80% 滅菌海水 +20% 胎牛血清）可使精子復(fù)蘇活力提升至（62.3±5.1）% [vs對照組（ 38.7±4.2）% ， Plt;0.01] 。楊培民等[42]系統(tǒng)評估蝦夷扇貝（Patinopectenyesoeni-si）精子凍存體系發(fā)現(xiàn)， 16% DMSO－海水抗凍液組精子復(fù)蘇活力達（ 47.0±4.4）% ，顯著高于甘油組[ （28.5±3.1）% 」和乙二醇組[（ 34.2±3.8）% 一（ Plt;0.05 ）。值得注意的是，貝類精子膜脂組成特殊（富含 ω_ω-3 多不飽和脂肪酸），這要求抗凍液需兼具膜穩(wěn)定與滲透壓緩沖功能。因此，血清蛋白的添加不僅能調(diào)節(jié)滲透壓梯度，其載脂蛋白組分還可通過結(jié)合膜磷脂防止低溫相變。

表2貝類胚胎及早期幼蟲超低溫冷凍保存研究方法

4.2抗凍保護劑

抗凍保護劑是一種能在極低溫下縮短高危溫區(qū)、減少低溫傷害、保護精子的物質(zhì)，但會對細(xì)胞造成一定程度的傷害，抗凍劑對各個生物的效果各有不同，主要取決于抗凍保護劑的機理和表現(xiàn)在不同動物有不同差異。按照抗凍保護劑的機制，將其劃分為滲透性和非滲透性兩種。

滲透性低溫保護劑可穿透至精子中，替代細(xì)胞內(nèi)水分，縮短危險溫區(qū)，達到更低的凍結(jié)點，減少凍存時對細(xì)胞的傷害[43]。

目前應(yīng)用最多的是二甲基亞砜，哺乳類動物中，馬麗等[44]用DMSO 和甘油作為滲透性冷凍保護劑，發(fā)現(xiàn) 6% DMSO比甘油更有利于豬精子的凍存；另外，在魚的精子凍存方面， 10% DMSO對黃顙魚（Pel-teobagrusfulvidraco）和大西洋大比目魚的精子進行低溫保存效果均較好。然而，并不是所有動物精子都由DMSO冷凍保存效果最好，例如Nahiduzzaman等[3]研究發(fā)現(xiàn)以 15% DMSO作為印度鯉魚精子中的抗凍劑，其效果不好；楊愛國等[45]對扇貝精子冷凍保存中發(fā)現(xiàn)濃度（V/V）為 8%～10% 的DMSO保存效果最好。

非滲透性冷凍保護劑主要是指大分子類，主要包括糖類、卵黃等一些營養(yǎng)物質(zhì)。目前國內(nèi)外非滲透性保護劑的研究多局限于哺乳類精子，還需進一步研究大分子類的作用機理，非滲透性冷凍保護劑也被應(yīng)用于貝類精子凍存中，如韓龍江[25]將 0.45mol/L 的海藻糖加人到太平洋牡蠣精子保護劑中，能顯著提高其精子活力和受精率。

4.3降溫程序

當(dāng)前，根據(jù)其降溫方式，可分為兩種，一種是液氮蒸氣梯度法，通過調(diào)節(jié)樣本與液氮面的垂直距離（通常 5～20cm ），利用氣相區(qū)溫度梯度（-80～-196^°C ）控制冷卻速率，在目標(biāo)距離停留 2～5min 后浸入液氮儲存。該方法成本低廉、無需精密設(shè)備，適合養(yǎng)殖場等資源有限場景，但存在人工操作誤差大、樣本間降溫速率差異顯著等問題。第二種方法是程序控制降溫法，基于預(yù)設(shè)降溫曲線，通過液氮噴射系統(tǒng)和PID算法實現(xiàn) ±1^°C 精度控制，最終轉(zhuǎn)移至液氮存儲。相比前者，其降溫均勻性提升4倍，尤其適用于胚胎干細(xì)胞等敏感樣本，但設(shè)備購置成本高，制約其在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。

4.4復(fù)蘇方法

精子復(fù)蘇是超低溫冷凍保存技術(shù)中直接影響精子存活率的核心環(huán)節(jié)。目前主流的復(fù)蘇方法按溫度范圍分為三類：低溫冰水復(fù)蘇（ 0～5^°C ）、溫水復(fù)蘇（30～40^°C ）、高溫復(fù)蘇（ 50～80^°C ）。其具體選擇需根據(jù)物種特性、精液體積、解凍溫度以及精液與復(fù)溫液的比例進行優(yōu)化[46]

關(guān)于復(fù)蘇方法多采用恒溫水浴對凍精解凍，吳麗云[47]曾對西施舌的精子進行過低溫保存，并且解凍條件是在 35^°C 下進行。太平洋牡蠣精子在 40^°C 的復(fù)蘇實驗中，其凍精活性明顯超過 30^°C 和 50^°C^[27] ，馬氏珠母貝精子在 20^°C 的水浴中進行了15s的低溫復(fù)蘇[48]。Ding等[49]對大西洋大比目魚精子的復(fù)蘇條件進行了研究，將其放置于 37^°C 的水中，使其輕微搖動 3min ，然后在凍存管內(nèi)出現(xiàn)液體時，就把它從水浴鍋中移出來，在室溫下完全解凍。在太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存中，也有研究人員指出在 16^°C 流水解凍，效果最好，存活率可達 70% ，受精率與鮮精相比沒有明顯變化[50]

4.5抗氧化劑

在生物樣本低溫冷凍與解凍過程中，精子損傷機制呈現(xiàn)多因素耦合特征。氧化應(yīng)激雖非唯一損傷路徑，但其引發(fā)的膜脂過氧化（LPO）及DNA斷裂等不可逆損傷不容忽視。抗氧化劑通過清除活性氧（ROS）或阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可有效維持精子膜流動性及線粒體功能。然而，冷凍過程中精漿內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)（如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶）的防御能力顯著衰減，導(dǎo)致ROS濃度峰值可達基礎(chǔ)水平3～5倍。為此，研究者通過在抗凍液中添加外源抗氧化成分構(gòu)建二級防御體系，分為傳統(tǒng)抗氧化劑和納米抗氧化材料兩種。傳統(tǒng)抗氧化劑：維生素C（ S0～100μmol/L ）、 α- 生育酚 （0.5～2mmol/L [51]和SOD （50～200U/mL ）等通過電子轉(zhuǎn)移直接中和ROS；納米抗氧化材料：硒納米顆粒（ 10～50nm ）通過表面缺陷位點催化ROS分解，姜黃素納米載體（包封率gt;85%）實現(xiàn)靶向遞送[52]。

抗氧化物質(zhì)的量并非愈多愈好，相反，抗氧化物質(zhì)具有雙重性，過量則會對精子產(chǎn)生不良作用。近期研究表明，抗氧化劑存在劑量-效應(yīng)拐點。近期研究顯示，當(dāng)維生素C濃度超過 200μmol/L 時，精子活力反而下降 23.7% （ Plt;0.05 ），這與其促氧化特性及膜滲透壓擾動相關(guān)[53]。有研究人員發(fā)現(xiàn)，無冷凍保護劑的快速凍存方式（玻璃化凍存），因超快速降溫（ gt;1000^°C/min ）將ROS暴露時間縮短至毫秒級，DNA碎片指數(shù)（DFI）與新鮮樣本差異僅 1.8% ，其精子DNA損傷與人類新鮮精子樣本的DNA損傷最為相近[54]。傳統(tǒng)的慢速冷凍保存技術(shù)因相變期延長（ 30～60min ）較之于玻璃化凍存氧化損傷更大，使線粒體ROS生成量增加2.3倍。所以說不同的降溫方式也影響精子的氧化物質(zhì)含量。因此，在低溫保存的同時，如何有效地抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，提高細(xì)胞的抗氧化性能，是自前冷凍保存領(lǐng)域研究的重點。

4.6冷凍保護劑的輔助成分

在配置精子抗凍保護液的過程中，通常都會包含緩沖液、糖類，部分還會添加鹽類和抗生素。由于超低溫冷凍過程中胞內(nèi)液體緩沖能力短暫喪失，易引發(fā)pH 失衡，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂或不可逆損傷，因此需通過緩沖液維持胞內(nèi)外pH穩(wěn)態(tài)以保護精子[55]。冷凍保護劑中一般會添加糖類（如海藻糖）除為精子提供能量外，還可通過氫鍵結(jié)合替代胞內(nèi)自由水，抑制冰晶生長并減少機械損傷?，F(xiàn)階段，眾多研究為減少精子冷凍過程中的損傷，并提升復(fù)蘇后的生理特征，更集中于探索新的輔助成分。其中，含有多種氨基酸[56、環(huán)糊精－膽固醇復(fù)合物[57]、脂質(zhì)體、納米顆粒，以及熱應(yīng)激蛋白質(zhì)等。新添加的成分被用于提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)轉(zhuǎn)變凝膠化晶態(tài)的轉(zhuǎn)變程度，從而降低冷凍過程中可能發(fā)生的損傷，提高復(fù)蘇后的精子活力和功能。

近期，通過超聲波振動和電磁場技術(shù)調(diào)控水分子行為，已經(jīng)成為一種創(chuàng)新的嘗試。電磁場可以破壞水分子間的有序排列，從而影響晶體的結(jié)晶形態(tài)及尺寸的變化[58]。此外，通過電磁場來穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)線粒體的膜電位，可以有效降低活性氧產(chǎn)生，延長凍存細(xì)胞代謝活性[59]。同時，利用超聲空化作用，當(dāng)超聲波震動達到一定頻率時，細(xì)胞內(nèi)的微氣泡瞬間破裂與潰滅，加速冰晶體的過早成核和降低過冷現(xiàn)象出現(xiàn)，進而改善凍存后的復(fù)蘇效果[60]。上述物理場輔助技術(shù)為精子低溫保存研究提供了新思路，尤其在冰晶形態(tài)控制及氧化應(yīng)激緩解方面具有重要優(yōu)化潛力。

4.7精子冷凍保存技術(shù)的改進

玻璃化冷凍保存技術(shù)是指將微量的精液（通常 lt; 0.5mL ）浸入在液氮中實現(xiàn)急速冷卻（降溫速率 gt; 1000°C/min ）[61]。該技術(shù)突破性地規(guī)避了傳統(tǒng)冷凍對滲透性保護劑（如甘油）的依賴，從根本上消除滲透性休克導(dǎo)致的膜破裂風(fēng)險。玻璃化凍存技術(shù)根據(jù)相變控制策略可分為平衡冷凍法（慢速控冰）、冷干燥法（升華脫水）、高溫玻璃化法（零上溫度維持玻璃態(tài)）、高濃度CPA玻璃化法（滲透保護劑濃度 gt;6 mol/L）、無保護劑玻璃化法（超高速降溫實現(xiàn)非晶態(tài)固化）[62]。當(dāng)前精子玻璃化凍存一般采用后面高濃度CPA玻璃化法和無保護劑玻璃化法兩種方法。但需要注意的是，如乙二醇雖能抑制冰晶生長，卻可能引發(fā)滲透壓震蕩損傷線粒體嵴結(jié)構(gòu)。提高凍結(jié)速度，降低滲透性保護劑的濃度，可能減輕此損害[63]。實際上，Schuster等[4將此凍存方法（含 12% 甘油）與傳統(tǒng)凍存方法比，發(fā)現(xiàn)在精子活性方面沒有明顯的差別。最近，Zhou等人[采用微劑量多階段玻璃化法（ 25μL 凍存管 +100mmol/L 甘氨酸）使人類精子復(fù)蘇存活率達 65.8% ，且DNA碎片指數(shù)降低至

14.2% （傳統(tǒng)法 21.5% ）。在保護劑替代研究領(lǐng)域，Nawroth等[6]開創(chuàng)性地使用非滲透性大分子（如卵黃蛋白）構(gòu)建物理屏障，其冷凍損傷機制與滲透保護劑存在本質(zhì)差異：前者通過氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定膜磷脂，后者依賴滲透壓平衡。此外，Schulz等[]系統(tǒng)對比糖類保護劑效能，發(fā)現(xiàn)海藻糖組精子活力維持率（ 62.4% ）顯著高于蔗糖組（ 41.7% ）。

5展望

超低溫冷凍保存技術(shù)作為現(xiàn)代種質(zhì)資源保護的核心策略，在提升遺傳改良工程體系效能、促進水產(chǎn)種業(yè)規(guī)?；a(chǎn)及瀕危物種遷地保護等方面展現(xiàn)出重要應(yīng)用價值。該技術(shù)基于生物代謝低溫抑制原理，通過程序化控溫實現(xiàn)細(xì)胞與組織樣本的時序性保存。其中，超低溫冷凍保存通過將生物材料置于液氮相變溫度以下，使細(xì)胞進入代謝靜止態(tài)，有效終止氧化應(yīng)激反應(yīng)和酶促降解過程，從而維持遺傳物質(zhì)的長期穩(wěn)定性，現(xiàn)已被證實為保障生物樣本遺傳完整性的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體系。

在保護生物學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)通過構(gòu)建瀕危物種種質(zhì)資源庫，實現(xiàn)遺傳多樣性的原位保全和離體再生，為種群復(fù)壯提供關(guān)鍵生物材料。盡管貝類配子冷凍保存研究相較于哺乳動物及硬骨魚類存在明顯時序滯后性，但近年來針對長牡蠣貽貝、扇貝、珍珠牡蠣、皺紋盤鮑等重要經(jīng)濟物種的精子冷凍保存研究已取得顯著進展。研究表明，貝類精子質(zhì)量呈現(xiàn)多維動態(tài)特征，其不僅受親本性腺發(fā)育階段、滲透壓適應(yīng)能力等內(nèi)源性生理參數(shù)調(diào)控，更與冷凍保護劑滲透壓梯度、降溫速率等外源性技術(shù)參數(shù)存在顯著交互作用。

現(xiàn)有文獻系統(tǒng)證實，二甲基亞礬因其跨膜滲透效率與冰晶抑制效應(yīng)的雙重優(yōu)勢，在多數(shù)貝類精子冷凍保存中表現(xiàn)出普適性保護效能。然而當(dāng)前研究多聚焦于冷凍程序參數(shù)優(yōu)化（如抗凍劑濃度篩選、平衡時間確定），對精子超微結(jié)構(gòu)損傷機制、線粒體膜電位變化等分子層面的冷凍應(yīng)激響應(yīng)研究仍顯不足。值得注意的是，哺乳動物模型已證實環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可通過表觀遺傳修飾影響配子冷凍耐受性，這為貝類低溫生物學(xué)研究提供了重要范式參考。

超低溫冷凍保存技術(shù)作為生殖細(xì)胞低溫生物學(xué)研究的核心手段，通過程序化冷凍策略實現(xiàn)水生生物遺傳資源的長期穩(wěn)定保存?；谠摷夹g(shù)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化貝類種質(zhì)資源庫，可完整保存雙殼綱（牡蠣、扇貝、蛤仔）和腹足綱（鮑魚）等經(jīng)濟物種的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，有效規(guī)避因過度捕撈或環(huán)境脅迫導(dǎo)致的遺傳多樣性不可逆衰減。該技術(shù)體系在遺傳育種領(lǐng)域展現(xiàn)出多維應(yīng)用價值，其不僅為全基因組選擇育種提供可溯源的配子與幼蟲生物樣本，還可通過玻璃化冷凍技術(shù)建立瀕危物種的遺傳信息備份系統(tǒng)，旨在為水產(chǎn)種業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論支撐和技術(shù)解決方案。

參考文獻

[1]PolgeC，SmithAU，ParkesAS.Revivalofspermatozoa after vitrification and dehydration atlow temperatures[J].Nature，1949，164（4172）：666.

[2]陳松林.魚類精子和胚胎冷凍保存理論與技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[3]陳松林.魚類配子和胚胎冷凍保存研究進展及前景展望[J].水產(chǎn)學(xué)報，2002，26（2）：161-168.

[4]Gao D Y，MazurP，CritserJK.Fundamental cryobiologyofmammalian spermatozoa[M]//KarowA， CritserJK.ReproductiveTissueBanking.New York：AcademicPress，1997：263-328.

[5]Karow AM，Webb WR.Tissue freezing：atheory forinjury and survival_[J]. Cryobiology，1965，2（3） ：99- 108.

[6]趙維信，姜仁良，劉修英，等.幾種鯉科魚類精子和胚胎冷凍損傷的掃描電鏡研究[J].淡水漁業(yè)，1992（5）：3-5.

[7］Lovelock JE.The denaturation of lipidprotein complexes as a cause of damage by freezing[J].Proceedingsof the Royal Society of London.SeriesB-Biological Sciences，1957，147（929） ：427-433.

[8]Mackenzie A P.Non-equilibrium freezing behaviour of aqueous systems[J].Philosophical Transactions ofthe Royal Society of London，1977，278（959）：167 -189.

[9]Leung L，Jamieson B. Fish evolution and systematics：evidence from spermatozoa[J].Reviews in Fish BiologyandFisheries，1992，2（1）：91-92.

[10]于過才.三種重要海水魚類胚胎程序化冷凍保存技術(shù)研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2004.

[11]于海濤.海洋動物精子和胚胎的超低溫保存研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2004.

[12]鄧普恩.軍曹魚與紅鰭笛鯛精液超低溫保存及冷凍損傷研究[D].湛江：廣東海洋大學(xué)，2011.

[13]郝忱.兩種淡水經(jīng)濟魚類精子超低溫冷凍保存技術(shù)的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[14]龔進玲.子一代中華鱘精子活力及超低溫冷凍保存效果的研究[D].荊州：長江大學(xué)，2015.

[15]李純，李軍，薛欽昭.海洋生物種質(zhì)細(xì)胞低溫保存與機理[J].海洋科學(xué)，2000，24（4）：12-15.

[16]荊榮燕.斑馬魚（Daniorerio）精子的超低溫冷凍保存[D].汕頭：汕頭大學(xué)，2007.

[17]王俊民.液氮冷凍療法[J].陜西新醫(yī)藥，1981，10（3）： 48-50+40

[18]Hughes JB.An examination of eggs challenged with cryopreserved spermatozoa of the American oyster， Crassostrea virginica[J].Cryobiology，1973，10（4）：342 -344.

[19]王鵬飛.2種貝的胚胎和3種貝的精子超低溫冷凍保存的研究[D].湛江：廣東海洋大學(xué)，2008.

[20]馬培振，張哲，于瑞海，等.海灣扇貝精液超低溫冷凍保存技術(shù)的初步研究[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2018，48（9）：34-40.

[21]丁兆坤，朱豪磊，楊春玲，等.不同稀釋液對香港牡蠣精子冷凍的保存效果[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2013，34（3） ：67-74.

[22]朱豪磊.香港牡蠣精子冷凍保存的研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2013.

[23]于非非，余祥勇，鄭嬌，等.櫛江跳和近江牡蠣的精子超低溫冷凍保存[J」.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2016，24（2） ：305-312.

[24]王柱.幾種經(jīng)濟貝類胚胎和精子冷凍保存的研究[D].湛江：廣東海洋大學(xué)，2009.

[25]韓龍江.幾種海洋經(jīng)濟動物種質(zhì)資源超低溫冷凍保存研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2015.

[26]蔣玉榮.皺紋盤鮑精子和幼蟲低溫保存的研究[D].大連：大連海洋大學(xué)，2016.

[27]YangH，HuE，Cuevas-UribeR，etal.Highthroughput sperm cryopreservation of eastern oyster Crassostreavirginica[J].Aquaculture，2012，344-349：223- 230.

[28]康敏.香港牡蠣（Crassostreahongkongensis）精子超低溫冷凍保存技術(shù)[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[29]蘇振宏.香港牡蠣（Crassostreahongkongensis）精子超低溫冷凍保存技術(shù)的優(yōu)化[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021.

[30]YangHP，HuE，Cuevas-UribeR，etal.High -throughput sperm cryopreservation of eastern oyster Crassostrea virginica [J]. Aquaculture，2012，344（3） ：223 -230.

[31]張巖，陳四清，于東祥，等.海洋貝類配子及胚胎的低溫冷凍保存[J].海洋水產(chǎn)研究，2004，25（6） ：73 -78.

[32]HeresP，Troncoso J，ParedesE，et al.Toxicity

tests of cryoprotecting agents for Mytilus galloprovincialis

（Lamark，1819）early developmental stages [J]. Cryobiol

ogy，2019，86（40） ：40 -46. [33] Redfearn P，Chanley P，Chanley M. Larval shell

development of four species of New Zealand mussels：（Bi

valvia，Mytilacea）[J].New ZealandJournal ofMarine and

Freshwater Research，1986，20（2），157- 172. [34]Rusk A B.Larval development of the New Zeal

and mussel Perna canaliculus and effects of cryopreservation

[D]. Auckland ：Auckland University of Technology，2012. [35] Paredes E，Bellas J， Adams S L. Comparative

cryopreservation study of trochophore larvae from two spe

cies of bivalves： Pacific oyster （Crassostrea gigas） and

Blue mussel（Mytilus galloprovincialis）[J]. Cryobiology，

2013，67（3） ：274 - 279. [36]Heres P，Troncoso J，Paredes E，et al.Long term

survival of cryopreserved mussel larvae （Mytilus gallopro - vinciallis）[J]. Aquaculture，2019，512：734326. [37]Heres P，Troncoso J，Paredes E. Larval cryopr

eservation as new management tool for threatened clam

fisheries[J].Scientific Reports，2021，11（1） ：15428. [38]Adams S L，Tervit H R，McGowan L T，et al.

Towards cryopreservation of Greenshell ^TM mussel （Perna

canaliculus）oocytes[J]. Cryobiology，2009，58（1） ： 69 74. [39]Nahiduzzaman M，Hassan M M，Khanam U H，et

al.Sperm cryopreservation of the critically endangered ol

ivebarb（Sarpunti）Puntius sarana（Hamilton，1822）

[J]. Cryobiology，2011，62（1） ：62 -67. [40]Pang W，Lu H，Hu Y D，et al. Depletion of in

tracellular zinc induced apoptosis in cultured hippocampal

neurons through Raf/MEK/ERK pathways[J].Nutritional

Neuroscience，2012，15（1） ：18 -24. [41]Kawamoto T，Narita T，Isowa K，et al. Effects of

cryopreservation methods on post-thaw motility of sper

matozoa from the Japanese pearl oyster，Pinctada fucata

martensii[J]. Cryobiology，2007，54（1） ：19 -26. [42]楊培民，楊愛國，劉志鴻，等.蝦夷扇貝精子

的冷凍保存及其雜交試驗應(yīng)用研究[J].上海水產(chǎn)大學(xué)

學(xué)報，2007，16（4） ：351-356. [43]李晟.豬精液冷凍保存技術(shù)方法的研究[D].

長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013. [44]馬麗，李青旺，吳民耀.二甲基亞砜對豬精液

冷凍保存效果研究[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2014，35（5）：

56 -61.

[45]楊愛國，王清印，孔杰，等.扇貝精液的超低溫保存技術(shù)研究［J].海洋與湖沼，1999，30（6）：624-628.

[46]廖馨，嚴(yán)維輝，唐建清，等.淡水魚類精子的冷凍與保存[J].生物學(xué)通報，2006，41（8）：16-17.

[47]吳麗云.西施舌精子冷凍保存及其冷凍損傷機理研究[D].福州：福建師范大學(xué)，2011.

[48]AritaK，IsowaK，IshikawaT，etal.Effectsof coolingrate on post-thawmotility and fertility of Japanese pear oyster Pinctada fucata martensiispermatozoa [J].FisheriesScience，2012，78（3）：625-630.

[49]Ding F，Milley JE，Rommens M，et al.Effect of hormone implantation on cryopreservation of Atlantic halibut（Hippoglossus hippoglossus L.）sperm[J].Cryobiology，2012，65（1） ：51-55.

[50]李，王品虹，賀桂珍，等.太平洋牡蠣精液的超低溫保存[J.青島海洋大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2002，32（2）：207-211.

[51]Sieme H，Oldenhof H. Sperm cleanup and cen trifugationprocessing forcryopreservation[J].Methodsin Molecular Biology，2015，1257（3） ：43-52.

[52]AbdelnourSA，Hassan MAE，MohammedA K，etal.Theeffect ofaddingdifferentlevels of curcumin and its nanoparticles to extender on post -thaw quality of cryopreserved rabbit sperm[J].Animals，2020，10（9）： 1635-1642.

[53]Banihani S A，Alawneh R F.Human semen sampleswithhighantioxidantreservoir mayexhibit lower post-cryopreservation recovery of sperm motility[J].Biomolecules，2019，9（3） ：111.

[54]Vutyavanich T，PiromlertamornW，Nunta S. Rapid freezing versus slow programmable freezing of humanspermatozoa[J]. Fertilityand sterility，2O1O，93（6）： 1921-1928.

[55]WillMA，ClarkNA，SwainJE.BiologicalpH buffers inIVF：help or hindrance to success[J].Journal of Assisted Reproduction and Genetics，2011，28（8） ：711 -724.

[56]Renard P，Grizard G，Griveau JF，et al.Improvementofmotilityand fertilizationpotentialofpostthaw human sperm using glutamine[J]. Cryobiology，1996，33 （3） ：311 -319.

[57]MoraesEA，MatosWCG，GrahamJK，etal.

Cholestanol-loaded-cyclodextrin improves the quality of stallion spermatozoa after cryopreservation[J].Animal ReproductionScience，2015，158：19-24.

[58]李太寶，譚明輝，王達，等.電磁場輔助冷藏對草莓品質(zhì)的影響[J].制冷技術(shù)，2021，41（2）：61-64+70

[59]GholamiD，GhaffariSM，RiaziG，etal.Electromagnetic field in human sperm cryopreservation improves fertilizing potential of thawed sperm through physicochemical modification of water molecules in freezing medium [J].PLoSOne，2019，14（9）：e0221976.

[60]Gholami D，Riazi G，Ghaffari S M，et al. The application of ultrasonic vibration in human sperm cryopr eservationasanovelmethod forthemodificationof physicochemical characteristicsof freezingmedia[J].Scientific Reports，2019，9（1）：10066-10070.

[61]IsachenkoE，IsachenkoV，KatkovII，etal.DNA integrity and motility ofhuman spermatozoa after standard slow freezing versus cryoprotectant-free vitrification[J]. HumanReproduction，2004，19（4）：932-939.

[62]KatkovII，IsachenkoV，IsachenkoE，etal.Low -andhigh-temperaturevitrification asanewapproach to biostabilization of reproductive and progenitor cells [J].International JournalofRefrigeration，2OO6，29（3）： 346 -357.

[63]Moskovtsev SI，Lulat AG M，Librach CL. Cryopreservation of human spermatozoa by vitrification vs. slow freezing：Canadian experience[J].Current Frontiers inCryobiology，2012：77-100.

[64]SchusterTG，KellerLM，DunnRL，etal.Ultra -rapid freezing of very low numbers of sperm using cryoloops[J].Human Reproduction，2003，18（4） ：788-95.

[65] Zhou D，WangXM，Li R X，et al. Improving native human sperm freezing protection by using a modified vitrificationmethod[J].AsianJournalofAndrology，2021， 23（1） ：91-96.

[66]NawrothF，Isachenko V，Dessole S，et al.Vitrification of human spermatozoa without cryoprotectants[J]. CryoLetters，2002，23（2）：93-102.

[67]Schulz M，Risopatrn J，Matus G，et al.Trehalose sustainsa higherpost-thaw sperm motilitythan sucrose invitrified human sperm[J].Andrologia，2O17，49 （9） ：e12757.