中圖分類號 G642.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A 文章編號 1007-7731（2025）13-0118-04

DOI號10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.13.030

Practice and effect of protein extraction， separation， analysis， and Michaelis constant determination

JIA Haoran HAN Peng ZHANG Yantao ZHANG Liquan （CollegeofLife Sciences，Inner Mongolia University，HohhotO1oO21， China）

AbstractProtein extraction，separation，analysis and determination of Michaelis constant are the comprehensive experimental coursecontents inthe teaching sylabusofbiochemistryexperiments.In thisexperimental practice， commercially available mung bean sprout stem segments were used as experimental materials.The total protein was extracted bygrinding method，andtheconcentrationand distributionof total protein were determinedby BCA method and SDS-PAGE electrophoresis.The Michaelis constant of acid phosphatase in total protein was determined using disodium p-nitrophenyl phosphate （PNPP-N ）as the substrate under acidic conditions[37 °C ，0.2 mol/L HAc-NaAc ^α bufr （pH=5.6）.The results showed that the total protein concentration of mung bean sprout stem segments was 4.374 mg/mL.Under acidic conditions，the K_m of acid phosphatase in the total protein was 5.552 5 mmol/L，and the V_m was 0.0743mmol/（L·min）.This practical exercise significantly enhancedstudents’operational understandingof fundamentalbiochemicaltechniques including protein extraction/purification，quantitative analysis，and determination of Michaelis constant.Furthermore，it provided hands-on experience with esential methodologies such asprotein isolationand SDS-PAGE electrophoresis， while efectively fostering scientific curiosityand research enthusiasm among participants.

Keywords Biochemistry; extraction and determination of protein; Michaelis constant; mung bean sprouts

蛋白質(zhì)是高校生物化學(xué)課程的核心教學(xué)內(nèi)容之一。其中，蛋白質(zhì)的分離、濃度測定及分析鑒定等實(shí)驗(yàn)課程，是生物技術(shù)專業(yè)本科生深入理解和掌握蛋白質(zhì)基礎(chǔ)理論的重要實(shí)踐內(nèi)容[。酶是一類具有高效催化功能的蛋白質(zhì)，其反應(yīng)動力學(xué)研究是生物化學(xué)的核心內(nèi)容[2-3]。由于酶在生物體內(nèi)含量較低，直接檢測困難，通常通過測定其活性來進(jìn)行定量分析[4]。

米氏常數(shù)測定是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)典內(nèi)容，Michaelis等5應(yīng)用動力學(xué)方法推導(dǎo)得到酶催化過程的動力學(xué)方程，反應(yīng)速度 V=V_m[S]/（K_m+[S]）=V_m/（1+ K_m/[S]） ，其中 V_m 為酶促反應(yīng)最大速度； K_m 為米氏常數(shù)；[S]為底物濃度。 K_m 反映了酶和底物親和力的大小，是酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度 50% 時(shí)的底物濃度[6-7]。磷酸酶是一種促使底物去磷酸化的酶，依據(jù)其反應(yīng)條件可分為堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase，EC3.1.3.1，ALP）和酸性磷酸酶（Acidphosphatase，EC3.1.3.2，AP）[8]。ALP廣泛存在于原核生物和哺乳動物組織，是一種底物專一性較低的磷酸單酯水解酶[9-10]。AP普遍存在于土壤和植物體內(nèi)[1]，參與植物體磷營養(yǎng)的調(diào)節(jié)和逆境適應(yīng)[12]。

在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的實(shí)踐學(xué)習(xí)中，依據(jù)教學(xué)大綱中“蛋白質(zhì)粗液的提取”“蛋白質(zhì)濃度測定及SDS-PAGE電泳檢測”以及“米氏常數(shù)測定\"等相關(guān)內(nèi)容，以市售綠豆芽為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)研磨法獲得蛋白質(zhì)粗提物，利用BCA法測定蛋白濃度，通過SDS-PAGE電泳檢測，并在 0.2mol/LHAc-NaAc 緩沖液C $_ ＼mathrm { p H } 5 . 6 ＼$ 條件下，以對硝基苯磷酸二鈉（PNPP- ?Na₂ ）為底物8測定酸性磷酸酶的米氏常數(shù)，全面系統(tǒng)地學(xué)習(xí)了蛋白質(zhì)化學(xué)的基本理論知識，同時(shí)了解了蛋白酶學(xué)的研究和發(fā)展歷程，掌握了離心分離、分光光度法測定物質(zhì)濃度、SDS-PAGE電泳等基本實(shí)驗(yàn)技能。

1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1材料

以市售綠豆芽為實(shí)驗(yàn)對象。試劑： 0.1mmol/L 溶液， 0.1mol/L （20 Na₂CO₃-NaHCO₃ 緩沖液（ Δ?∣pH 10.0）， 0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液 （pH5.6） ，5.0 mmol/L PNPP- ?Na₂（pH 5.6 ），BCA protein assaykit（Beytime），蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA（ 0.5mg/mL ），Tris-甘氨酸電泳緩沖液， 30% Arc， 4× SDS-PAGE分離膠緩沖液，4×SDS-PAGE濃縮膠緩沖液， 10% APS，TEMED， 20×TBS 緩沖液， 2×sDS 上樣緩沖液。儀器：試管，取液器，酶標(biāo)儀，離心機(jī)，垂直電泳儀，研缽等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取7支試管，分別記為0、1、2、3、4、5、6，然后依次加人 0.1mol/L （202 Na₂CO₃- NaHCO₃ 緩沖液 （pH10.0）5.0、4.8、4.6、4.2、3.8、3.4 3.0mL ，再分別加入 溶液 0.0.2，0.4 、0.8、1.2、1.6、2.0mL ，搖勻，室溫放置 10min 。分別吸取 0.2mL 混合液加于酶標(biāo)板孔中，測定 0D₄₁₀ 值，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，利用Excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 依照BCAproteinassaykit（Beytime）說明書配置BCA工作液，分別取蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 BSA（0.5mg/mL）0.1.2，4.8，12， （2016.20μL 加入酶標(biāo)板孔中，再用 1×TBS 緩沖液補(bǔ)足到20μL ，配制濃度分別為 0.0.025.0.050.0.100.0.200 0.300，0.400，0.500mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品BSA。再向各孔加人 200μL BCA工作液，37℃放置 20min ，測定 OD₅₆₂ 值，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，利用Excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3蛋白質(zhì)粗液提取 取市售綠豆芽莖段約20g ，在研缽中徹底搗碎，室溫靜置 0.5h ，采用雙層紗布進(jìn)行過濾，濾液 4000r/min 離心 10min ，用移液器吸取上清液于 Epp 管中，即為蛋白質(zhì)粗提液， 4^°C 存放備用。

1.2.4蛋白質(zhì)粗提液濃度測定 取 20μL 蛋白質(zhì)粗提液于酶標(biāo)板孔中，加入 200μL BCA工作液，37°C 放置 20min ，測定 OD₅₆₂ 值，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。利用1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算獲得蛋白濃度。

1.2.5SDS-PAGE電泳檢測 分別配置 10% 分離膠和 5% 的濃縮膠制備SDS-PAGE電泳凝膠。取1000μL 蛋白質(zhì)粗酶液，冷凍干燥至粉末狀，用15μL 1× TBS緩沖液溶解，加入等體積 2×SDS 上樣緩沖液后，沸水浴 5min ，冷卻至室溫， 12 000r/min 離心 10min ，取 20μL 上清液點(diǎn)樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、考馬斯亮藍(lán)染色后，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

1.2.6酸性磷酸酶米氏常數(shù)測定 取7支試管，分別記為0、1、2、3、4、5、6，各加入 5.0mmol/L PNPP-Na₂ （ pH 5.6） 溶液 0，0.10，0.14，0.20，0.25，0.33， 0.50mL ，再用 0.20mol/LHAc-NaAc（pH 5.6） 緩沖液補(bǔ)足至 0.50mL，37^°C 預(yù)熱 2min ；依次向各試管中加入 37°C 預(yù)熱的蛋白質(zhì)粗提液 0.50mL ，立即搖勻，37°C 精確反應(yīng) 10min 后，立即加人 0.1mol/L Na₂CO₃-NaHCO₃ 緩沖液（ pH 10.0） 終止反應(yīng)。分別吸取 200μL 上述反應(yīng)液于酶標(biāo)板孔中，測定 0D₄₁₀ 值，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。利用1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算獲得反應(yīng)產(chǎn)物 pN_p 的濃度，結(jié)合反應(yīng)時(shí)間求出反應(yīng)速度 V ，以 1/V 為縱坐標(biāo)，1/[S]為橫坐標(biāo)作圖，求出 K_m 值和 V_m 值。

2結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由圖1可知， 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=11.062x+0.0444，其中 R²=0.992 1 。蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.5857x+0.2234 ，其中 R²=0.9578 。

（A）（B）分別為 標(biāo)準(zhǔn)曲線和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 蛋白質(zhì)粗提液濃度測定

濃度測定進(jìn)行3次重復(fù)，分別獲得 0D₅₆₂ 值為2.646、2.794、2.916、 ，其平均值為 2.785 。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 y=0.5857x+0.2234 ，計(jì)算得到的蛋白質(zhì)粗提液濃度為 4.374mg/mL 。

2.3 SDS-PAGE電泳檢測

由圖2可知，利用研磨法成功獲得了實(shí)驗(yàn)材料綠豆芽莖段中的總蛋白。

1/V_m=13.416 因此，獲得本實(shí)驗(yàn)中酸性磷酸酶的 0.0743mmol/（L·min）， K_m=5.5525mmol/L

2.4酸性磷酸酶米氏常數(shù)測定

依據(jù)反應(yīng)前各試管PNPP- ?Na₂ 的加入量，計(jì)算獲得反應(yīng)前各試管中PNPP- ?Na₂ 濃度的 1/[S] ，如表1所示。反應(yīng)結(jié)束后，測定獲得 0D₄₁₀ 值，代入標(biāo)準(zhǔn)方程 y= 11.062x+0.044 4 分別計(jì)算獲得各反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)PNPP-Na₂ 的濃度（表1）。根據(jù)公式 V=x/t （ Ω_t=10min， ，計(jì)算獲得 1/V 由圖3可知，利用1/V-1/[S]雙倒數(shù)法作圖獲得曲線方程為 y=74.492x+13.416 ，即 K_m/V_m=74.492。

3實(shí)踐效果

蛋白質(zhì)提取分離、鑒定及米氏常數(shù)測定是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱中的必修內(nèi)容[13]。蛋白質(zhì)的定量和定性分析技術(shù)是蛋白質(zhì)化學(xué)中的基本技術(shù)之一，BCA法和SDS-PAGE電泳是定量測定蛋白濃度的常用方法。學(xué)生通過課前預(yù)習(xí)基礎(chǔ)理論；課中在教師指導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作；課后通過撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告深化理解，成功利用BCA法測定了實(shí)驗(yàn)材料綠豆芽莖段總蛋白的含量，并在冷凍濃縮后通過SDS-PAGE電泳測定了總蛋白的分布特征。通過課程實(shí)踐學(xué)習(xí)，深刻理解了蛋白質(zhì)提取鑒定和酶學(xué)中米氏常數(shù)的基本概念，BCA測定蛋白濃度以及SDS-PAGE電泳的原理。其次，掌握了離心分離、SDS-PAGE電泳、酶標(biāo)儀使用等基本實(shí)驗(yàn)技能。

米氏常數(shù)是蛋白酶與底物親和性的表征[6-7]，其受多種因素的影響。本文以PNPP- ?Na₂ 為底物，在酸性條件下測定了綠豆芽莖段總蛋白中酸性磷酸酶的米氏常數(shù)。在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理的過程中，學(xué)生深人理解了酶促反應(yīng)動力學(xué)的特點(diǎn)，掌握了米氏常數(shù)反映酶與底物親和性的方法原理，以及底物濃度對酶促反應(yīng)速率的影響。該實(shí)驗(yàn)過程不僅夯實(shí)了其基礎(chǔ)理論知識，同時(shí)訓(xùn)練了實(shí)驗(yàn)技能和科研思維。通過本次實(shí)驗(yàn)實(shí)踐，了解到團(tuán)隊(duì)協(xié)作是科研工作的關(guān)鍵要素，小組成員通過優(yōu)勢互補(bǔ)和分工合作，顯著提升了實(shí)驗(yàn)效率和質(zhì)量。將課堂所學(xué)應(yīng)用于解決實(shí)驗(yàn)過程中的實(shí)際問題，加深了學(xué)生對理論知識的理解，培養(yǎng)了其科學(xué)思維能力，激發(fā)了其科研熱情。

綜上，本文通過生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)提取分離分析及米氏常數(shù)測定的實(shí)踐實(shí)驗(yàn)，成功利用BCA法測定了綠豆芽莖段總蛋白的含量，通過SDS-PAGE電泳分析了總蛋白的含量分布，同時(shí)測定了綠豆芽莖段總蛋白中酸性磷酸酶的米氏常數(shù)值。本次實(shí)驗(yàn)課程系統(tǒng)性地強(qiáng)化了蛋白質(zhì)提取分離、定量分析及米氏常數(shù)測定等基礎(chǔ)理論知識的實(shí)踐認(rèn)知。通過將抽象復(fù)雜的理論概念轉(zhuǎn)化為具體的實(shí)驗(yàn)操作，加深了對專業(yè)知識的理解；通過儀器設(shè)備的實(shí)際操作深人掌握了其工作原理，激發(fā)了學(xué)生對科學(xué)研究的興趣和熱情。

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