引用格式：，等.省玉竹葉斑病病原菌的分離鑒定[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)，2025（6）：72-74，84.DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.006.012

中圖分類號(hào)：S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2025）06-0072-03

Identification of the Pathogen Causing Leaf Spot in Polygonatum odoratum in Hunan Provi

XU Wen-jing1，YUAN Ye2，HUANG Yan-ning2，CAI Liu2，XU Rui2，LU Ying （1.HunanAgriculturalUniversityangsha428，PRC;2.HunanIstituteofNuclearAgricultureSciencesdne HerbalMedicines，Changsha，PRC）

Abstract：Thisstudyaims toidentifythepathogencausingeafspotinPolygonatumodoratuminHunanProvince.Thepathogen was isolated from the diseased leaves of P. odoratum by the tissue culture method，and its pathogenicity was verified according to Koch's postulates.Theisolatewasidentifedbymorphologicalobservationofcolonies，onidia，andhyphaeandmolecularbologicalethods. Theresultsshowedthattheobtained strainYZyhadthemorphologicalcharacteristicsconsistentwiththoseofFusariumequiseti. Specifically，thestrainpresentedcoloniescreamyhiteonthefrontandlightyellowatthback，focculentaerialhyphaepindleshapedorsickle-shapedmacroconidia，fewmicroconidia，andspherechlamydosporeswithroughsurfaces.Thesymptomscaused by thestrainnlaboratorywereconsistentwiththoseinthefeld.TemultilocusphylogeneticanalysisbasedoIS，EF-aadRPB1 showed that the strain shared the same clade （ 87% homology） with F. equiseti. Therefore， the pathogen causing leaf spot in P. odoratum is F. equiseti，which provides reference for the effective control of this disease.

Key words： Polygonatum odoratum; leaf spot; isolation and identification; Fusarium equiseti

玉竹（Polygonatumodoratum）是一種藥食兩用植物[1-2]，為天門(mén)冬科黃精屬，又名葳蕤、鈴鐺菜、地管子和甜草根等[3]。玉竹以地下根莖入藥，新鮮肉質(zhì)呈黃白色，須狀根細(xì)長(zhǎng)密集，廣泛分布于我國(guó)多個(gè)地區(qū)[4，也是種植歷史悠久的道地藥材。玉竹味甘、性平，具有生津養(yǎng)胃、益氣養(yǎng)陰和補(bǔ)腎潤(rùn)肺等功效[5]。近年來(lái)，玉竹的應(yīng)用范圍逐漸延伸至功能性食品、化妝品和保健產(chǎn)品等領(lǐng)域[6-7]

隨著玉竹的藥用價(jià)值被廣泛認(rèn)可，其市場(chǎng)需求持續(xù)增長(zhǎng)，種植規(guī)模不斷擴(kuò)大。然而，在規(guī)?；耘噙^(guò)程中，極端氣候、栽培模式單一與管理不當(dāng)?shù)纫蛩貙?dǎo)致病害頻發(fā)，其中又以真菌性病害為主，例如褐斑病、根腐病、銹病和灰霉病等[8-9]。2024年，省玉竹種植區(qū)發(fā)現(xiàn)一種嚴(yán)重的葉斑病，發(fā)病初期葉片出現(xiàn)圓形或不規(guī)則的褐色斑點(diǎn)，后期病斑逐步擴(kuò)大，直至多個(gè)病斑相連致使葉片大面積枯死，造成當(dāng)?shù)赜裰癞a(chǎn)量和質(zhì)量下降，嚴(yán)重制約相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究以省玉竹產(chǎn)區(qū)典型葉斑病病葉為試驗(yàn)材料，分離純化菌株后，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、致病性測(cè)定以及多位點(diǎn)（ITS、EF-lα和RPB1）系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，以期為玉竹葉斑病防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣本為2024年采集自省玉竹產(chǎn)區(qū)有典型葉斑病癥狀的玉竹葉片；致病性測(cè)定的供試植物為健康玉竹盆栽苗；供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200g 、葡萄糖 20g 、瓊脂 15～20g 、蒸餾水 O

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌的分離純化選取有葉斑病癥狀的玉竹病葉，用無(wú)菌蒸餾水沖洗去除葉片表面雜菌，于病健交界處剪取葉片組織（ 3mm×3mm ），經(jīng) 75% 無(wú)水乙醇浸泡30s后，用無(wú)菌水充分漂洗3次并用滅菌濾紙吸干殘留水分。將消毒后的葉片組織接種在冷卻凝固的PDA平板上，置于 28°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3＼～5d，待平板上長(zhǎng)出菌落后，用無(wú)菌牙簽挑取菌落邊沿菌絲，接種于新的PDA培養(yǎng)基上，重復(fù)處理直至平板上形成單一菌落，將純化后的菌落接種至斜面培養(yǎng)基， 28°C 恒溫培養(yǎng)直至菌落長(zhǎng)滿斜面，置于 4^°C 冷藏保存。

1.2.2形態(tài)學(xué)觀察將分離純化的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在 28°C 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5＼～7d，待菌落長(zhǎng)滿整個(gè)平板后觀察菌落顏色、菌絲生長(zhǎng)狀況等特征，同時(shí)挑取少量菌絲置于顯微鏡下觀察孢子和菌絲形態(tài)并測(cè)量分生孢子大小

1.2.3致病性測(cè)定用健康玉竹盆栽苗來(lái)驗(yàn)證分離菌株的致病性。先用 75% 酒精擦拭玉竹葉片進(jìn)行表面殺菌處理，用無(wú)菌牙簽在玉竹葉片上制作傷口，然后將分離的菌株接種至PDA平板，培養(yǎng)5d后使用直徑 5mm 的打餅器打餅，將大小一致的菌餅接種至玉竹葉片傷口處，以不作處理為對(duì)照，重復(fù)3次。將6盆盆栽置于相同生長(zhǎng)環(huán)境下，每天觀察植株并記錄發(fā)病情況，發(fā)病后再次分離病原菌，比較其與接種菌株的形態(tài)特征是否一致。

1.2.4分子生物學(xué)鑒定使用真菌基因組DNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取分離菌株的DNA，采用通用引物（表1）ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R以及RPB1-Fa/RPB1-R8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（ 25μL ）： 2× Power Taq PCR MasterMix 12.5μL ，上下游引物各 1μL ，DNA模板 1.5μL 無(wú)菌水 9μL 。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件： 94^°C 預(yù)變性5min ; 94^°C 變性 30s ， 55% 退火 30s ， 72% 延伸 45s 共30個(gè)循環(huán)； 72^°C 延伸 5min ， 4^°C 保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物交由武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序和序列拼接，將獲得的序列上傳至NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，下載所需序列，使用MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap重復(fù)1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將分離得到的菌株命名為YZy，其菌落形態(tài)、孢子及菌絲顯微特征如圖1所示。該菌株在PDA平板上形成米白色菌落，氣生菌絲較短，呈棉絮狀，長(zhǎng)度不超過(guò)培養(yǎng)血蓋高度，菌落背面呈淡黃色。大分生孢子呈紡錘形或鐮刀形，孢子較彎曲，分隔范圍為2＼～6個(gè)，其中以3＼～4個(gè)為主。小分生孢子數(shù)量少，厚垣孢子呈球形且表面粗糙。根據(jù)分離菌株YZy的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征，初步確定該菌株為木賊鐮刀菌（Fusariumequiseti）

2.2 致病性測(cè)定結(jié)果

將分離的菌株YZy接種于玉竹葉片上，如圖2所示，接種7d后，接種處理組的玉竹葉片均出現(xiàn)病癥，病斑呈圓形或橢圓形，病斑外圍呈褐色，后期病斑逐漸擴(kuò)大，與玉竹產(chǎn)區(qū)植株的田間發(fā)病癥狀一致，而對(duì)照組玉竹葉片未出現(xiàn)感病癥狀。選取發(fā)病的玉竹葉片再次進(jìn)行分離鑒定，得到的菌株與接種菌株一致，表明經(jīng)柯赫氏法則（Koch'spostulates）驗(yàn)證，菌株YZy為葉斑病的致病菌。

2.3分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

使用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R以及RPB1-Fa/RPB1-R8序列引物對(duì)分離菌株YZy進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)。從比對(duì)結(jié)果中選取同源性較高的序列與YZy構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖3所示，分離菌株YZy與木賊鐮刀菌（FusariumequisetiMHl1）聚在同一分支，同源性達(dá) 87% ，結(jié)合形態(tài)特征最終確定省玉竹產(chǎn)區(qū)葉斑病的病原菌為木賊鐮刀菌。

3 結(jié)論與討論

木賊鐮刀菌是一種土傳真菌，通常被報(bào)道為植物病原菌，能夠?qū)Χ喾N植物造成危害[10-13]，可侵染植物葉、莖、根等多個(gè)部位，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物死亡，對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)均產(chǎn)生不良影響。木賊鐮刀菌侵染能引發(fā)芝麻菜葉斑病[14]、煙草根腐病[15-16]馬鈴薯萎蔫病[17-18]、玉米莖腐病[19]、白菜枯萎病[20]豌豆根腐病[21]、火龍果莖腐病[22]和苦瓜葉斑病[23]等病害；此外，該病原菌具備侵染動(dòng)物的能力，如趙楠等[24]在患黑鰓病的克氏原螯蝦的鰓上分離得到了木賊鐮刀菌。

目前吉林、貴州、甘肅、等地均有玉竹葉部病害（葉斑病、炭疽病和褐斑病等）病原菌分離鑒定的報(bào)道[25-30]。本研究在省玉竹產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)的葉斑病病原菌經(jīng)分離鑒定確定為木賊鐮刀菌，這是首次在玉竹產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)因該病菌引發(fā)的玉竹葉斑病。

本研究從省玉竹葉斑病病葉中分離出致病菌株后，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定及多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該病原菌為木賊鐮刀菌，這是該菌株在玉竹產(chǎn)區(qū)引發(fā)葉斑病的首次報(bào)道。該病害導(dǎo)致玉竹葉片呈大面積褐色病斑，嚴(yán)重影響植株生長(zhǎng)。研究結(jié)果為該病害的防治提供了依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：彭靜瀾）