摘" 要：作為海南省萬寧市特色農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)，興隆咖啡產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展正面臨炭疽病侵害的嚴峻挑戰(zhàn)?？Х忍烤也】蓪е驴Х热~片焦枯、枝條潰瘍及漿果褐腐，是咖啡的主要病害之一。本研究在萬寧咖啡主產(chǎn)區(qū)采集咖啡炭疽病樣品并分離病原菌，通過ITS、TUB2、CHS-1、ACT、GAPDH多基因聯(lián)合分析鑒定病原菌，并基于環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）建立快速檢測體系。結(jié)果表明：（1）采集典型病樣50份，經(jīng)組織分離純化獲得炭疽菌株24株；（2）明確萬寧5個種植區(qū)的病原種群結(jié)構(gòu)包含4個炭疽菌種，即Colletotrichum tropicale、C. karstii、C. fructicola及優(yōu)勢種暹羅炭疽菌（C. siamense， 45.8%）。（3）基于TUB2基因特異區(qū)域，設計篩選得到特異性LAMP引物組Tub-L1，優(yōu)化反應體系參數(shù)為63"℃恒溫擴增50 min，內(nèi)外引物濃度比為8∶1，Mg²⁺ 8 mmol/L，dNTPs 0.8 mmol/L，無需甜菜堿。驗證試驗表明，該體系檢測靈敏度達100 pg/μL（為常規(guī)PCR的10倍）；對炭疽菌屬的7個近緣種（C. tropicale、C. fructicola、C. karstii等）及7種非靶標植物病原菌[含咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）、菜豆間座殼菌（Diaporthe phaseolorum）等]均無陽性反應。采用優(yōu)化后的LAMP檢測體系對田間采集的病害葉片樣本進行分析，所有樣品均成功檢測出暹羅炭疽菌，其結(jié)果與常規(guī)PCR檢測方法一致。綜上所述，本研究建立并優(yōu)化的咖啡炭疽病菌LAMP快速檢測體系具有操作簡便、反應高效、特異性強、靈敏度高以及結(jié)果可視化等優(yōu)勢，適用于暹羅炭疽菌（C. siamense）的田間快速檢測。該體系為咖啡炭疽菌的精準鑒定及高效檢測提供了可靠的技術(shù)支撐，對咖啡炭疽病的早期預警、病害監(jiān)測及綜合防控具有重要的實踐意義和應用價值。

關(guān)鍵詞：咖啡炭疽??；病原鑒定；環(huán)介導等溫擴增（LAMP）；檢測

中圖分類號：S435.712 """""文獻標志碼：A

Isolation， Identification of Colletotrichum siamense Causing Coffee Anthracnose in Wanning， Hainan， and Development of a Rapid LAMP Detection System

WEN Siwei， GAO Shengfeng， TIAN Tian， LIU Shichao， GOU Yafeng， ZHANG Ruonan， XUE Chao^*，

SUN Shiwei^*

Institute of Spice and Beverage Research， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops / Key Laboratory of Genetic Resource Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract： Xinglong coffee， a pillar of the local characteristic agriculture in Wanning， faces severe threats to its sustainable production from anthracnose. This disease can cause leaf scorching， branch ulcers， and berry brown rot， making it one of the major diseases in the industry. In this study， samples of coffee anthracnose were collected from the main coffee-growing areas in Wanning and the pathogenic fungi were isolated. The pathogenic fungi were identified through the combined analysis of multiple genes， including ITS， TUB2， CHS-1， ACT and GAPDH. Furthermore， a rapid detection system based on the loop-mediated isothermal amplification （LAMP） technique was established. 50 typical disease samples were collected， and through tissue separation and purification， a total of 24 Colletotrichum isolates were obtained. The pathogen population structure in the five planting areas of Wanning was clarified to comprise four species of Colletotrichum spp.： C. tropicale， C. karstii， C. fructicola， and the dominant species was C. siamense （accounting for 45.8%）. Based on the specific region of TUB2 ， a specific LAMP primer set （Tub-L1） was designed and screened. The

optimized reaction parameters were established as follows： isothermal amplification at 63"℃ for 50 minutes，

outer-inner primer concentration ratio of 8∶1， Mg²⁺ 8 mmol/L， dNTPs 0.8 mmol/L， and without the need for betaine.

Validation experiments demonstrated that the detection sensitivity of this system reached 100 pg/μL （10 times higher

than conventional PCR）. Furthermore， the system showed no positive reactions to seven closely related species within Colletotrichum spp. （including C. tropicale， C. fructicola， C. karstii） or seven non-target plant pathogens [including Hemileia vastatrix （coffee leaf rust）， Diaporthe phaseolorum， and others]. Using the optimized LAMP detection system， the diseased leaf samples collected from the field were analyzed. C. siamense was successfully detected in all samples， and the results were completely consistent with those obtained by conventional PCR methods. In summary， the LAMP-based rapid detection system for Colletotrichum sp. established and optimized in this study demonstrates significant advantages， including simplified operation， high reaction efficiency， strong specificity， enhanced sensitivity， and visualizable results， making it highly suitable for field-based rapid detection of C. siamense. This system would provide reliable technical support for the precise identification and efficient detection of coffee anthracnose fungus， and have important practical significance and application value for the early warning， disease monitoring， and integrated control of coffee anthracnose.

Keywords： coffee anthracnose; pathogen identification; loop-mediated isothermal amplification （LAMP）; detection

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.020

咖啡為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）的多年生常綠木本植物，作為熱帶與亞熱帶地區(qū)的關(guān)鍵經(jīng)濟作物，對全球熱帶農(nóng)業(yè)經(jīng)濟具有重要戰(zhàn)略意義。海南地處熱帶作物優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)，經(jīng)過百余年的栽培體系演化，現(xiàn)成為我國中粒種咖啡（Coffea canephora var. robusta）的核心生產(chǎn)區(qū)域。萬寧市在海南咖啡產(chǎn)業(yè)布局中占核心地位，是當前海南省咖啡種植和收獲面積最大的產(chǎn)區(qū)，其“興隆咖啡”憑借獨特的風味特征和卓越的品質(zhì)表現(xiàn)，在國內(nèi)外咖啡市場中享有較高知名度，成功塑造了海南咖啡的地域品牌形象^[1-2]。

咖啡的生長種植過程中易受到多種病原物的侵染，由炭疽菌屬（Colletotrichum spp.）引起的咖啡炭疽病是許多咖啡種植國咖啡高質(zhì)量生產(chǎn)的主要限制因素，我國云南、海南等咖啡種植區(qū)均有發(fā)現(xiàn)該病為害，且為害程度不斷加重^[3]?？Х忍烤也≈苣臧l(fā)生，病原菌能夠侵染咖啡植株的多個部位，包括嫩葉、枝條以及果實等，引發(fā)葉片脫落、枝條枯死、果實腐爛，嚴重時甚至整株死亡^[4]。例如漿果炭疽菌（Colletotrichum kahawae）對高海拔地區(qū)種植的小粒種咖啡（Coffea arabica）造成嚴重威脅，該病原菌已列入我國進境植物檢疫性有害生物名單，該病原菌引起的咖啡漿果病致使非洲地區(qū)咖啡漿果產(chǎn)量損失高達80%^[5-7]。咖啡炭疽病的發(fā)病率與當?shù)貧夂驐l件密切相關(guān)。研究表明，氣溫20"℃左右、相對濕度90%以上（持續(xù)7 h以上）的冷涼高濕環(huán)境為該病原菌侵染的最適條件，特別是長期干旱后的連續(xù)降雨期間，咖啡炭疽病的發(fā)病率與病情指數(shù)往往達到最大值，常在9—11月達到峰值^[8-9]。

炭疽菌屬真菌廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。由于其寄主廣泛，侵染咖啡的炭疽菌種類呈高度多樣性，且優(yōu)勢病原種群分布與地理環(huán)境、寄主品種顯著相關(guān)^[3]。CRISTóBAL-MARTíNEZ等^[10]通過多基因系統(tǒng)發(fā)育分析對墨西哥小粒種咖啡的炭疽病菌進行研究，鑒定出C. gigasporum、C. siamense、C. karstii、C. gloeosporioides和C. theobromicola五個種。CAO等^[3]在海南5個咖啡種植區(qū)（涵蓋小粒種與中粒種），共鑒定出8個炭疽菌種，包括C. fructicola、C. siamense、C. tropicale等。目前國內(nèi)對于咖啡炭疽菌的病原鑒定與檢測研究中主要依賴于常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR（qPCR）、巢式PCR等方法。然而，這些技術(shù)存在操作流程復雜、設備要求高等局限性，難以滿足田間快速診斷病原的需求。因此，開發(fā)一種基于環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）的高靈敏度、高特異性的快速檢測方法，對于實現(xiàn)咖啡炭疽病的早期預警和精準防控具有重要的實踐意義。

LAMP是由NOTOMI等^[11]于2000年研發(fā)的新型等溫核酸擴增技術(shù)。該技術(shù)具有操作簡便（無需熱循環(huán)儀器）、特異性強、靈敏度高等技術(shù)優(yōu)勢，在植物真菌、細菌、病毒的檢測等領域得到了廣泛應用，顯著提升了田間病原物的診斷效率^[12]。馬駿^[13]基于比較基因組學篩選出果生炭疽菌（C. fructicola）的特異性分子標記，成功建立了針對山核桃（Carya cathayensis）葉部病原真菌的LAMP快速檢測體系，該體系可在接種病原菌72"h后準確檢測出山核桃葉片病斑中的病原菌。汪涵^[14]針對甘蔗褐銹病菌（Puccinia melanocephal）和咖啡葉銹病菌（Hemileia vastatrix）ITS基因的保守區(qū)域設計特異性引物構(gòu)建LAMP體系，試驗數(shù)據(jù)顯示，該體系對2種病原物的檢測效率均高于普通PCR。秦艷紅等^[15]以SYBR Green Ⅰ為熒光指示劑，建立了針對地黃花葉病毒（ReMV）的逆轉(zhuǎn)錄LAMP（RT-LAMP）體系，陽性檢出率達98.3%，遠高于常規(guī)RT-PCR（75.0%）。

炭疽菌屬因種內(nèi)遺傳多樣性豐富，受到環(huán)境因子、寄主差異等因素的影響，基于表型特征（菌落形態(tài)、培養(yǎng)性狀及致病性等）的傳統(tǒng)分類體系存在穩(wěn)定性缺陷。本研究以咖啡炭疽病樣品為研究對象，開展多位點系統(tǒng)發(fā)育分析，明確了暹羅炭疽菌（C. siamense）為咖啡炭疽病的優(yōu)勢致病種，進而針對其β-tubulin（TUB2）基因保守區(qū)域設計特異性引物，經(jīng)反應參數(shù)優(yōu)化、特異性驗證及靈敏度檢測，系統(tǒng)構(gòu)建LAMP快速檢測體系，以期為咖啡炭疽病的早期診斷與田間預警提供高效檢測技術(shù)。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1 "供試材料" 于2022年對海南省萬寧市的3個咖啡種植園與中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所的2個試驗基地（分別為興隆熱帶植物園與大路試驗示范基地）開展咖啡病害發(fā)生情況的實地調(diào)查。在調(diào)查過程中，采用隨機法、五點取樣法，采集具有咖啡炭疽病典型癥狀（如出現(xiàn)黑點、萎縮病變等）的枝條樣本，將其裝入樣本袋后帶回實驗室，在4"℃條件下保存。共采集50份樣本進行菌株的分離、純化。所有分離獲得的菌株均保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所。

1.1.2" 主要試劑 "Taq酶、Bst DNA酶以及配套的Buffer、MgSO₄、dNTPs購自南京諾維贊生物科技股份有限公司；甜菜堿（betaine）與熒光指示劑SYBR Green Ⅰ（10 000×）購自索萊寶科技有限公司（北京）；DL2000 DNA marker與DL2000 plus marker購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.2" 方法

1.2.1 "多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育鑒定 "選取ITS、TUB2、GAPDH、CHS-1、ACT^[16-19]5個保守序列基因位點的通用引物（表1）進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為50 μL，包括DNA模板2"μL，2×Taq Master Mix 25 μL，10 μmol/L正反向引物各2 μL，ddH₂O 19 μL。PCR反應程序：95"℃預變性 3 min；95"℃變性15 s，55"℃退火15 s，72"℃延伸1 min，循環(huán)30次；72"℃終延伸5 min。PCR擴增結(jié)束后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，將產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的測序結(jié)果提交至NCBI GenBank進行BLASTn同源性比對，篩選同源性gt;98%的參考菌株序列。所有供試菌株及參考菌株序列均通過MEGA 7軟件的CustalW模塊進行多序列比對，利用TBtools 2軟件截取過濾低質(zhì)量位點，最終采用最大似然法（maximum likelihood， ML）構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹（最佳模型：TN93+G，bootstrap：1000）。

1.2.2 "LAMP體系的建立與可視化結(jié)果" 基于LAMP初步反應體系（表2），參照Bst DNA Polymerase Large Fragment說明書設置等溫擴增參數(shù)：60"℃恒溫反應60 min，80"℃滅活10 min終止反應。顯色檢測時加入2 μL SYBR Green Ⅰ（終濃度1×），觀察反應溶液的顏色變化。陽性擴增的反應液呈黃綠色熒光，陰性對照保持橙色；同步通過瓊脂糖凝膠驗證其擴增特異性，陽性產(chǎn)物顯示梯形條帶，陰性樣本無條帶。試驗全程設立陰性對照（無模板DNA）以確保檢測特異性。

1.2.3 "LAMP引物設計" 基于咖啡暹羅炭疽（C. siamense）菌株TUB2的種內(nèi)多序列比對結(jié)果，尋找序列特異區(qū)域。采用Primer Explorer V5（http：// primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）對保守差異片段進行LAMP引物設計，包括外部引物對F3和B3、內(nèi)部引物對FIP和BIP、環(huán)引物LoopF和LoopB；參照自由能（ΔG≤-4.0 kcal/mol）與GC含量（40%～60%）等條件進行篩選，篩選獲得2組候選引物（表3），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物驗證同1.2.2，進行熒光顯色（SYBR Green I）與瓊脂糖凝膠電泳（1%）。針對常規(guī)PCR中TUB2通用引物（Bt2a/Bt2b）種間特異性不足的問題，通過Primer Primier 6設計物種特異性TUB2引物，用于后續(xù)靈敏度分析及田間樣本特異性驗證。

1.2.4 "LAMP體系反應條件的優(yōu)化" 為確定LAMP反應的最佳溫度，設置6個反應溫度，分別為54、57、60、63、65、70"℃，在各設定溫度下進行反應。同時，為優(yōu)化反應時間，選擇8個反應時長（20～90 min，間隔10 min）進行對比試驗。

在時間與溫度優(yōu)化的基礎上，進一步對體系組分進行優(yōu)化。首先是內(nèi)外引物配比優(yōu)化，設定內(nèi)外引物比分別為8∶1、6∶1、4∶1、2∶1；鑒于Mg²⁺濃度影響DNA聚合酶活性，試驗分別設置2、3、4、6、8、10、12 mmol/L Mg²⁺濃度梯度。而dNTPs作為擴增反應的原料，優(yōu)化其濃度（測試濃度為0～1.6 mmol/L，以0.2 mmol/L遞增），避免因其過少限制擴增效率或過多導致非特異性擴增。此外，甜菜堿能夠促進DNA解鏈并減少二級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，在LAMP反應中作為輔助劑，通過0～1.6 mmol/L（間隔0.2 mmol/L）濃度梯度進行甜菜堿的用量優(yōu)化。分析流程參照1.2.2。

1.2.5" LAMP體系靈敏度與特異性驗證" 將已知濃度為10 ng/μL的咖啡炭疽菌DNA模板進行系列稀釋，設置濃度梯度為10"ng/μL、1"ng/μL、100"pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL，將不同濃度的模板加入體系中進行反應，以確認該體系的最低檢測限。在特異性驗證中，選取咖啡葉片以及已鑒定的7種植物病原菌：黑孢菌（Nigrospora oryzae）、菜豆間座殼菌（Diaporthe phaseolorum）、茄腐鐮刀菌（Fusarium solani）、咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）、咖啡尾孢菌（Cercospora coffeicola）、線淺孔菌（Grammothele lineata）、首都葉點霉（Phyllosticta capitalensis）。提取上述樣品DNA加入LAMP體系中進行擴增，同時結(jié)合常規(guī)PCR擴增靶標基因進行測序。分析方法同1.2.2。

1.2.6 "優(yōu)化后的LAMP體系對田間咖啡病原物的檢測 "提取田間采集疑似炭疽病感染的咖啡病葉組織DNA，并將其作為模板引入優(yōu)化后的LAMP檢測體系中進行擴增，同時加入非炭疽菌樣品進行檢測。分析方法同1.2.5。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 炭疽病樣本采集及病原菌分離

田間調(diào)查表明，在5個咖啡種植園中，均為中粒種咖啡呈現(xiàn)明顯感病性（圖1）。炭疽病侵染葉片呈現(xiàn)多階段病理特征：初期葉表出現(xiàn)黃褐色至黑褐色壞死斑；進展期病斑擴展，邊緣可見暗褐色同心輪紋；后期癥狀嚴重，發(fā)展為帶有黑色膿腫同心環(huán)的凹陷壞死病變。該病表現(xiàn)出全生育期侵染特性，在營養(yǎng)生長期、果實發(fā)育期均可造成典型病癥。

對采集的病葉樣本進行組織分離，共分離純化獲得24個炭疽菌株，其地理分布信息見表4。在PDA培養(yǎng)基上，各菌株菌落均呈現(xiàn)典型形態(tài)特征：菌落直徑35～48 mm（培養(yǎng)第5天），中央?yún)^(qū)域為棉絮狀白色菌絲體，邊緣呈波狀或纖毛狀擴展，并逐漸過渡為灰色至炭黑色，難以依據(jù)菌落形態(tài)學特征進行分組，部分菌落形態(tài)見圖2。

2.2 "多基因聯(lián)合鑒定結(jié)果

采用MEGA軟件構(gòu)建基于最大似然法（maximum likelihood， ML）的系統(tǒng)發(fā)育樹，對目標基因序列進行多序列比對及修剪。分析的基因片段順序及長度如下：ITS（1～502 bp）、TUB2（503～885 bp）、CHS-1（886～1076 bp）、ACT（1077～1289 bp）、GAPDH（1290～1475 bp）。24株炭疽病菌被劃分為C. tropicale、C. karstii、C. fructicola、C. siamense 4個類群（圖3）。其中，C. siamense分支包含11個菌株（占總數(shù)的45.8%），且該分支菌株廣泛分布于5個采樣地點，顯示出顯著的地理分布優(yōu)勢。

2.3" LAMP體系引物的篩選

基于TUB2基因保守區(qū)設計的LAMP引物特異性評估顯示，Tub-L1引物有且僅對C. siamense產(chǎn)生典型LAMP擴增特征，而其余7個炭疽菌屬菌株樣品（包括C. fructicola、C. gloeosporioides等）均未檢測到特異性擴增條帶（圖4A、圖4B）；Tub-L2引物組在2號（C. siamense）和4號（C. fructicola）樣本中引發(fā)特異性擴增（圖4C、圖4D）?；谠囼炐始耙锾禺愋则炞C，最終選定Tub-L1引物（圖5）作為后續(xù)檢測體系的試驗引物。

2.4" LAMP體系的優(yōu)化

2.4.1" LAMP體系溫度與反應時間優(yōu)化 "如圖6所示，LAMP擴增體系在60～65"℃的溫度范圍內(nèi)均能實現(xiàn)特異性擴增，均呈現(xiàn)明顯的黃綠色陽性顯色反應，其中63"℃條件下擴增產(chǎn)物的電泳條帶最清晰，表明該溫度為最適反應溫度。

基于上述溫度參數(shù)，通過時間梯度試驗進一步優(yōu)化，結(jié)果表明，40 min反應體系就可檢測到典型梯形條帶，其擴增效率與90 min組無明顯差異（圖7）。鑒于LAMP技術(shù)快速檢測的特性，綜合檢測靈敏度與時效性，選擇50 min作為標準反應時間。對于低拷貝樣本，建議適當延長反應時間至60 min以提高產(chǎn)物積累量，此時體系仍能保持良好擴增特異性。

2.4.2" LAMP體系各組分最適濃度篩選" 通過引物濃度配比試驗發(fā)現(xiàn)，當體系內(nèi)外引物比（F3/ B3∶FIP/BIP）為2∶1時無擴增條帶，而4∶1、6∶1、8∶1組均能產(chǎn)生特異性擴增產(chǎn)物；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，8∶1組擴增條帶亮度明顯高于其他組（圖8），故維持初始引物濃度比（8∶1）。

針對Mg²⁺濃度的梯度試驗表明，4～8 mmol/L范圍內(nèi)均能實現(xiàn)靶標擴增，其中8 mmol/L組擴增效率最高，產(chǎn)物梯形條帶亮度明顯（圖9）。dNTPs濃度優(yōu)化結(jié)果顯示，0.8～1.8 mmol/L濃度區(qū)間均可完成有效擴增，但0.8 mmol/L濃度擴增效率與高濃度組無明顯差異（圖10），且低濃度的dNTPs能有效降低焦磷酸鎂沉淀風險。

甜菜堿濃度（0.8～1.6 mmol/L）的梯度試驗表明，其濃度變化對擴增效率及產(chǎn)物積累量無明顯影響（圖11），證實該體系對甜菜堿無依賴性?；诔杀拘б娣治?，最終確立TUB2靶標檢測咖啡炭疽菌的優(yōu)化體系為：8 mmol/L Mg2?、0.8"mmol/L dNTPs，且無需添加甜菜堿。

2.4.3" LAMP體系反應靈敏度與特異性驗證" 對梯度稀釋模板進行靈敏度驗證顯示，該體系檢測限為100 pg/μL，模板濃度為10 pg/μL時無條帶（圖12）。值得注意的是，常規(guī)PCR在相同模板濃度（1 ng/μL）下僅產(chǎn)生微弱條帶，而100 pg/μL時完全無擴增結(jié)果，證實LAMP的靈敏度較PCR至少提升1個數(shù)量級。

采用7種植物病原菌及健康咖啡葉片DNA進行特異性驗證，如圖13所示，SYBR Green Ⅰ熒光染色顯示僅咖啡暹羅炭疽菌（C. siamense）反應體系呈現(xiàn)黃綠色熒光，其余樣本均保持橙色本底。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進一步證實，僅目標菌株出現(xiàn)階梯狀條帶，空白對照與其他病原菌均無擴增條帶。綜合2.3引物篩選結(jié)果及上述試驗結(jié)果表明，本研究建立的咖啡炭疽菌C. siamense LAMP反應體系具有高度特異性。

2.4.4 "LAMP體系檢測田間病原菌 "結(jié)果如圖14所示，田間采集的12份咖啡病葉樣本經(jīng)LAMP檢測顯示，樣品2、4、5反應體系出現(xiàn)明顯黃綠色顯色反應，瓊脂糖凝膠電泳可見清晰梯形條帶；其余7份均保持橙色，電泳無擴增條帶。同步進行的PCR驗證試驗（引物Tub-CS-L）表明，陽性樣本2、4、5在173 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與LAMP檢測結(jié)果一致。研究證實優(yōu)化后的LAMP體系可成功檢測田間樣本中的咖啡暹羅炭疽菌（C. siamense），且檢測周期較常規(guī)PCR縮短62%（LAMP為50 min，PCR為130 min），滿足田間樣本快速、精準的檢測需求。

3 "討論

作為植物病原真菌的重要類群之一，炭疽菌屬真菌對多種具有重要經(jīng)濟價值的熱帶作物（特別是水果和觀賞植物）造成嚴重危害，包括咖啡、胡椒、橡膠、菠蘿蜜等^[20-23]。其中暹羅炭疽菌（C. siamense）最初常被誤鑒定為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides），后經(jīng)學者系統(tǒng)修訂，確認為獨立物種^[24]。本研究基于多基因系統(tǒng)發(fā)育分析方法，對24株咖啡炭疽菌分離株進行分離鑒定，其中11株鑒定為暹羅炭疽菌（占分離株總數(shù)的45.8%），且分布最廣，為優(yōu)勢種群。這一結(jié)果與前期研究一致，如鞏佳莉^[25]從云南、海南收集的74株咖啡炭疽菌中鑒定出7個炭疽菌種，其中暹羅炭疽菌占比最高（32%）；陸英等^[26]對55株咖啡炭疽病菌的分類研究也顯示暹羅炭疽菌為優(yōu)勢種，占比達43.64%。值得注意的是，暹羅炭疽菌不僅是海南咖啡、橡膠和檳榔3種重要熱帶作物的主要病原菌，且因其在寄主間具有交叉感染能力，加之海南多年連作或相鄰種植的栽培模式，導致該病原菌潛伏感染的風險加劇，嚴重阻礙了田間咖啡炭疽病害的有效防控^[27]。因此，建立基于LAMP技術(shù)的早期檢測體系，結(jié)合病原菌種群動態(tài)監(jiān)測，對實施精準防控和降低咖啡炭疽病流行風險具有重要的實踐價值。

LAMP技術(shù)是基于特異性引物的多重識別機制，通過設計4～6條靶向基因保守區(qū)的引物實現(xiàn)高精度擴增，其特異性源于引物與靶標序列的嚴格互補匹配，若存在核苷酸錯配或缺失，則擴增無法進行，從而確保檢測的高度特異性。相較于傳統(tǒng)PCR技術(shù)對熱循環(huán)儀器的依賴，LAMP技術(shù)因其恒溫擴增特性，簡化了試驗流程并降低了設備需求；同時，該技術(shù)兼具擴增效率高、結(jié)果可視化等優(yōu)點，因此更適用于基層實驗室或資源受限場景的快速檢測需求^{[12， 28]}。

LAMP技術(shù)的關(guān)鍵核心在于靶標基因的精確篩選，需優(yōu)先選擇種內(nèi)高保守，且種間多態(tài)性顯著的基因區(qū)段。除常規(guī)應用的ITS、TUB2基因外，近年相關(guān)研究拓展至16S rDNA、CYP51C、CYP450等基因位點^[29-31]。如王賢達等^[32]基于葡萄炭疽病菌（C. gloeosporioides）的ITS特異區(qū)域構(gòu)建的LAMP體系，該體系對葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、桃褐腐病菌（Monilinia laxa）等菌株無擴增反應。ARAVINDARAM等^[33]基于辣椒炭疽菌（C. capsici）的TUB2基因構(gòu)建了LAMP體系，該體系對菜豆殼球孢菌（Macrophomina phaseolina）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）等8種病原菌均無擴增。王冠華^[34]開發(fā)了蘋果炭疽病菌（C. gloeosporioides）TUB靶向檢測體系，該體系對蘋果斑點落葉病菌（Alternaria alternaria）、蘋果霉心病菌（Trichothecium roseum）等常見病原體具有嚴格特異性。本研究以TUB2特異性區(qū)域序列為靶標，設計LAMP特異性引物組。通過驗證試驗表明，該體系對黑孢菌（Nigrospora oryzae）、咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）等7種非靶標菌株無擴增反應，同時對炭疽屬內(nèi)7個近緣種（C. tropicale、C. fructicola、C. karstii等）亦無交叉反應。此外，對照試驗進一步排除了咖啡葉片基因組DNA對檢測結(jié)果的潛在干擾，證實了該LAMP檢測體系的特異性與可靠性。

LAMP反應產(chǎn)物的可視化檢測常采用熒光指示劑，如利用SYBR Green Ⅰ、鈣黃綠素-錳離子復合物、羥基萘酚藍（HNB）等進行驗證。研究表明，HNB與SYBR Green Ⅰ的檢測靈敏度顯著優(yōu)于其他指示劑；然而，HNB的顯色機制依賴于反應過程中焦磷酸鎂沉淀導致的pH變化，其濃度需精確調(diào)控，濃度過高會抑制Bst DNA聚合酶活性^[13]。本研究選擇SYBR Green Ⅰ作為指示劑，其雙鏈DNA結(jié)合特性可實現(xiàn)擴增終產(chǎn)物的即時熒光檢測，但傳統(tǒng)開蓋加樣操作易產(chǎn)生氣溶膠污染，需嚴格執(zhí)行分區(qū)操作（樣本處理區(qū)、擴增區(qū)、檢測區(qū)的物理隔離）并配合紫外臭氧滅菌。為規(guī)避污染風險，可借鑒閉管檢測策略，即把SYBR Green Ⅰ預加至PCR管蓋內(nèi)壁，擴增結(jié)束后通過高速離心實現(xiàn)染料與反應液的充分混合，該方法可有效降低假陽性率^[35]。

病原物檢測體系的靈敏度是決定田間早期診斷效能的重要參數(shù)。本研究建立的咖啡炭疽病菌暹羅炭疽菌（C. siamense）LAMP體系，經(jīng)梯度稀釋模板驗證，其最低檢測限為100 pg/μL。該靈敏度與已報道的向日葵核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）^[36]、余甘子果實斑點病菌（Diaporthe phoenicicola）^[37]等體系相當。不同研究體系間其靈敏度存在差異，王賢達等^[32]基于葡萄炭疽病設計的檢測體系靈敏度達500 fg/μL，汪少麗等^[35]基于蘋果炭疽菌基因構(gòu)建的LAMP體系其靈敏度突破至1 ag/μL，靈敏度的差異可能與靶標基因拷貝數(shù)、核酸純化方法有關(guān)。盡管本體系的靈敏度處于中等水平，但仍優(yōu)于常規(guī)PCR技術(shù)。

病原菌的精準快速鑒定是咖啡炭疽病綜合防控體系的核心環(huán)節(jié)，直接影響病害預警的時效性及防控決策的科學性。本研究基于暹羅炭疽菌（C. siamense）的TUB2基因特異區(qū)域，成功構(gòu)建了基于比色變化、快速精確的LAMP檢測體系。該體系的建立突破了傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法周期長、分子檢測依賴精密儀器等的技術(shù)瓶頸，為咖啡炭疽病的早期診斷及其精準防控策略的實施提供技術(shù)支撐，同時為咖啡的抗病育種及綜合防治提供理論依據(jù)，也為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上其他病害的快速診斷提供重要參考。

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