中圖分類號：S512.1;Q756 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號： 1000-4440（2025）05-0833-07

Abstract：To further analyze the regulation mechanism of γ -gliadingeneinflourqualityofwheat，the Tagli-y-11 gene wassucesfullycloned from Zhengmai158（low proteincontent and high dough strength）.Bioinformatic analysis revealed that this gene possessed the typical structural characteristicsof γ -gliadin，containing eight conserved cysteine residues.Aceliac disease（CD）epitope（PQQSFPQQQ）was identified withinrepeatdomainIof the Tagli-y-11 protein，

located at amino acid positions 133-141 . Using the yeast two-hybrid（Y2H）system，thecDNAlibraryofZhengmai 158 was screened，yielding eight candidate proteins potentiallyinteractingwithTagli- γ -11.These included cysteine protease，fructose-bisphosphatealdolase，cysteine-rich and transmembrane domain-containing protein1，（1，3： 1，4）-β-D-glucanase，auxinresponse factor 17-like （ARF17-like），cell number regulator 8-like （CNR8- like），ubiquitin-associated domain-containing protein

DSK2b，transcription factor PIF1-like.Therotation validationassays performedoncysteine-rich and transmembrane domain-containing protein1，fructose-bisphosphate aldolase，and （ ^{1，3：1，4）} -β-D-glucanase confirmed physical interaction withTagli- γ -11.Based on these results，itwashypothesized that Tagli γ -11interacted with theseproteinsand participated in the synthesis and degradation of storage proteins （such as gliadin）and starch within wheat grains，as wellas inreproductive growth processes.

Key words： Triticum aestivum L.；Tagli- ?γ -11 gene；yeast two-hybrid system；rotation validation

醇溶蛋白約占小麥籽?？傎A藏蛋白的 40% ，是賦予面團(tuán)獨(dú)特黏彈性的關(guān)鍵組分[1]。其中， γ 醇溶蛋白約占醇溶蛋白總量的 30% ，其在面粉的最終使用用途方面發(fā)揮了重要作用[2]。因此，開展小麥 γ 醇溶蛋白基因的研究，探討與其相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制，可為小麥品質(zhì)的遺傳改良提供重要依據(jù)。

目前，許多學(xué)者對小麥 γ -醇溶蛋白基因的功能及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了較為深入的研究[2-4]。Zhou等[3]發(fā)現(xiàn)，小麥TaGli-γ-2.1基因啟動子區(qū)域甲基化抑制其表達(dá)，導(dǎo)致小麥種子的醇溶蛋白總量和 γ -醇溶蛋白積累量顯著減少，谷蛋白指數(shù)和面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間增加。面筋蛋白積累關(guān)鍵基因LGP1編碼區(qū)第56位核苷酸發(fā)生C到T突變，導(dǎo)致第19位氨基酸由丙氨酸（Ala）突變?yōu)槔i氨酸（Val），該突變可導(dǎo)致 γ 醇溶蛋白信號肽不能正常切割而滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成類自噬體樣結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致種子貯藏蛋白傳遞到細(xì)胞外，進(jìn)而降低谷蛋白和淀粉生物合成水平，并觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫反應(yīng)和細(xì)胞死亡相關(guān)途徑[4]。敲除Gli-γl-ID基因和Gli-γ2-IB 基因可導(dǎo)致小麥高分子量谷蛋白亞基（HMW-GSs）含量上升，谷蛋白（Glu）含量與醇溶蛋白（Gli）含量的比值顯著提高，十二烷基硫酸鈉（SDS）沉降值、面筋指數(shù)也顯著提高[2]。由此可見，γ -醇溶蛋白基因可負(fù)調(diào)控與面團(tuán)強(qiáng)度相關(guān)的小麥品質(zhì)。

乳糜瀉（CD）是由于攝入小麥、黑麥、燕麥等含麩質(zhì)蛋白質(zhì)類食物而引發(fā)的一種慢性、多器官自身免疫性疾病[5]，它在全球發(fā)病率約為 1%^[6] 。有研究結(jié)果表明， α -醇溶蛋白 {β -醇溶蛋白和 γ -醇溶蛋白含有大量的CD免疫顯性表位，是導(dǎo)致乳糜瀉的主要原因[7]。目前，小麥中已發(fā)現(xiàn)31個(gè)醇溶蛋白的CD表位[7]。許多學(xué)者則通過降低CD表位，來改善面團(tuán)品質(zhì)，并將這種方法應(yīng)用于優(yōu)質(zhì)麥育種的遺傳改良當(dāng)中[4，8-10]。也有學(xué)者通過敲除或者沉默醇溶蛋白的方法來降低CD表位，并獲得對乳糜瀉患者毒性很低甚至無毒的小麥品系[4.9-10]，并且乳糜瀉患者在食用了這些小麥品系制作的面包后也未引起免疫原性反應(yīng)[11]。因此，開發(fā)無醇溶蛋白或低醇溶蛋白的小麥品種，有望滿足乳糜瀉患者等特殊人群的特定飲食需求。然而，目前這類小麥品種仍然較少。

晁岳恩等12通過對鄭麥158（高面團(tuán)強(qiáng)度）、鄭麥369（低面團(tuán)強(qiáng)度）不同發(fā)育時(shí)期的籽粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，在鄭麥158與鄭麥369之間，包括 γ 醇溶蛋白11基因（TraesCS1D02G001100）在內(nèi)的24個(gè)貯藏蛋白基因存在顯著差異表達(dá)，推測這些基因可能對小麥面粉品質(zhì)或者面團(tuán)強(qiáng)度有重要影響。為了深人研究這些基因在小麥面團(tuán)強(qiáng)度中的調(diào)控機(jī)制，本研究擬克隆 γ -醇溶蛋白11基因（TraesCS1D02G0011000），并將其命名為Tagli-γ-11，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及互作蛋白質(zhì)的篩選，以期為進(jìn)一步解析 γ -醇溶蛋白11基因功能、小麥品質(zhì)相關(guān)調(diào)控機(jī)制以及低醇溶蛋白小麥品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

提取RNA所用試劑TRIzol購自天根生化科技（北京）有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SD/-Trp/-Leu（二缺板）、SD/-Trp/-Leu/-His（三缺板）、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（四缺板）等營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基均購自寶生物工程（大連）有限公司；酵母雙雜交所用載體（pGBKT7和pGADT7）、酵母菌株 Y2HGold 鄭麥158酵母雙雜交cDNA文庫、陽性對照pGBKT7-p53^[13] 、陰性對照pGBKT7-Lam[13]等均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所小麥營養(yǎng)與品質(zhì)研究室保存。

選取普通小麥鄭麥158（高面團(tuán)強(qiáng)度）揚(yáng)花后第7d，14d，21d，28d，35d 和42d等不同發(fā)育時(shí)期的種子，液氮速凍后，置于 -80^°C 條件下凍存。

1.2總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及Tagli- _γ-II 基因的cDNA合成

利用TRIzol提取鄭麥158種子不同發(fā)育時(shí)期的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA， -20^°C 條件下保存。設(shè)計(jì)特異性引物（F1： 5^′ -ATGAAGACCTTACTCATCCTAACA- ?3^′ ：R1：5^′ -TTATTGGCCACCAATGCCG- ?3^′ ）用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。參照王沙沙等[14]的方法配制PCR反應(yīng)體系，并設(shè)置PCR擴(kuò)增程序。將反應(yīng)體系放置于PCR擴(kuò)增儀（購自江蘇萬科科教儀器有限公司）中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收、連接至 pMD18-T 克隆載體，并測序。選擇測序正確的陽性單克隆進(jìn)行搖菌、提取質(zhì)粒，-20^°C 條件下保存。

1.3Tagli- _γ-11 蛋白結(jié)構(gòu)和CD表位分析

利用Pfam數(shù)據(jù)庫分析Tagli-y-11蛋白的信號肽以及結(jié)構(gòu)域，利用CD表位數(shù)據(jù)庫（http：//www.isscd.org/EpitopeNomenclature）分析Tagli-y-11蛋白的CD表位情況。

1.4誘餌載體的構(gòu)建、酵母轉(zhuǎn)化及自激活檢測

根據(jù)小麥Tagli-γ-1I基因cDNA序列及pG-BKT7載體序列，利用Primerpremier3.0在線軟件設(shè)計(jì)攜帶NdeI和BamHI這2個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的特異性引物（ F2：5^′ -CATATGATGAAGACCTTACT-CATCC- ?3^′ ；R2： 5^′ -GGATCCTTATTGGCCACCAAT-3^′ ）。以小麥Tagli-γ-11-pMD18-T質(zhì)粒DNA為模板，利用已設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用NdeI和BamHI雙酶切處理，將目的基因Tagli-γ-II 克隆至pGBKT7載體骨架，經(jīng)T4DNA連接酶連接構(gòu)建誘餌表達(dá)載體pGBKT7-Tagli-γ-11。利用PEG/LiAC介導(dǎo)酵母轉(zhuǎn)化法，將pGBKT7-Tagli-γ-11轉(zhuǎn)化至Y2HGold酵母菌株中，同時(shí)設(shè)置陰性對照（pGBKT7-Lam + pGADT7-T）和陽性對照（pGBKT7-p53+pG ADT7-T）。

將pGBKT7-Tagli-γ- II+pGADT7 、pGBKT7- p53+ pGADT7-T（陽性對照）和pGBKT7-Lam + pGADT7-T（陰性對照）分別轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母菌株中，然后依次涂布于二缺板、三缺板以及含金擔(dān)子素A（AbA）抗性的四缺板上，觀察酵母菌在這3種營養(yǎng)缺陷型平板上的生長情況，以此判斷載體是否轉(zhuǎn)化成功，驗(yàn)證pGBKT7-Tagli-γ-11是否具有自激活活性。

1.5Tagli- ??γ_γ-11 互作蛋白質(zhì)的篩選及回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

為了篩選Tagli-y-11互作蛋白質(zhì)，首先將已構(gòu)建好的鄭麥158酵母雙雜交文庫質(zhì)粒和誘餌載體pGBKT7-Tagli-y-11質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，具體操作步驟參照宋曉等[15]的方法。隨后將轉(zhuǎn)化后的酵母菌液涂布于三缺板上， 30^qC 倒置培養(yǎng) 3～5d 。待菌落長至直徑為 2mm 時(shí)，挑取藍(lán)色菌落到含AbA抗性的四缺板上繼續(xù)生長， 30% 倒置培養(yǎng)3＼～5d，再次篩選陽性克隆。設(shè)置陽性對照和陰性對照，做3次重復(fù)。利用特異性引物對AD-F/AD-R （ AD-F： 5^′ -CGGCTAGTAAAATTGAT-GATGGTAATAATTCA ?3^′ ；AD-R： 5^′ -CACAGTT-GAAGTGAACTTGCGG- .3^′ ）對候選蛋白質(zhì)進(jìn)行PCR鑒定、測序及分析。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證pGBKT7-Tagli-γ-11與候選蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系，將構(gòu)建好的pGBKT7-Tagli-γ-_II 質(zhì)粒與pGADT7-候選互作蛋白質(zhì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)至Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，再依次涂布于二缺板、三缺板以及含AbA抗性的四缺板上，培養(yǎng) 3～5d_? 。如果長出藍(lán)色菌落則說明pGBKT7-Tagli-γ-11與候選蛋白質(zhì)之間存在互作關(guān)系，反之，則說明pGBKT7-Tagli-γ-11與候選蛋白質(zhì)之間不存在互作關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1小麥Tagli-γ-1I基因克隆、cDNA序列的檢測

根據(jù)已報(bào)道的小麥Tagli-γ-11基因序列，以鄭麥158的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增、回收、連接pMD18-T克隆載體、測序，最終獲得長度為 880bp 的小麥Tagli-γ-11基因的cDNA序列（圖1）。

2.2Tagli- γ-11 蛋白結(jié)構(gòu)及CD表位分析

利用Pfam數(shù)據(jù)庫分析Tagli-y-11蛋白的信號肽以及結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)包括19個(gè)氨基酸殘基的信號肽。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)具有典型的 γ -醇溶蛋白結(jié)構(gòu)，主要包括由信號肽（由19個(gè)氨基酸殘基組成）、N端非重復(fù)I區(qū)（由12個(gè)氨基酸組成）、包括若干PQQPYPPQQPFP重復(fù)單元的重復(fù)Ⅱ區(qū)（由121個(gè)氨基酸組成）、包含6個(gè)保守半胱氨酸殘基的非重復(fù)Ⅱ區(qū)（由63個(gè)氨基酸組成）、多聚谷氨酰胺V區(qū)（由39個(gè)氨基酸組成）以及包含2個(gè)保守半胱氨酸殘基的C末端非重復(fù)V區(qū)（由41個(gè)氨基酸組成）。利用CD表位數(shù)據(jù)庫（http：//www.isscd.org/EpitopeNomenclature）分析Tagli-γ-11 蛋白的CD表位情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該蛋白質(zhì)的重復(fù)Ⅱ區(qū)即第 133～141 aa位置有1個(gè)CD表位（PQQSFPQQQ）（圖2）。

2.3pGBKT7-Tagli-γ-11誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建及 自激活檢測

將小麥Tagli-γ-11基因的cDNA序列連接到載體pGBKT7上，經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切檢測（圖3）以及測序，pGBKT7-Tagli-γ-11誘餌載體構(gòu)建成功。

分別將陽性對照（pGBKT7- p53+ pGADT7-T）、陰性對照（pGBKT7-Lam + pGADT7-T）以及pGBKT7-Tagli-y-11+pGADT7轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞。結(jié)果（圖4）顯示，3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌在二缺板上均能長出菌落。陽性對照在三缺板和含AbA抗性的四缺板上均能夠長出菌落，含pGBKT7-Tagliγ-II 重組載體的酵母菌和陰性對照在三缺板和含AbA抗性的四缺板上不能長出菌落。上述結(jié)果說明這3種質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入到酵母菌株中，Tagli-γ-1l編碼的蛋白質(zhì)不具有自激活活性。

SD/-Trp/-Leu：二缺板;SD/-Trp/-Leu/-His：三缺板;SD/-Trp/- Leu/-His/-Ade ：四缺板。X-α-Gal：酵母半乳糖苷酶的顯色底物。

2.4Tagli- _?γ-11 互作蛋白質(zhì)的篩選、鑒定將鄭麥158文庫質(zhì)粒和pGBKT7-Tagli-γ-11誘餌質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)化至Y2HGold酵母菌株中，依次涂布于三缺板和含AbA抗性的四缺板上，經(jīng)過2次篩選，共獲得99個(gè)藍(lán)色單克隆菌落（圖5）。

將單克隆菌落提取質(zhì)粒、測序后進(jìn)行BLAST比對分析，最終確定8個(gè)與Tagli- ?γ -11互作的候選蛋白質(zhì)，包括半胱氨酸蛋白酶、果糖二磷酸醛縮酶、富含半胱氨酸和跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白1和 （1，3：1，4）-β. （204號D -葡聚糖酶，還包括與植物生殖生長（尤其是花粉和籽粒生長發(fā)育）有關(guān)的生長素響應(yīng)因子ARF17-like、細(xì)胞數(shù)目調(diào)控因子CNR8-like以及與植物逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)的泛素結(jié)構(gòu)域蛋白DSK2b和轉(zhuǎn)錄因子PIF1-like（表1）。這些蛋白質(zhì)主要涉及小麥籽粒中淀粉和貯藏蛋白（如醇溶蛋白）的合成與降解以及其他生殖生長等。

2.5Tagli-γ-11與候選互作蛋白質(zhì)的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

將篩選的3個(gè)代表性陽性克隆質(zhì)粒（登錄號分別為：XM_044518121.1、XM_044546254.1、XM_044550279.1）分別與誘餌載體pGBKT7-Tagli-γ-11共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞。將共轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞分別涂布于二缺板、三缺板以及含AbA抗性的四缺板上培養(yǎng)。結(jié)果（圖6）顯示，在四缺板上均長出藍(lán)色菌落，推測這3個(gè)候選蛋白質(zhì)均與Tagli-y-11存在互作關(guān)系。

3討論

γ -醇溶蛋白約占醇溶蛋白的 30% ，其對面粉的功能性質(zhì)具有關(guān)鍵影響，決定了面粉的最終用途[2]。近年來，由于醇溶蛋白基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜、拷貝數(shù)眾多且存在大量假基因，其對面團(tuán)強(qiáng)度的作用機(jī)制研究仍不夠深入。因此，單個(gè)醇溶蛋白對面團(tuán)強(qiáng)度的具體影響尚未明確， γ? -醇溶蛋白基因的功能解析與調(diào)控機(jī)制研究也相對有限。

已有研究結(jié)果表明，Tagli-γ-11基因在小麥籽粒發(fā)育過程中顯著表達(dá)，可能對提高小麥的面團(tuán)強(qiáng)度有重要作用[12]。在此基礎(chǔ)之上，本研究首先克隆了小麥Tagi-γ-11基因，并通過分析Tagli-γ-11蛋白的結(jié)構(gòu)，在該蛋白質(zhì)的重復(fù)Ⅱ區(qū)第133～141aa位置發(fā)現(xiàn)1個(gè)CD表位（PQQSFPQQQ）。小麥中醇溶蛋白的CD表位是導(dǎo)致乳糜瀉的重要原因。因此，本研究后期可通過敲除或者沉默醇溶蛋白的方法降低CD表位，改善面團(tuán)品質(zhì)，并將其應(yīng)用于優(yōu)質(zhì)麥育種的遺傳改良當(dāng)中，從而獲得對乳糜瀉患者毒性很低甚至無毒的小麥品系，進(jìn)而生產(chǎn)無醇溶蛋白或低醇溶蛋白的小麥品種，滿足特殊人群（例如，乳糜瀉患者）的飲食需求。

另外，通過酵母雙雜技術(shù)篩選Tagli-y-11的互作蛋白質(zhì)，共獲得了8個(gè)可能與Tagli-γ-11互作的蛋白質(zhì)，它們分別是半胱氨酸蛋白酶、果糖二磷酸醛縮酶、富含半胱氨酸和跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白1 4）-β-D-葡聚糖酶、生長素響應(yīng)因子ARF17-like、細(xì)胞數(shù)目調(diào)控因子CNR8-like、泛素結(jié)構(gòu)域蛋白DSK2b和轉(zhuǎn)錄因子PIF1-like。這些蛋白質(zhì)主要參與小麥種子中淀粉和貯藏蛋白（特別是醇溶蛋白）的合成與降解，并涉及生殖生長、逆境脅迫響應(yīng)等過程。半胱氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白酶，參與植物種子貯藏蛋白降解等過程[16]。基于其與 Tagli-γ-11的互作關(guān)系，我們推測該蛋白酶可能協(xié)同Tagli-y-11參與小麥種子中醇溶蛋白的降解調(diào)控。半胱氨酸是 γ 醇溶蛋白的重要組成部分，對維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能至關(guān)重要[2]。在小麥種子發(fā)育過程中，Tagli- ?γ 11可能通過與富含半胱氨酸和跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白1相互作用，促進(jìn)醇溶蛋白的合成，最終影響小麥的品質(zhì)。果糖二磷酸醛縮酶通過糖酵解、磷酸戊糖途徑以及碳同化等參與淀粉合成[17-18]，推測該酶可能與Tagli-γ-11通過光合作用參與小麥種子中淀粉的合成。（ ^{1，3：1，4）} -β-D-葡聚糖酶是一種高溫水解酶，它可以降解淀粉生成麥芽糖和少量葡萄糖[19]，推測此酶可能與Tagli-y-11互作，參與小麥種子中淀粉的降解過程。另外，生長素響應(yīng)因子ARF17-like通過影響花粉管的果膠壁修飾調(diào)控花粉管的生長[20]；細(xì)胞數(shù)目調(diào)控因子CNR8-like通過改變細(xì)胞數(shù)量影響植株生長，改變器官大小[21]；泛素結(jié)構(gòu)域蛋白DSK2b可負(fù)向調(diào)控水稻葉瘟和滲透脅迫抗性[22；轉(zhuǎn)錄因子PIF1-like 屬于bHLH（Basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子家族的第15亞族，在植物信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的作用[23]。上述所有互作關(guān)系及其潛在功能關(guān)聯(lián)，均需后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上，本研究成功克隆了小麥 γ -醇溶蛋白基因Tagli-y-11，并在Tagli- ?γ -11蛋白重復(fù)Ⅱ區(qū)的第 133～ 141aa位置發(fā)現(xiàn)1個(gè)乳糜瀉表位（PQQSFPQQQ）。利用酵母雙雜交技術(shù)，篩選獲得了8個(gè)與小麥籽粒中貯藏蛋白和淀粉的合成與降解以及生殖生長過程相關(guān)的候選互作蛋白質(zhì)。對3個(gè)代表性候選蛋白質(zhì)［富含半胱氨酸和跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白1、果糖二磷酸醛縮酶、（ ^{1，3：1，4）} -β-D-葡聚糖水解酶]進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)其均與Tagli-γ-11存在互作關(guān)系。

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（責(zé)任編輯：王妮）