Regulatory effect of the palmate-lobed leaf gene pll on the post-harvest physiology of melon fruits during storage

ZHANG Qiang1， YONG Liangmin1， DAI Wenting2， SHI Yunjiao1

（1.Hinanlsfse

al Sciences，Haikou 571100，China）

Abstract： The melon palmate-lobed leaf gene pll belongs to AINTEGUMENTA（ANT） transcription factor gene， which playsan importantrole inregulating plant growthand fruit development.During theresearch，the gene silencing of pll was detected byvirus-induced gene silencing（VIGS）technique.Thechanges of lipoxygenase activity，ethylene release and respiratory metabolism in fruits under normal and silent expression of _pll gene were compared，and the effects of pl （204號(hào) gene silencing inhibitiononthe expression of ethylene synthesisand sugar metabolism enzyme-encoding genes and related enzyme activities in fruitswere studied.The results showed that the low expression of pll gene in fruits could reduce the activityof lipoxygenase，ethylene release and respiration rate.Moreover，the pll gene had a positive regulation efect on ethylene synthesis and carbohydrate metabolism gene expression in fruits，and when the expression of pll gene was suppressed by silencing，the expresion of genes related to ethylene synthesisand glucose metabolism in fruits was also dow-regulated， thus reducing the activities of ethylene synthesis and glucose metabolism enzymes.It can be seen that the pll gene is in

收稿日期：2024-10-29

volvedintheregulationofpost-harvestphysiology，andthe down-regulation of pll gene expression has a delayed and inhibitory effect on the post-harvest physiological metabolismof melon fruits.

Key words：muskmelon； pll gene； gene silen-cing；enzymeactivity；post-harvest physiology

甜瓜（CucumismeloL.）主要產(chǎn)于中國(guó)西部地區(qū)，其農(nóng)藝性狀優(yōu)良，果型勻稱，口感與風(fēng)味俱佳，深受消費(fèi)者喜愛。普通甜瓜的葉片近似圓狀心形，葉緣無(wú)裂刻。新疆大學(xué)國(guó)家瓜類工程技術(shù)研究中心研究團(tuán)隊(duì)在試驗(yàn)田中發(fā)現(xiàn)了與伽師系列甜瓜親緣關(guān)系較近的天然突變體，其葉緣有很深的裂刻，總體呈掌狀裂型葉，屬葉型突變的特異種質(zhì)，該研究團(tuán)隊(duì)將該裂葉突變體命名為 bm7 。Gao 等1對(duì)突變體 bm7 進(jìn)行深入研究，并確定了調(diào)控甜瓜掌狀裂葉性狀的主效基因，該基因被命名為 _pll ，該基因?qū)儆谥楸话l(fā)育異常蛋白（ANT）轉(zhuǎn)錄因子基因，ANT是一類特殊的植物轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)植株的莖、葉、果實(shí)等器官的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的調(diào)控作用[2-3]

果實(shí)的后熟生理主要涉及乙烯的生物合成、脂肪酸代謝及糖代謝等。脂氧合酶（LOX）是一類含有非血紅素鐵蛋白的脂肪氧化酶，具有結(jié)構(gòu)特異性[4-5]。在植物生長(zhǎng)發(fā)育、乙烯生物合成及果實(shí)成熟與衰老等一系列生理代謝過(guò)程中，脂氧合酶均是不可缺少的物質(zhì)[。有研究發(fā)現(xiàn)， LOX 的代謝產(chǎn)物能夠啟動(dòng)果實(shí)的乙烯代謝，促進(jìn)果實(shí)成熟[7]。甜瓜屬于呼吸躍變型果實(shí)，乙烯對(duì)果實(shí)的后熟起著至關(guān)重要的作用。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶編碼基因（ACSI）、ACC氧化酶編碼基因（ACO1）是重要的乙烯合成相關(guān)基因，乙烯合成相關(guān)基因和乙烯受體相關(guān)基因的表達(dá)與果實(shí)后熟生理密切相關(guān)[8]糖代謝是果實(shí)中另一個(gè)重要的后熟生理過(guò)程[]淀粉與可溶性糖之間的轉(zhuǎn)化是造成果實(shí)硬度發(fā)生變化的重要因素，在此過(guò)程中，淀粉酶（AM）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）與蔗糖合成酶（SS）起到了重要作用[12-13] O

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus induced gene silen-cing，VIGS）是一種高效的基因功能分析方法[14]，廖晶晶[15]成功利用煙草脆裂病毒（TRV）載體沉默了薄皮甜瓜LOX10基因，明確了在旱脅迫下該基因具有促進(jìn)葉片成熟和衰老的作用。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)， _pll 基因的異常表達(dá)會(huì)對(duì)甜瓜果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。目前，關(guān)于 _pll 基因?qū)μ鸸喜珊笊泶x方面影響的研究還未見報(bào)道。本研究擬以西州蜜17號(hào)為試驗(yàn)材料，在甜瓜生長(zhǎng)過(guò)程中用VIGS技術(shù)對(duì) _pll 基因進(jìn)行沉默，研究 _pll 基因低表達(dá)對(duì)甜瓜果實(shí)采后脂氧合酶活性的影響，同時(shí)研究果實(shí)中乙烯合成與糖代謝相關(guān)基因及相關(guān)酶活性的變化，以期明確 _pll 基因?qū)μ鸸瞎麑?shí)后熟生理的影響，為闡明甜瓜果實(shí)后熟機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用甜瓜種質(zhì)資源西州蜜17號(hào)與TRV載體由新疆大學(xué)提供。生物技術(shù)試驗(yàn)所需酶、試劑盒、克隆載體購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，盧里亞-貝塔尼（LB）培養(yǎng)液（培養(yǎng)基）、酵母提取物-牛肉浸膏（YEB）培養(yǎng)液（培養(yǎng)基）由實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

3051H型呼吸速率測(cè)定儀，購(gòu)自杭州綠博儀器有限公司；TraceGC1300氣相色譜儀，購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司;LineGene9600Plus熒光定量PCR儀，購(gòu)自杭州博日科技有限公司。一次性無(wú)菌注射器（ 1mL 購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)用器材廠。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1pl基因沉默選擇 _pll 基因第1外顯子上長(zhǎng)度約 400bp 的片段，根據(jù)片段序列設(shè)計(jì)引物P1、P2，以提取的甜瓜基因組DNA為模板，獲得重組質(zhì)粒PMD18-T-p。參考李萌晗的方法，構(gòu)建病毒載體pTRV2-pL，用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。制備農(nóng)桿菌感受態(tài)后，用載體pTRV2-pl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。用一次性無(wú)菌注射器（ 1mL 將轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌菌液注射入甜瓜植株的莖中，進(jìn)行基因沉默處理。

1.3.2樣本處理選取成熟度、大小、果型均一的果實(shí)，對(duì)照組為普通植株的果實(shí)，處理組為基因沉默處理植株的果實(shí)。對(duì)果實(shí)進(jìn)行微創(chuàng)取樣，檢測(cè)果實(shí)中_pll 基因的沉默效率。用直徑為 2mm 的空心針管刺入果皮下方 2～3cm 處取樣，為了防正創(chuàng)口影響果實(shí)貯藏，取樣結(jié)束后應(yīng)立即用凡士林封堵創(chuàng)口。由于沉默效率過(guò)低或過(guò)高時(shí)均存在沉默不穩(wěn)定的情況，因此處理組選擇沉默效率為 50%～60% 的果實(shí)。為了確保試驗(yàn)條件對(duì)等，對(duì)照組果實(shí)也進(jìn)行同樣的微創(chuàng)處理，并用凡士林封堵創(chuàng)口。在后續(xù)試驗(yàn)中，選擇距離創(chuàng)口較遠(yuǎn)的位置進(jìn)行采樣。對(duì)照組與處理組果實(shí)均單果套泡沫網(wǎng)袋后裝入包裝箱內(nèi)，包裝密度為4個(gè)/箱；貯藏條件為溫度（ 10±1 ） C ，濕度 50%±5% 。

1.3.3呼吸強(qiáng)度與乙烯釋放量的測(cè)定呼吸強(qiáng)度的測(cè)定：將甜瓜果實(shí)置于測(cè)定容器內(nèi)，用導(dǎo)氣管將容器與呼吸速率測(cè)定儀連接，氣流速度設(shè)為0.4L/min ，單位為 mg/（kg?h） （以 CO₂ 計(jì)）[17]

乙烯釋放量的測(cè)定使用氣相色譜儀，參照Qi等[18]的方法，單位為 μL/（μg?h） 。

以上檢測(cè)過(guò)程每次均取9個(gè)果實(shí)，分3組，每組3個(gè)果實(shí)，每組重復(fù)測(cè)定3次。1.3.4脂氧合酶、蔗糖代謝酶和淀粉酶活性的測(cè)定脂氧合酶活性的測(cè)定參照代文婷等[19]的方法，單位為 U/（g?min） （表示酶反應(yīng)液在 234nm 波長(zhǎng)處 1min 內(nèi)吸光度的增加值）。

蔗糖代謝酶、淀粉酶的提取和活性的測(cè)定參照張強(qiáng)等[17]的方法，酶活性以 OD₅₂₀ 表示。

1.3.5果實(shí)中 .SPS，SS，AM 編碼基因以及 基因的定量表達(dá)分析[20-21] 用RNA 提取試劑盒提取果實(shí)的總RNA，并以總RNA為模板合成cDNA，以Actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，引物序列見表1。

用 _pll 基因構(gòu)建載體時(shí)使用的限制性 ScaI 的序列為AAAAGTACT（ 5^′3^′? ，BamHI的序列為CGCGGATCC（ ）°

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel繪圖，用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以Plt;0.05 作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1果實(shí)采后 _pll 基因表達(dá)與沉默穩(wěn)定性檢測(cè)

在對(duì)貯藏過(guò)程中后熟果實(shí)的生理代謝指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí)，測(cè)定 _pll 基因沉默的穩(wěn)定性，并用熒光定量PCR對(duì)不同貯藏期果實(shí)樣本的 _pll 基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。如圖1所示，對(duì)照組與處理組果實(shí)中 _pll 基因的相對(duì)表達(dá)量均保持穩(wěn)定。由此可以看出，甜瓜果實(shí)在采后貯藏的過(guò)程中， _pll 基因在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持在正常的表達(dá)水平，并且處理組果實(shí)中pu基因的沉默效率能夠保持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定。

同一時(shí)間的不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（ Plt; 0.05）。

2.2p基因沉默對(duì)甜瓜貯藏過(guò)程中脂氧合酶活性、乙烯釋放量與呼吸速率的影響

脂氧合酶活性受到多個(gè)相關(guān)基因的綜合表達(dá)調(diào)控，對(duì)于單個(gè)基因的表達(dá)分析難以判斷其對(duì)ZOX活性的影響，因此，分析脂氧合酶的總體活性能夠從整體上直觀判斷LOX活性的變化趨勢(shì)。如圖2A所示，對(duì)照甜瓜果實(shí)的LOX活性顯著高于處理組（ Plt; 0.05），在貯藏初期，對(duì)照果實(shí)中的LOX活性有上升趨勢(shì)，并在貯藏第6d達(dá)到峰值，隨后下降并保持平穩(wěn)。處理組果實(shí)中的LOX活性在貯藏初期則較為穩(wěn)定，在貯藏中后期有所上升。如圖2B所示，對(duì)照果實(shí)的乙烯釋放量發(fā)生了躍變，在貯藏第8d達(dá)到峰值，然后迅速下降；處理組的乙烯釋放量顯著小于對(duì)照（ Plt;0.05 ），且變化較為緩慢，在貯藏第12d達(dá)到最大值后開始緩慢下降。如圖2C所示，對(duì)照的果實(shí)呼吸速率在貯藏第 10d 達(dá)到峰值，隨后迅速下降；處理組果實(shí)的呼吸速率則先表現(xiàn)為緩慢上升，在貯藏第14d達(dá)到最大值并超過(guò)對(duì)照，之后不斷下降。由上述結(jié)果可知， LOX 活性較乙烯釋放量更早發(fā)生變化，并且乙烯釋放量的變化早于呼吸速率的變化，通過(guò)對(duì)照與處理組果實(shí)中LOX活性、乙烯釋放量、呼吸速率的比較可知， _pll 基因沉默能夠降低 有不同程度的抑制作用。果實(shí)的LOX活性，并對(duì)果實(shí)的乙烯釋放、呼吸代謝同一時(shí)間的不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（ 衣小左開業(yè)有（10.J）。 Plt;0.05） 。

2.3p基因沉默對(duì)乙烯合成相關(guān)酶活性及酶編碼基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3.1pl基因沉默對(duì)ACC合成酶活性與ACC合成酶編碼基因ACS1相對(duì)表達(dá)量的影響由圖3A、圖3B可以看出，對(duì)照甜瓜果實(shí)的 ACC 合成酶活性在貯藏第6d達(dá)到峰值，之后（8＼～10d）快速下降。ACC合成酶編碼基因ACS1的相對(duì)表達(dá)量在貯藏第4d達(dá)到峰值，在貯藏第6＼～10d快速下降，隨后保持平穩(wěn)。在處理組中， ACC 合成酶活性的變化也存在躍變現(xiàn)象，但躍變發(fā)生較對(duì)照有所推遲，峰值也顯著低于對(duì)照（Plt;0.05）

ACC：1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸。同一時(shí)間的不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05） 。

2.3.2pll基因沉默對(duì)ACC氧化酶活性與ACC氧化酶編碼基因（ACOI）相對(duì)表達(dá)量的影響如圖4A、圖4B所示，對(duì)照甜瓜果實(shí)的ACC氧化酶活性在貯藏第4＼～6d快速升高，并在貯藏第6d出現(xiàn)躍變峰，ACC氧化酶編碼基因ACO1的相對(duì)表達(dá)量與酶活性呈同步變化。在處理組中，ACC氧化酶活性上升得較為緩慢，在貯藏第 10d 達(dá)到最大值，并且酶活性與酶編碼基因的相對(duì)表達(dá)量在大部分時(shí)間顯著低于對(duì)照（ ?lt;0.05 ）。

2.4pl基因沉默對(duì)糖代謝酶活性及酶編碼基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4.1pll基因沉默對(duì)淀粉酶（AM）活性及AM編碼基因相對(duì)表達(dá)量的影響由圖5可知，在貯藏前期，對(duì)照組甜瓜果實(shí)中的淀粉酶（AM）活性已經(jīng)表現(xiàn)出一定的上升趨勢(shì)，并且在貯藏初期酶活性上升較快，在貯藏第4d達(dá)到最大值，之后快速下降，再呈緩慢波動(dòng)式變化，AM編碼基因的相對(duì)表達(dá)量與酶活性幾乎呈同步變化；處理組果實(shí)的AM活性與AM編碼基因的相對(duì)表達(dá)量受到一定程度的抑制，但整體呈緩慢上升的趨勢(shì)，并且在整個(gè)貯藏過(guò)程中，果實(shí)中的酶活性與酶編碼基因的相對(duì)表達(dá)量一直顯著低于對(duì)照（ Plt;0.05， 。

ACC：1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸。同一時(shí)間的不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05： 。

4貯藏過(guò)程中甜瓜果實(shí)ACC氧化酶活性及ACC氧化酶編碼基因相對(duì)表達(dá)量的變化AM：淀粉酶。同一時(shí)間的不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05） 1。

2.4.2pll基因沉默對(duì)SPS活性及SPS編碼基因相對(duì)表達(dá)量的影響由圖6A、圖6B所示，在貯藏初期，對(duì)照果實(shí)的SPS活性、SPS編碼基因的相對(duì)表達(dá)量快速增加，分別在貯藏第6d、4d達(dá)到最大值，之后整體呈下降的趨勢(shì)。處理組果實(shí)的SPS活性及

SPS編碼基因相對(duì)表達(dá)量的變化有類似特征，在貯藏過(guò)程中整體上先上升，達(dá)到最大值后逐漸下降。此外，除貯藏第 18d 的相對(duì)表達(dá)量外，處理組果實(shí)中SPS活性與SPS編碼基因的相對(duì)表達(dá)量始終顯著低于對(duì)照（ Plt;0.05， 。

同一時(shí)間的不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05 L

2.4.3pll基因沉默對(duì)蔗糖合成酶（SS）活性及SS編碼基因相對(duì)表達(dá)量的影響由圖7A、圖7B可以看出，對(duì)照甜瓜果實(shí)中的SS活性在貯藏初期不斷升高，之后一直保持在較高水平。對(duì)照SS編碼基因的相對(duì)表達(dá)量在貯藏前期先緩慢上升，隨后突然升高，在貯藏第6d后下降，說(shuō)明當(dāng)SS編碼基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到一定水平時(shí)，即能使SS保持較高活性。在整個(gè)貯藏過(guò)程中，處理組果實(shí)的SS活性與 ^SS 編碼基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照果實(shí)（ ?-0.05 。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明， _pll 基因?qū)μ鸸瞎麑?shí)的糖代謝生理有較強(qiáng)的調(diào)控作用，當(dāng) _pll 基因的相對(duì)表達(dá)量較低時(shí)，能夠抑制甜瓜果實(shí)糖代謝酶基因的表達(dá)，進(jìn)而降低酶活性。

2.5對(duì)照與處理組果實(shí)采后貯藏過(guò)程中形態(tài)變化 的差異

如圖8所示，在甜瓜果實(shí)貯藏過(guò)程中，對(duì)照與處理組甜瓜果實(shí)的外觀形態(tài)均未出現(xiàn)明顯變化。在貯藏第10d，對(duì)照果實(shí)開始出現(xiàn)受到病原微生物侵染后的表征，處理組果實(shí)則在貯藏第14d才開始出現(xiàn)受到病原微生物侵染后的表征；在貯藏第18d，對(duì)照中約 30% 的甜瓜果實(shí)受到病原微生物侵染并發(fā)生不同程度的腐爛，處理組甜瓜果實(shí)受到病原微生物侵染、發(fā)生腐爛的比例則低于 20% 。因此，對(duì)照果實(shí)更容易受到病原微生物侵染并發(fā)生腐爛，這表明_pll 基因的低表達(dá)有利于甜瓜果實(shí)貯藏。

A：對(duì)照；B：處理組。

3討論

在果實(shí)的后熟生理過(guò)程中， LOX 與乙烯起著非常重要的作用，并且LOX對(duì)乙烯產(chǎn)生有一定的影響[22]。 LOX 催化降解細(xì)胞膜脂，增加細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)乙烯合成酶與其反應(yīng)底物的結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生乙烯[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在香蕉中，LOX1基因表達(dá)水平提高，能夠促進(jìn)乙烯的釋放[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，LOX活性的升高先于乙烯釋放與呼吸躍變的發(fā)生，LOX活性的升高可能對(duì)乙烯的生成有促進(jìn)作用并發(fā)生一系列的后熟生理代謝反應(yīng)。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，pl基因低表達(dá)降低了LOX活性，乙烯釋放量的峰值出現(xiàn)時(shí)間與呼吸躍變時(shí)間也有所推遲。因此，可以推測(cè)，pu基因的低表達(dá)能夠通過(guò)降低LOX活性來(lái)間接減緩乙烯的產(chǎn)生，并推遲乙烯釋放峰值與呼吸躍變的發(fā)生時(shí)間。ACC合成酶編碼基因（ACSI）、ACC氧化酶編碼基因（ACO1）是乙烯合成的重要酶。pl基因?qū)儆谡{(diào)控基因，該基因發(fā)揮作用是通過(guò)其表達(dá)產(chǎn)物PLL轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其他基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，用VIGS技術(shù)沉默pu基因表達(dá)，ACSI、ACO1的表達(dá)水平也出現(xiàn)下調(diào)，由此可知，PLL轉(zhuǎn)錄因子能夠促進(jìn)ACS1、ACO1的表達(dá)， _pll 基因低表達(dá)，PLL轉(zhuǎn)錄因子也隨之減少，從而致使 的相對(duì)表達(dá)量下降，ACC合成酶與ACC氧化酶活性也有所降低。

糖代謝在果實(shí)的后熟生理中也發(fā)揮重要作用[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，淀粉酶能夠促進(jìn)果實(shí)后熟，并導(dǎo)致果實(shí)發(fā)生軟化[26]。例如，在磨盤柿果實(shí)后熟軟化生理過(guò)程中，淀粉酶分解淀粉產(chǎn)生的糖能夠?yàn)楹粑S變提供所需的能源物質(zhì)[27]。此外，淀粉酶與乙烯的產(chǎn)生有一定關(guān)系，淀粉酶引起淀粉水解產(chǎn)生糖，為呼吸躍變提供能源物質(zhì)，乙烯釋放量增加后，又促進(jìn)淀粉酶基因表達(dá)，使酶活性升高[28]。本研究發(fā)現(xiàn) .pll 基因相對(duì)表達(dá)量下調(diào)對(duì)淀粉酶編碼基因、蔗糖磷酸合成酶編碼基因、蔗糖合成酶編碼基因的表達(dá)有較強(qiáng)的抑制作用，說(shuō)明pl基因是調(diào)控果實(shí)糖代謝過(guò)程的重要基因， _.pll 基因的表達(dá)產(chǎn)物PLL轉(zhuǎn)錄因子能夠促進(jìn)淀粉酶編碼基因、蔗糖磷酸合成酶編碼基因、蔗糖合成酶編碼基因的表達(dá)。pl基因的低表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致淀粉酶編碼基因、蔗糖磷酸合成酶編碼基因、蔗糖合成酶編碼基因相對(duì)表達(dá)量的下調(diào)，從而降低淀粉酶、蔗糖代謝酶的活性，進(jìn)而抑制果實(shí)的后熟生理代謝。

4結(jié)論

調(diào)控甜瓜掌狀裂葉性狀的主效基因 _pll 對(duì)果實(shí)的LOX活性具有調(diào)節(jié)作用， _pll 基因的低表達(dá)能夠降低果實(shí)中 LOX 的活性，從而抑制LOX對(duì)果實(shí)后熟生理的啟動(dòng)作用； _pll 基因表達(dá)受到沉默抑制時(shí)，果實(shí)中乙烯合成與糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平也出現(xiàn)下調(diào)，進(jìn)而抑制果實(shí)的后熟生理進(jìn)程。由此可知， _pll 的表達(dá)對(duì)果實(shí)采后貯藏期的后熟生理具有正向調(diào)控作用。

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