中圖分類(lèi)號(hào) S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào) 1007-7731（2025）12-0063-06

DOI號(hào) 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.12.016

Transcriptome sequencing and characteristic analysis of dorsal muscle tissue inSpinibarbushollandi

LI SixunLAI Jie DENG Binhua YE Shuzheng LIN Shengyue CHEN Weijian GUILin LI Qiang （School of Life Sciences， Guangzhou University， Guangzhou 51Ooo6， China）

AbstractToexplorethetranscriptomiccharacteristicsof Spinibarbus holandi，three femaleandthree maleindividuals （ 200g each） were used as experimental materials for highthroughput sequencing and subsequent analysis of the transcriptome. The results showedthata totalof95231190clean reads were obtained，which were assmbled into91467 Unigenes with atotallengthof73474804 nt.Among these，49O61Unigenes wereannotated inprotein databases，while48912 Unigenes wereannotated intheNRdatabase.The highest gene matching rates for Spinibarbus hollandi werewith Sinocyclocheilus rhinocerous （26%）， Sinocyclocheilus anshuiensis （23 % ）， and Sinocyclocheilus grahami （18 % ）. A total of 17557 Unigenes were anotated inthe GOdatabase，covering 49 functional subcategoriesacross threemajor biological categories：biological processes，cellularcomponents，andmolecularfunctions.Aditionall，28503Unigens were classfedinto25KOGclustes， including signal transduction mechanisms and general function prediction.Among the 25927 Unigenes annotated in the KEGG database，enrichment analysis revealed 295 metabolic pathways，with higher proportions observed in pathways such asligand-receptor interactions inneuroactive stimulationandthe MAPK signalingpathway.Microsatelitecharacteristic analysisdetected936microsatelitelociwithdinucleotiderepeatsbeing thmostabundant （5204），followedbytriucleotide （2523）and tetranucleotiderepeats （965）.Thetranscriptomicdataobtained inthis studyprovideavaluablereferencefor research on germplasm resources，genetic structure，molecular markerdevelopment，and genetic diversity exploration in Spinibarbushollandi.

Keywords Spinibarbus hollandi; transcriptome; gene annotation; characteristic analysis

光倒刺鮑（Spinibarbushollandi）屬鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鮑亞科（Barbinae）倒刺鮑屬（Spinibarbus），廣泛分布于長(zhǎng)江以南各水系，是重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)種之一，其抗病性較強(qiáng)，肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高[1-2]。近年來(lái)，有關(guān)光倒刺的研究大多集中在養(yǎng)殖技術(shù)[3]、性別標(biāo)記[4、功能基因[5-6]和線粒體基因組等方面。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一種能全面快速獲得細(xì)胞或組織在某種狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄本的序列信息和基因表達(dá)信息的技術(shù)8。通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以發(fā)掘未知和稀有基因，從而準(zhǔn)確研究基因表達(dá)差異、基因組成變異、分子標(biāo)記篩選等問(wèn)題[9-12]。目前，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)因其數(shù)量大、覆蓋率高、成本低、操作方便等特點(diǎn)，在魚(yú)類(lèi)研究中廣泛應(yīng)用。Hao等3對(duì)草魚(yú)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，評(píng)估了草魚(yú)肌肉的肉質(zhì)和肌肉品質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝途徑與魚(yú)肉品質(zhì)密切相關(guān)；石立冬等14對(duì)紅鰭東方鲀肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，篩選出與?；撬峥箲?yīng)激功能有關(guān)的基因；邵嘉棋等[15對(duì)大口黑鱸進(jìn)行RNA-seq技術(shù)測(cè)序，獲得64個(gè)與馴食性狀相關(guān)的候選基因和1個(gè)單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）標(biāo)記，為其食性馴化遺傳改良提供參考。

目前，光倒刺鮑基因組研究較少，本研究對(duì)該魚(yú)類(lèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析，以構(gòu)建光倒刺鮑轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，探討其基因組結(jié)構(gòu)，為解決光倒刺鈀基因進(jìn)化、遺傳育種和資源恢復(fù)等問(wèn)題提供參考，對(duì)揭示其生長(zhǎng)機(jī)制、抗逆能力，選育優(yōu)勢(shì)養(yǎng)殖品種以及種質(zhì)資源保護(hù)具有重大意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用光倒刺樣品采自廣東省珠江水產(chǎn)研究所。選取約 200g 的雌雄個(gè)體各3尾，刮去表面鱗片，剪取各尾背部肌肉約 20mg 。

1.2RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

利用Trizol試劑盒提取光倒刺鮑肌肉組織的RNA，采用ThermoNanodrop 2000c、Agilent2100分別測(cè)定RNA純度、濃度及完整性。用含有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，然后加入裂解緩沖劑將mRNA消化成小片段，再以片段化的mRNA為模板合成cDNA，合成的cDNA用試劑盒進(jìn)行純化，在cDNA3末端加polyA，并連接測(cè)序接頭，利用Hieff NGS@圖2光倒刺鯤Unigene的NR注釋DNASelectionBeads磁珠進(jìn)行純化目標(biāo)片段，然后進(jìn)行PCR文庫(kù)擴(kuò)增，經(jīng)質(zhì)檢后用IluminaHiSeqTM2000測(cè)序儀對(duì)合格文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.3原始數(shù)據(jù)的組裝拼接

對(duì)原始序列進(jìn)行處理，去除接頭序列和低質(zhì)量序列，以獲得CleanData。然后對(duì)CleanData進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以評(píng)估數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量，包括產(chǎn)量、Q20、N含量、GC含量等。最后用組裝軟件Trinity[6將短reads組裝成Contig和Unigene，并統(tǒng)計(jì)組裝質(zhì)量。

1.4轉(zhuǎn)錄組注釋、分析

將拼接得到的Unigene與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)所有注釋的Unigene數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。根據(jù)注釋信息進(jìn)行功能分類(lèi)和途徑注釋。使用BlastGO軟件[17對(duì)獲取的Unigene進(jìn)行GO注釋，并用WEGO軟件[18對(duì)所有Unigene做GO功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。用Blastx將基因比對(duì)到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)基因及其產(chǎn)物進(jìn)行同源分類(lèi)。同時(shí)，將Unigene比對(duì)到KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，分析Unigene的功能及其在細(xì)胞代謝中參與的途徑等。

1.5 微衛(wèi)星查找和SNP檢測(cè)

利用MicroSAtellite軟件對(duì)拼接得到的Unigene進(jìn)行微衛(wèi)星定位。在MISA結(jié)果的基礎(chǔ)上，保留前后序列均不小于 150bp 的微衛(wèi)星，對(duì)微衛(wèi)星進(jìn)行分型，用Primerprimier6.0軟件的默認(rèn)設(shè)置設(shè)計(jì)引物。最后使用SOAPsnp檢測(cè)樣品的SNP。

2結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)

測(cè)序結(jié)果表明，總計(jì)產(chǎn)出13525001683nt數(shù)據(jù)，過(guò)濾后得到的cleanreads數(shù)目為95231190個(gè)，Q20含量為 96.40% ，N含量為0，GC含量為 49.43% 。拼接后得到91467個(gè)Unigene，總長(zhǎng)為73474804nt ，Unigene長(zhǎng)度分布如圖1所示，其中序列長(zhǎng)度均大于 200nt ，且大于 3 000nt 的有4163個(gè)，最大、最小長(zhǎng)度分別為40474和 201nt ，平均長(zhǎng)度為803nt ，N50達(dá)1568個(gè)。

2.2 Unigene功能注釋

利用Blast工具將91467個(gè)Unigene序列與NR、KEGG、KOG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)（E-value lt;10^-5 ）進(jìn)行比對(duì)，NR、GO、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分別注釋了48912、17577、28503、25927個(gè)Unigene，共有490610 53.64% ）個(gè)Unigene注釋到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.2.1 NR注釋 在NR注釋中，用E-value來(lái)表示

Unigene與NR庫(kù)的匹配程度。如圖2A所示，超過(guò)64% 的Unigene的E-value小于 e^-50 ，可見(jiàn)光倒刺鯤基因的功能與NCBI的NR庫(kù)注釋結(jié)果相符度較高。對(duì)獲得的48912個(gè)Unigene進(jìn)行物種分布匹配率統(tǒng)計(jì)（圖2B），與光倒刺鮑基因匹配率較高的是犀角金線鈀（Sinocyclocheilusrhinocerous）、安水金線（S.anshuiensis）和金線（S.grahami），匹配率分別為26%23% 和 18% 。

2.2.2GO功能注釋及分類(lèi) 與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋，共有17557個(gè)Unigene分別注釋到生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)主要生物類(lèi)別的49個(gè)功能亞類(lèi)中（圖3）。在生物過(guò)程中，最多的是與細(xì)胞過(guò)程相關(guān)的基因，共8793個(gè)，其次是與單生物過(guò)程相關(guān)基因，共有8508個(gè)；在細(xì)胞組分中，與細(xì)胞和細(xì)胞組分有關(guān)的

基因均有6071個(gè)；在分子功能中，主要是與結(jié)合和催2.2.3KOG功能分類(lèi)將Unigene和KOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（圖4），結(jié)果顯示，28503個(gè)Unigene被分為25個(gè)KOG聚類(lèi)。其中，排在前三的聚簇有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)化活性功能相關(guān)的基因，分別有8880個(gè)和5758個(gè)。機(jī)制，一般功能預(yù)測(cè)和翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化、分子伴侶，分別有14872，10 527和4846個(gè)Unigene，而Unigene數(shù)量最少的為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，僅181個(gè)。

2.2.4KEGG代謝通路分析 在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果中，注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的25927個(gè)Unigene富集到295條代謝通路上。如圖5所示，所占比例較高的前10條通路分別為刺激神經(jīng)組織的配體受體交互、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路、鈣信號(hào)通路、黏著斑、內(nèi)吞作用、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、單純皰疹感染、細(xì)胞因子受體相互作用、緊密連接和心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)。

2.3 微衛(wèi)星分析

由表1可知，使用MISA軟件共發(fā)現(xiàn)9036條微衛(wèi)星序列，含微衛(wèi)星的Unigenes序列共有7283條，占總Unigene（91467條）的 7.96% ，其中，復(fù)合型的微衛(wèi)星序列共有835條，其余為以不間斷重復(fù)方式組成的單一型微衛(wèi)星。由表2可知，在光倒刺轉(zhuǎn)錄組中，二核苷酸重復(fù)序列最多，有5204條，其次是三核苷酸重復(fù)序列和四核苷酸重復(fù)序列，分別有2523和965條，五、六核苷酸重復(fù)序列共344條；此外，不同微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)也有差異，除了單堿基微衛(wèi)星位點(diǎn)，最豐富的重復(fù)次數(shù)為6次，有2718個(gè)位點(diǎn)，占總數(shù)的 30.08% ，其次是重復(fù)次數(shù)為5次，有1605個(gè)位點(diǎn)，占總數(shù)的 17.76% 。由圖6可知，在二核苷酸重復(fù)序列中，所占比例最高的是AC/GT，占總數(shù)的 36.8% ，其次是AG/CT和AT/AT，分別為 14.6% 和 5.9% ；在三核苷酸重復(fù)中，所占比例最高的是ATC/CTG，占總數(shù)的 5.6% ；四核苷酸重復(fù)序列中，比例最高的重復(fù)單元為AAAT/ATTT，占總數(shù)的 3% ；五、六核苷酸重復(fù)序列中，各重復(fù)序列所占比例均較低。

3結(jié)論與討論

高通量測(cè)序是一種高質(zhì)量、低成本、高效率的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析法[20]。本研究對(duì)光倒刺轉(zhuǎn)錄組基因進(jìn)行測(cè)序、組裝和拼接，再通過(guò)生物信息學(xué)方法分析得到光倒刺Unigene序列，對(duì)其進(jìn)行注釋、功能分類(lèi)和微衛(wèi)星分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)，結(jié)果表明，拼接得到91467個(gè)Unigene，基因序列平均長(zhǎng)度為 803nt 。Franssen等21認(rèn)為，較長(zhǎng)的測(cè)序讀長(zhǎng)可有效減少拼接錯(cuò)誤，提高拼接重疊群長(zhǎng)度，對(duì)于無(wú)參考基因組的物種來(lái)說(shuō)具有重要意義。91467個(gè)Unigene共有49061（ 53.64% ）個(gè)Unigene可注釋到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，有48912個(gè)Unigene可與NR數(shù)據(jù)庫(kù)匹配；未與任何已知蛋白匹配的Unigene，推斷其可能為新的基因。在這些匹配的Unigene中，與犀角金線鯤的Unigene匹配率最高，達(dá)到 26% ，其次是安水金線和金線，分別為 23% 和 18% ，說(shuō)明在數(shù)據(jù)庫(kù)中，光倒刺鮑的基因序列信息較少，而本次獲得的光倒刺Unigene可以豐富數(shù)據(jù)庫(kù)中光倒刺的基因信息。

53.64% 的Unigene被注釋到KOG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，接近 50% 基因未搜索到同源基因序列，說(shuō)明目前基因數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的魚(yú)類(lèi)基因豐富度有待進(jìn)一步提高。這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果有助于進(jìn)一步了解光倒刺鈀基因的分子功能、所處細(xì)胞位置、參與生物過(guò)程、代謝途徑和信號(hào)通路等，為光倒刺的功能基因、相關(guān)基因的信號(hào)通路、基因所處的位置及生理功能等的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)信息。其中一些與細(xì)胞免疫功能相關(guān)的基因可以用來(lái)制作基因表達(dá)芯片，用于光倒刺鮑免疫水平檢測(cè)，還可作為光倒刺抗病品系選育的生化指標(biāo)。

在光倒刺鮑轉(zhuǎn)錄組中，二核苷酸重復(fù)序列的微衛(wèi)星含量最高，其次是三核苷酸重復(fù)序列，這與大部分真核生物的研究結(jié)果一致；四、五、六核苷酸重復(fù)序列的微衛(wèi)星豐富度明顯低于二、三核昔酸，該結(jié)果也在其他真核生物中得到了驗(yàn)證[22-23]。在光倒刺轉(zhuǎn)錄組的二核苷酸重復(fù)序列中，以AC/GT的數(shù)量最多，占 36.8% ，該結(jié)果與絕大多數(shù)脊椎動(dòng)物的基因組序列研究結(jié)果相一致[24-26]。其次是AG/CT和AT/AT，而CG/CG的含量最少，極少的CG微衛(wèi)星重復(fù)單元數(shù)量可能是因?yàn)樵诨蚪M中胞嘧啶C容易被甲基化脫氨基轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶T。染色體間有頻繁的滑鏈錯(cuò)配，具有較高的突變率。較高的突變率與高多態(tài)性相關(guān)聯(lián)，序列越長(zhǎng)，其在轉(zhuǎn)錄組中的多態(tài)率越高。本研究中，大多數(shù)的微衛(wèi)星序列屬于單一型，與大部分真核生物通過(guò)轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)到的微衛(wèi)星序列結(jié)果相一致[27-28]。可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄組研究的是在RNA水平上的基因表達(dá)情況，其主要位于CDS區(qū)，基因序列的保守度高，變異小，因此微衛(wèi)星重復(fù)數(shù)較少。

綜上，本研究對(duì)光倒刺鮑轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，在光倒刺鮑轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序中，共得到91467個(gè)Unigene，其中49061個(gè)Unigene注釋到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，NR、GO、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分別注釋了48912、17577、28503、25927個(gè)Unigene;在光倒刺鈀轉(zhuǎn)錄組中，二核苷酸重復(fù)序列的微衛(wèi)星含量最高，有5204條，其次是三核昔酸重復(fù)序列，有2523條。研究結(jié)果為光倒刺鮑的功能基因、相關(guān)基因的信號(hào)通路及生理功能等的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

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（責(zé)任編輯：胡立萍）

基金項(xiàng)目廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)省重點(diǎn)項(xiàng)目（S202411078013）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（202511078046）。

作者簡(jiǎn)介李斯迅（2005—），男，廣東揭陽(yáng)人，從事魚(yú)類(lèi)育種研究；賴潔（2004—），女，廣東河源人，從事魚(yú)類(lèi)育種研究。

通信作者桂林（1975—），男，湖北武漢人，博士，講師，從事魚(yú)類(lèi)育種研究；李強(qiáng)（1983一），男，廣東韶關(guān)人，博士，實(shí)驗(yàn)師，從事魚(yú)類(lèi)育種研究。

收稿日期 2024-11-26