摘要

本研究將改良的疊氮溴化丙錠（PMAxx）與熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（qPCR）相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出一種精準(zhǔn)高效、靈敏特異的PMAxxqPCR檢測(cè)方法，用于梨火疫病菌Erwinia amylovora活細(xì)胞的定量檢測(cè)。通過(guò)控制變量的單因素變化試驗(yàn)對(duì)PMAxx預(yù)處理體系中的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確立了PMAxx終濃度為15 μmol/L，黑暗孵育時(shí)間為15 min，曝光時(shí)間為8 min的PMAxx預(yù)處理體系，可有效抑制1. 0×108 cfu/mL梨火疫死菌的DNA擴(kuò)增，對(duì)梨火疫活菌DNA的擴(kuò)增無(wú)影響。本文開(kāi)發(fā)的PMAxxqPCR檢測(cè)技術(shù)可于特定范圍內(nèi)有效地排除死菌干擾，適用于菌液濃度在103～108 cfu/mL范圍內(nèi)的活菌數(shù)精準(zhǔn)定量。為進(jìn)一步深入探究梨火疫病的流行規(guī)律提供新的技術(shù)支持，并有效防止在實(shí)際樣本的PCR檢測(cè)中出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞

梨火疫病; PMAxxqPCR檢測(cè)技術(shù); 活菌檢測(cè)

中圖分類號(hào)：

S 436.612.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024448

Development of a PMAxxqPCR method for quantitative detection of viable Erwinia amylovora

HAN Wenchao1， XU Jingsheng1， HUANG Hongkun2， LI Zhiming1， YANG Xiaoxin1， XU Jin1*， FENG Jie1*

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 2. Rural Energy and Environment

Agency， Ministry of Agricultural and Rural Affairs， Beijing 100125， China）

Abstract

In this study， an improved propidium monoazide dye （PMAxx） was combined with quantitative realtime PCR （qPCR） to establish a rapid， sensitive， and highly specific method （PMAxxqPCR） for the quantitative detection of viable Erwinia amylovora cells， the causative agent of fire blight. Key parameters of the PMAxx treatment system were optimized through singlevariable tests. The optimal conditions were determined as a final PMAxx concentration of 15 μmol/L， dark incubation for 15 min， and light exposure for 8 min. Under these conditions， amplification of inactivated cells at a concentration of 1.0×108 cfu/mL was effectively suppressed， while amplification of viable cells was not affected. The PMAxxqPCR assay demonstrated reliable quantification of viable E.amylovora cells within the range of 103 to 108 cfu/mL， effectively eliminating interference from dead cells. This method provides robust technical support for epidemiological studies of fire blight and offers a solution to the issue of 1 positives in routine PCR diagnostics due to the presence of dead bacterial cells.

Key words

fire blight; PMAxxqPCR; viable cell detection

梨火疫?。╢ire blight）是由解淀粉歐文氏菌Erwinia amylovora，俗稱梨火疫病菌引起的蘋果和梨等薔薇科植物上最具毀滅性的細(xì)菌病害［1］。梨火疫病傳播速度快、危害嚴(yán)重，且系統(tǒng)性侵染的特性可致罹病植株死亡，嚴(yán)重暴發(fā)時(shí)造成毀園［2］。梨火疫病1780年首次于美國(guó)紐約州的哈德遜河流域被發(fā)現(xiàn)，隨后蔓延至西海岸的華盛頓州;此后的數(shù)十年間，漸次擴(kuò)散蔓延至英國(guó)、法國(guó)、比利時(shí)、荷蘭等歐洲國(guó)家。歐洲和地中海植物保護(hù)組織（European and Mediterranean Plant Protection Organization，EPPO）官方數(shù)據(jù)顯示，目前梨火疫病廣泛分布于歐洲、美洲、大洋洲、非洲和亞洲的40多個(gè)國(guó)家［3］。作為我國(guó)的局部入侵物種，梨火疫病2016年在新疆霍城縣首次被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在新疆、甘肅兩個(gè)省區(qū)的70多個(gè)市縣區(qū)被發(fā)現(xiàn)，危害香梨、蘋果、杏、山楂、榅桲和杜梨等薔薇科寄主植物，并造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，被我國(guó)分別列入重大外來(lái)檢疫性有害生物名錄和一類病蟲害名錄［4］。

活的不可培養(yǎng)狀態(tài)（viable but nonculturable，VBNC）是細(xì)菌為應(yīng)對(duì)逆境脅迫普遍采取的一種生存策略。即該狀態(tài)下的菌體細(xì)胞以最低的代謝水平維持其自身活力，但喪失了可人工培養(yǎng)的特性［56］。采用傳統(tǒng)平板分離的鑒定方法，因該細(xì)菌的VBNC狀態(tài)會(huì)造成假陰性檢測(cè)結(jié)果;PCR［7］等基于傳統(tǒng)體外擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法，因無(wú)法區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞的DNA，可導(dǎo)致假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。基于菌體細(xì)胞膜完整性［811］、代謝活性［12］與基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)常被用于區(qū)分細(xì)菌的活細(xì)胞與死細(xì)胞。Viability qPCR（vqPCR）是目前被廣泛使用的活菌定量PCR檢測(cè)方法。該方法的原理為溴化乙錠單疊氮化物（ethidium monoazide bromide，EMA）［1314］、疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）［911］及其升級(jí)替代產(chǎn)品PMAxx［15］等具有DNA高親和性的光反應(yīng)材料，經(jīng)過(guò)強(qiáng)光處理后，可穿透死菌或受損菌的細(xì)胞膜并與其雙鏈DNA分子形成共價(jià)氮鍵，進(jìn)而阻礙DNA分子進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。但該類光敏材料無(wú)法進(jìn)入具完整細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的活菌細(xì)胞內(nèi)，因此不影響活細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)［16］。再結(jié)合平板計(jì)數(shù)法，便可以很好地檢測(cè)VBNC狀態(tài)的細(xì)胞。

2006年，Ordax等［17］首次報(bào)道了銅離子可誘導(dǎo)梨火疫病菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，且隨著銅離子濃度的升高，進(jìn)入該狀態(tài)時(shí)間縮短。但迄今為止尚不明確自然條件下進(jìn)入VBNC狀態(tài)的梨火疫病菌群體在梨火疫病侵染循環(huán)與傳播擴(kuò)散中的作用。因此，本研究以梨火疫病菌致病相關(guān)核心基因hrpN為檢測(cè)靶標(biāo)，旨在建立精準(zhǔn)高效、靈敏通用的梨火疫病菌活細(xì)胞PMAxxqPCR檢測(cè)方法，為深入探究梨火疫病的生態(tài)流行學(xué)規(guī)律、偵檢阻斷病害隨帶菌苗木進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗(yàn)所有供試菌株（表1）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所作物細(xì)菌病害組分離、保存。

1.2 主要試劑和儀器

培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，酵母粉0.5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL;梨火疫病菌半選擇培養(yǎng)基（CCT semiselective medium）：蔗糖100 g，山梨醇10 g，營(yíng)養(yǎng)瓊脂23 g，結(jié)晶紫2 mL。

儀器：590 W白熾燈購(gòu)自德國(guó)Osram公司;ABI 7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystem公司;SPECORD40紫外分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Analytik Jena AG公司;INFORS Ecotron 振蕩培養(yǎng)箱購(gòu)自瑞士INFORS 公司;Memmert IN55培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)美爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)、DNA提取與菌懸液制備

無(wú)菌條件下以接種環(huán)蘸取-80℃保存的各供試菌株懸浮液，梨火疫病菌、亞洲梨火疫病菌菌株于CCT培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，其他菌株于NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。28℃培養(yǎng)48 h后，采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取各參試菌株基因組DNA。挑取梨火疫病菌Ea1菌株典型單菌落，轉(zhuǎn)接至CCT培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8～1.0，比濁法［18］配制濃度為1.0×108 cfu/mL的菌懸液備用。100℃水浴30 min，獲得熱滅活的死菌細(xì)胞懸浮液。

1.3.2 熒光定量PCR檢測(cè)體系

以梨火疫病菌的10個(gè)核心致病基因?yàn)楹蜻x檢測(cè)靶標(biāo)，使用Primer Express軟件設(shè)計(jì)引物和探針。最終根據(jù)GenBank中梨火疫病菌的hrpN基因部分保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針（表2），擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為165 bp。以12個(gè)梨火疫病菌菌株與7個(gè)非靶標(biāo)細(xì)菌測(cè)試所設(shè)計(jì)的探針和引物的通用性和特異性（ABI 7500型熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystem公司）。其中，12個(gè)供試?yán)婊鹨卟【攴蛛x于不同寄主和地區(qū)（表1），對(duì)照為和梨火疫病菌從同一生境里分離出來(lái)的成團(tuán)泛菌、黏質(zhì)沙雷氏菌、枯草芽胞桿菌以及亞洲梨火疫病菌、茄科雷爾氏菌、熒光假單胞菌和番茄細(xì)菌性潰瘍病菌。將梨火疫病菌Ea1菌株的基因組DNA和菌懸液初始濃度調(diào)至50 ng/μL和1×108 cfu/mL，10倍梯度系列稀釋至5 fg/μL和1×102 cfu/mL。分別以不同濃度的DNA和菌懸液為模板，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，測(cè)試所設(shè)計(jì)的探針和引物的靈敏度。PCR反應(yīng)體系為（20 μL）：Probe qPCR Mix（2×）10 μL， 10 μmmol/L上、下游引物各0.4 μL，探針0.8 μL，ROX DyeⅡ（50×） 0.2 μL，模板2 μL，超純水6.2 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s（收集熒光信號(hào)），共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后，以菌液濃度和DNA濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 PMAxx預(yù)處理體系優(yōu)化

母液濃度為20 mmol/L的PMAxxTM（PMAxxTM Dye，美國(guó)Biotum公司）使用前加入超純水稀釋，制成1 mmol/L的PMAxx工作液，-20℃避光保存。

1.3.3.1 PMAxx最佳濃度篩選

在避光條件下，將PMAxx分別加至含有200 μL濃度為108 cfu/mL的活菌和死菌懸浮液的離心管中，使PMAxx終濃度分別為0、4、8、10、15、25 μmol/L，輕輕振蕩混勻，錫箔紙包好在黑暗中孵育15 min后，曝光冰浴8 min，將處理過(guò)的菌液用TIANamp Bacteria DNA Kit提取菌懸液中DNA作為熒光定量PCR的模板，按1.3.2的方法進(jìn)行qPCR。

1.3.3.2 PMAxx曝光時(shí)間的優(yōu)化

將PMAxx分別加至含有200 μL濃度為108 cfu/mL的死菌和活菌懸浮液的離心管中，使PMAxx終濃度為15 μmol/L（經(jīng)過(guò)篩選的最適濃度），隨即將其置于黑暗孵育15 min，分別曝光冰浴0、4、8、10、15、25 min，然后按照1.3.2的方法進(jìn)行qPCR。

1.3.4 死、活細(xì)胞混合體系的PMAxxqPCR檢測(cè)

為了驗(yàn)證PMAxxqPCR的準(zhǔn)確性，將熱滅活菌和活菌按照不同的比例混合，得到活菌占比分別為0、10%、20%、50%、80%、100%的活菌死菌混合液，分別進(jìn)行PMAxxqPCR和普通熒光定量qPCR檢測(cè)。菌懸液按照1.3.3.1方法處理，PMAxx最終濃度為15 μmol/L，黑暗孵育15 min，光解8 min。

另將比濁法配制的1.0×108 cfu/mL菌懸液10倍梯度稀釋，分別得到1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104 cfu/mL的菌懸液，按照優(yōu)化的PMAxx預(yù)處理體系對(duì)不同濃度的菌懸液進(jìn)行處理，然后使用TIANamp Bacteria DNA Kit分別提取其基因組DNA，作為熒光定量qPCR的模板繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 PMAxxqPCR檢測(cè)體系應(yīng)用

從新疆伊犁采集5份梨火疫病株的葉片和花簇樣本。樣本經(jīng)表面消毒后，切取小塊病健交界處組織，以剪刀剪碎，于1 mL無(wú)菌水中浸泡30 min，使病原體充分釋放到水中，形成菌液，12 000 r/min離心15 min，去掉上清液后，再加入500 μL的滅菌水懸浮沉淀，以此作為目標(biāo)模板來(lái)進(jìn)行qPCR和PMAxxqPCR反應(yīng)，同時(shí)在CCT培養(yǎng)基上進(jìn)行稀釋涂板，通過(guò)比較這2種檢測(cè)方法的結(jié)果來(lái)評(píng)估本研究建立的檢測(cè)方法對(duì)梨火疫樣本的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立、靈敏性及特異性測(cè)定

分別以不同濃度梯度的DNA和菌懸液為模板，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，模板濃度不小于50 fg/μL或1×103 cfu/mL時(shí)，所有反應(yīng)的CT值均小于35。因此，以DNA為檢測(cè)模板時(shí)，50 fg/μL為熒光定量PCR檢測(cè)的下限濃度;以菌懸浮液為模板時(shí)檢測(cè)下限為1×103 cfu/mL。以梨火疫病菌基因組DNA濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的CT值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建得到的回歸方程為Y=-3.289 9X+34.951，R2=0.999，表明DNA濃度與CT值之間存在極佳的線性關(guān)系（圖1a）。以梨火疫病菌菌懸液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的CT值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建得到的回歸方程為Y=-3.307 4X+42.704，R2=0.999，表明菌懸液濃度與CT值之間存在極佳的線性關(guān)系（圖1b）。

以12個(gè)梨火疫病菌菌株和其他7種植物病原或環(huán)境菌株為測(cè)試對(duì)象，評(píng)價(jià)了所建立的qPCR檢測(cè)體系的通用性和特異性（表1）。結(jié)果表明：12個(gè)參試?yán)婊鹨卟【陿悠返腃T值均在20以下，該體系可精準(zhǔn)檢測(cè)到來(lái)源不同分離寄主的梨火疫病菌。所有對(duì)照菌株的CT值均大于35，判定為陰性檢測(cè)結(jié)果（圖2）。因此證明了該檢測(cè)體系具有高度的特異性和通用性?；谝陨辖Y(jié)果，我們證實(shí)熒光定量PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)梨火疫病菌的DNA和菌懸液樣品，并且后期研究中可以通過(guò)CT值來(lái)間接評(píng)估DNA濃度，為病害的早期診斷和監(jiān)測(cè)提供了有力的工具。

2.2 PMAxx預(yù)處理反應(yīng)體系優(yōu)化

2.2.1 PMAxx最適濃度的篩選

用終濃度為0、4、8、10、15 μmol/L和25 μmol/L的PMAxx對(duì)108 cfu/mL的活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行懸浮處理，結(jié)果表明（圖3）：當(dāng)PMAxx小于15 μmol/L時(shí)，隨著PMAxx濃度的增大，CT值也隨之增大，當(dāng)PMAxx終濃度≥15 μmol/L，E.amylovora死細(xì)胞DNA的qPCR擴(kuò)增CT值不再顯著升高（圖3），且當(dāng)PMAxx終濃度為15 μmol/L時(shí)， E.amylovora活細(xì)胞幾乎不受影響。因此，當(dāng)PMAxx終濃度為15 μmol/L時(shí)，既能完全抑制E.amylovora菌懸液死細(xì)胞DNA擴(kuò)增，又對(duì)活細(xì)胞DNA擴(kuò)增無(wú)顯著影響，表明PMAxx濃度為15 μmol/L時(shí)，可作為 PMAxxqPCR檢測(cè)區(qū)分E.amylovora純培養(yǎng)死、活細(xì)胞的最適濃度。

2.2.2 最佳曝光時(shí)間的篩選

在暗反應(yīng)階段，本試驗(yàn)將避光孵育的時(shí)間設(shè)定為15 min，以確保PMAxx能夠與死細(xì)胞中的DNA充分結(jié)合。通過(guò)設(shè)置不同的時(shí)間來(lái)篩選PMAxx預(yù)處理最佳的曝光時(shí)間，曝光時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)表明（圖4），對(duì)熱滅活的梨火疫病菌死菌進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，當(dāng)曝光時(shí)間小于8 min時(shí)，隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，擴(kuò)增的CT值顯著增加，這是因?yàn)樵谄毓膺^(guò)程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，PMAxx與熱滅活菌死細(xì)胞DNA的交聯(lián)結(jié)合率升高，從而對(duì)死細(xì)胞DNA擴(kuò)增的抑制作用增強(qiáng)，8 min后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，CT值不再顯著升高，說(shuō)明曝光8 min可使得PMAxx與熱滅活菌死細(xì)胞的DNA最大程度地交聯(lián)，從而有效避免死細(xì)胞DNA的擴(kuò)增，而隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌擴(kuò)增的CT值無(wú)顯著變化，這是因?yàn)镻MAxx不能進(jìn)入到活細(xì)胞內(nèi)與DNA分子結(jié)合，而在曝光處理過(guò)程中被光解，并未對(duì)后續(xù)的熒光定量PCR產(chǎn)生影響。因此選擇8 min作為最佳的曝光時(shí)間。

2.3 PMAxxqPCR檢測(cè)不同比例的活菌

將不同比例的梨火疫活菌死菌混合，并分別以2 μL不同濃度的菌懸液樣本作為熒光定量qPCR的模板，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以梨火疫病原菌DNA濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)，建立回歸方程（圖5a），Y=-3.290X+41.53，R2=0. 999，且擴(kuò)增效率良好。

將梨火疫病原菌不同濃度活細(xì)胞與死細(xì)胞等體積混合均勻，活細(xì)胞懸浮液百分比為100％、80％、50％、20％和10％，分別進(jìn)行qPCR和PMAxxqPCR檢測(cè)。結(jié)果表明，直接進(jìn)行qPCR時(shí)，無(wú)論活細(xì)胞比例如何變化，其CT值都呈現(xiàn)一個(gè)穩(wěn)定的趨勢(shì)，而經(jīng)PMAxx處理的死、活細(xì)胞體系，隨著活細(xì)胞比例下降，CT值呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，在18.75～28.10之間。且當(dāng)活菌比例大于10％時(shí)，理論值與實(shí)測(cè)值之間呈良好的線性關(guān)系：Y=0.785 6X+1.556 7，R2=0.992（圖5b）。結(jié)果表明，PMAxxqPCR可以對(duì)菌懸液中的死、活細(xì)胞進(jìn)行有效的區(qū)分，并對(duì)活細(xì)胞DNA選擇性地進(jìn)行qPCR擴(kuò)增;而直接qPCR檢測(cè)方法無(wú)法區(qū)分死、活細(xì)胞，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果濃度高于實(shí)際活細(xì)胞濃度。

2.4 PMAxxqPCR檢測(cè)體系應(yīng)用

預(yù)處理后的田間病株懸浮液樣品，分別采用qPCR與PMAxxqPCR技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行了檢測(cè)，并同步實(shí)施了稀釋平板涂布法以進(jìn)行微生物培養(yǎng)。結(jié)果顯示（表3），5份樣品qPCR檢測(cè)結(jié)果的CT值為19.79～34.75，而PMAxxqPCR所測(cè)的CT值則為 21.14～35.43，活菌數(shù)介于7.08×101～1.58×106 cfu/mL，PMAxxqPCR的檢測(cè)結(jié)果與平板涂布法的結(jié)果高度吻合（表3）。其中樣品1活菌數(shù)為2.24×102 cfu/mL，但平板分離未觀察到梨火疫病菌的菌落，以此推測(cè)該樣品已完全進(jìn)入了VBNC狀態(tài)。因此該方法證實(shí)了PMAxxqPCR技術(shù)能夠特異性地識(shí)別并擴(kuò)增活細(xì)胞內(nèi)的DNA，而平板分離法則可有效補(bǔ)充驗(yàn)證了這一技術(shù)的有效性。

3 結(jié)論與討論

梨火疫病菌可侵染寄主植物的莖、葉、花、果實(shí)等幾乎所有器官，并形成系統(tǒng)侵染。梨火疫病的侵染循環(huán)緊密伴隨寄主植物的物候期。通常認(rèn)為貫穿于寄主植物的整個(gè)休眠期，梨火疫病菌以休眠狀態(tài)在罹病植株的潰瘍斑中越冬［19］。早春季節(jié)隨著寄主的萌發(fā)，潰瘍斑中的病原菌隨之激活增殖成為重要初侵染源，并通過(guò)風(fēng)雨與媒介昆蟲侵染花器，開(kāi)啟新生長(zhǎng)季的侵染循環(huán)［19］。相關(guān)研究表明，梨火疫病原菌可以在銅離子［16］、低溫［21］、次氯酸鈉［22］誘導(dǎo)下進(jìn)入VBNC狀態(tài)，并可通過(guò)添加EDTA、檸檬酸、天冬氨酸以及回接寄主植物幼苗恢復(fù)進(jìn)入VBNC狀態(tài)梨火疫病菌群體的可培養(yǎng)性［2324］。但迄今為止，梨火疫病菌是否能以VBNC狀態(tài)存活于僵果、土壤、隱癥寄主、非寄主植物以及蜂巢與蜂產(chǎn)品（蜂蜜、蜂蠟）中，以及VBNC狀態(tài)的梨火疫病菌群體在侵染循環(huán)發(fā)揮的作用均不明確。此外，噴灑抗生素、使用具殺菌活性的天然化合物及應(yīng)用拮抗微生物是有效防控火疫病的重要策略［27］，但是這些脅迫因素某種程度上可誘導(dǎo)梨火疫病菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)［28］。

袁英哲等基于梨火疫病菌pEA29質(zhì)粒設(shè)計(jì)了特異性引物EaP29F1/EaP29R1，建立了梨火疫病菌的PMAqPCR檢測(cè)方法［9］。但相關(guān)研究表明部分梨火疫病菌菌株中未攜帶pEA29質(zhì)粒［18］，因此該方法缺乏通用性，且染料法qPCR也易造成假陽(yáng)性的結(jié)果。Santander等［25］將PMA與Digtial PCR相結(jié)合，能有效區(qū)分梨火疫病菌的死、活細(xì)胞，但Digtial PCR系統(tǒng)成本昂貴且操作繁瑣，并不適用于大部分實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的定量檢測(cè)［26］。

本研究采用探針?lè)ǎ怨芗一驗(yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物和探針。選取了10余個(gè)管家基因作為候選檢測(cè)靶標(biāo)，最后在致病核心基因hrpN中篩選到一個(gè)具有高度通用性和特異性的新檢測(cè)靶標(biāo)。同時(shí)選擇了較PMA具有更好區(qū)分死、活菌體細(xì)胞能力的PMAxx作為染料。研究結(jié)果顯示，PMAxx終濃度為15 μmol/L，是抑制108 cfu/mL濃度梨火疫死菌DNA擴(kuò)增的最優(yōu)濃度，燈下曝光8 min為最優(yōu)曝光時(shí)間，以上結(jié)果與袁英哲等建立的梨火疫菌PMA預(yù)處理體系相比，減少了所使用的染料量和曝光時(shí)間，這可能與使用的染料不同有關(guān)。

綜上所述，本研究基于hrpN基因建立了精準(zhǔn)高效、具高度特異性和通用性的梨火疫病菌PMAxxqPCR檢測(cè)方法。該方法能在特定濃度范圍內(nèi)（103～108 cfu/mL）準(zhǔn)確測(cè)定活菌數(shù)目，為深入解析梨火疫病的生態(tài)流行學(xué)規(guī)律，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)殺菌劑防效以及帶菌苗木檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯：田 喆）