中圖分類號：S572 文獻標識碼：A文章編號：1007-5119（2025）02-0083-10

，鄧智超1，3，吳榮榮12，劉濤1，3，（1. 266101；2.青島農(nóng)業(yè)大學，青島266109；3.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 ）

Identification of Tobacco SRS Gene Family and Abiotic Stress-induced Expression Analysis

YANG Yalun12， DENG Zhichao1.3， DONG Ruonan1， PAN Xiaolu1，3， WU Rongrong1，2， LIU Tao1，3， GAO Xiaoming1* (1.InstituteofTobaccoResearchofCAAS，Qingdao266101，China;2.Qngdao Agricultural UniversityQingdao266109，Cina; 3. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 10oo81， China)

Abstract: The SH-related sequence(SS)gene family encodes aclass of plant-specific zincfinger protein transcriptionfactors hat playcrucial roles inregulating plant growth，developmentandstressresponses.Toexplorethefunctionofte SRSgenefamily n tobacco，18NSRSgeneswereidentifiedfromthetobacogenomedatabaseanddesignatedasNSRS1toNtSRS18.Bioinformatics analyseswereconductedtoinvestigatetheirproteincharacteristics，subcelularlocalization，phylogeneticrelationships，gene structures，andooterentditoallyprioaesoilysdeenttisssdsel theirresponses todrought，salt，andlowtemperaturestresswereanalyzedusingqRT-CR.Resultsrevealedthat NtSRSproteins containedtheconservedDUF702domain，withmostlocalizedin the nucleus.Phylogeneticanalysis clusteredtheNtSRSfamilyinto 5 subfamilies，with membersofthesamesubfamilyexhibitinghighlyconservedgeneand protein structures.Promoteranalysis identifiednumeroushormone-responsiveelementsand stres-responsive elementswithintheregulatoryregionsof NtSRSgenes. Expresion proilingshowed thatNtSRSgnes exhbitedsgnificant tssuespeciic expresson，withosthighlyexpressd inflower budsand stems.NotablyNSRS3and NSRS16 were stronglyinducedunderdrought，salt，andlowtemperature strescoditios. OverallthisstudyprovidesacomprehensivecharacterzationofthetobaccoSRSgenefamilyofferingatheoreticalbasisforthe genetic improvement of tobacco germplasm resources.

Keywords: tobacco; SRS gene family; abiotic stress; expression pattern analysis

SRS基因家族又稱為短節(jié)間相關序列[shortinternodes(SHI）-related sequences]基因家族或者STY(STYLISH)基因家族，該家族基因編碼一種植物特有的鋅指蛋白轉錄因子I。SRS蛋白包含

RING型鋅指結構域和IGGH結構域2個高度保守的結構域。其中RING型鋅指結構域（CX2CX7CX4CX2C2X6C，X代表可變氨基酸）為環(huán)狀結構，通過與RNA、蛋白質和脂質等底物結合，發(fā)揮其蛋白功能[2]；IGGH結構域富含酸性氨基酸，在其他蛋白質中均未發(fā)現(xiàn)，是SRS蛋白獨有的保守結構域[3]。此外，部分SRS蛋白還包含另一個與鋅指結構域重疊的保守結構域 。近年來，一些DUF蛋白的功能已被闡明，它們參與植物生長發(fā)育和脅迫響應[4]

SRS家族參與開花調(diào)控、光形態(tài)建成、葉片發(fā)育、株型調(diào)控和非生物脅迫響應等植物生長發(fā)育過程[5]。擬南芥（Arabidopsisthaliana）中有11個SRS基因[6-7]，其中AtSTYI和AtSTY2可促進花柱和柱頭形成，并影響擬南芥雌蕊發(fā)育過程中的維管發(fā)育。HY5、BBX21和BBX22基因是擬南芥光形態(tài)建成促進因子，AtSRS5轉錄因子激活HY5、BBX21和BBX22基因的表達，從而影響擬南芥的光形態(tài)建成[8。AtSHI是赤霉素信號通路中的一種負調(diào)控因子，影響花序細胞伸長和開花時間，atshi突變體具有莖生長減少，花朵產(chǎn)量高的表型[。水稻(Oryzasativa)中，OsSHII與調(diào)控水稻株型的轉錄因子IPA1互作，并抑制IPA1對下游靶基因OsTB1及OsDEP1啟動子的結合活性，影響其基因轉錄功能，進而協(xié)同調(diào)控水稻株型的發(fā)育[10]。紫花苜蓿(Medicagosativa)中有27個SRS基因受低溫和鹽脅迫的顯著誘導[11]，大豆(Glycinemax)SRS基因家族成員可被干旱、鹽和ABA誘導[1]。這些研究均表明，SRS家族轉錄因子在調(diào)控植物生長發(fā)育及應對非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

煙草（NicotianatabacumL.)是植物遺傳學研究模式植物，也是重要的經(jīng)濟作物。煙草生長過程中經(jīng)常遭受低溫、干旱、鹽、堿等環(huán)境因素脅迫，從而嚴重影響煙葉產(chǎn)量和品質。自前，關于煙草SRS基因家族研究尚未見報道。本研究采用生物信息學方法，對煙草SRS基因家族基因（下稱“NtSRS”進行了鑒定與分析，研究了SRS基因家族成員的蛋白理化性質、亞細胞定位、進化關系、基因結構、蛋白質結構域和啟動子元件，分析了該家族基因的組織表達模式，及其對干旱、鹽和低溫脅迫的響應模式。本研究可為后續(xù)煙草SRS基因家族的生物學功能研究奠定基礎，為煙草種質資源改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗所用普通煙草品種K326種子由中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所保存。

1.2煙草SRS基因家族成員鑒定

從茄科基因組數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/)中下載普通煙草(Nicotianatabacum)K326的核酸序列和蛋白序列。從Pfam(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫中下載SRS蛋白保守結構域的隱馬爾可夫模型(PF05142)[12]，以此模型為模板，利用HMMER軟件[13]對煙草的蛋白序列進行比對篩選，獲得含有SRS蛋白保守結構域的煙草候選基因。利用CLU-STAL2.1對獲取的煙草SRS候選蛋白序列進行多序列對比，進一步驗證其特征結構域，最終得到用于進一步研究的煙草SRS基因家族基因（NtSRS)成員。

1.3煙草SRS基因的染色體定位分析

利用煙草基因組注釋文件確定煙草SRS基因的染色體位置。

1.4NtSRS蛋白理化性質分析

通過Expasy在線平臺（http://www.expasy.org/tools/protparam.html)ProtParam工具，計算煙草SRS蛋白的長度、分子量、等電點、脂肪族氨基酸指數(shù)以及疏水性指數(shù)等理化性質參數(shù)。

1.5NtSRS蛋白亞細胞定位預測及驗證

亞細胞定位的預測：利用ProtComp9.0工具（http://linux1.softberry.com），預測煙草SRS蛋白亞細胞定位。

亞細胞定位的驗證：以煙草K326cDNA為模板對煙草 N t S R S I ～ N t S R S I δ 去除終止密碼子的編碼區(qū)序列進行擴增（擴增引物見表1），選擇PCR擴增條帶最亮的2個基因，使用同源重組的方法分別將擴增片段構建到PYG56-GFP表達載體中，構建NtSRS-GFP融合表達載體。通過農(nóng)桿菌介導，分別將NtSRS-GFP融合表達載體及核定位標記mCherry（p2300-35S-H2B-mCherry）注射在本氏煙草葉片中進行瞬時表達。將侵染后的本氏煙在黑暗條件下處理 2 4 h 后， 正常光照培養(yǎng) 4 8 h 。隨后取注射葉片在共聚焦顯微鏡下分別于488、 激發(fā)光下觀察綠色和紅色熒光信號

1.6NtSRS蛋白系統(tǒng)進化樹構建

下載擬南芥（TAIR）、辣椒、番茄及水稻（https://www.uniprot.org）SRs蛋白序列，采用MEGA11構建擬南芥、辣椒、番茄與煙草的SRS蛋白系統(tǒng)進化樹，用MUSCLE法對以上蛋白序列進行多序列比對，鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，bootstrap重抽樣次數(shù)為1000。

1.7NtSRS基因結構及NtSRS蛋白保守結構域分析

利用TBtools軟件分析NtSRS基因家族成員基因組DNA和CDS序列并可視化。使用MEME(http://meme-suite.org/）和 Evolview( https://www.evolgenius.info/evolview/#login)預測NtSRS蛋白保守結構域并可視化，Motif長度設為6\\~100，其余參數(shù)采用系統(tǒng)默認設置。

1.8NtSRS基因組織表達模式分析

從煙草基因表達譜[14]數(shù)據(jù)中檢索NtSRS1\\~NtSRS18在幼葉、成熟葉、幼根、成熟根、莖、花芽、種子、干旱脅迫處理和低溫脅迫處理等17個樣本的煙草基因表達數(shù)據(jù)，利用Cluster3.0軟件與JavaTreeView工具繪制煙草SRS基因表達熱圖。

1.9NtSRS基因在干旱、鹽及低溫脅迫下的表達模式分析

煙草種子消毒后播種于MS固體培養(yǎng)基，在人工氣候室(溫度 ，光照 ，濕度 60 % 培育至4片真葉后進行脅迫處理。

1.9.1干旱和鹽脅迫試驗參考薛瑾等[15]、劉濤等[16]的方法，將煙苗移入含有 3 0 0 m m o l / L 甘露醇的MS液體培養(yǎng)基模擬干旱脅迫，將煙苗移入含有 1 0 0 m m o l / L N a C l 的MS液體培養(yǎng)基模擬鹽脅迫，于處理的0、1、3、6h取樣(3次生物學重復），液氮速凍， 保存，用于RNA提取。

1.9.2低溫脅迫試驗參考李琦瑤等[17]的方法將煙苗移人常規(guī)MS液體培養(yǎng)基，放入 透明培養(yǎng)箱模擬低溫脅迫（自然光照)，于處理的0、1、3、6 n 取樣(3次生物學重復），液氮速凍， 保存，用于RNA提取。

1.9.3RNA提取和qRT-PCR用RNA提取試劑盒（北京康為世紀公司，CW0581M)提取各樣品RNA。用反轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，R333-01)將 1 μ g R N A 反轉錄后獲得cDNA。參照鄧智超等[18]的方法進行熒光定量PCR，以稀釋10倍的cDNA為模板，所用特異性引物見表2（內(nèi)參基因為NtActin），3次技術重復。采用 法進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值 ? ± 標準差，采用Duncan多重范圍檢驗 進行差異顯著性分析。

2結果

2.1NtSRS基因家族成員基本特征分析

2.1.1NtSRS基因鑒定 在煙草中鑒定出18個

SRS家族基因，分別將這些基因命名為NtSRS1\\~NtSRS18（表3）。在煙草的24條染色體中，10條染色體存在SRS基因分布，其中，第5、8、9號染色體上各有2個SRS基因；第6、13、14、17、19、21和22號染色體各有1個SRS基因。其他5個SRS基因分布在Scaffold中。

2.1.2NtSRS蛋白理化性質NtSRS蛋白平均長度為315aa，其中最短的是NtSRS16(177aa），最長的是NtSRS4（452aa)；蛋白分子量范圍 2 0 . 5 9 ～ ，平均 3 4 . 2 8 k D a ；等電點的平均值為7.63，其中等電點最高的是NtSRS16(9.24），最低的是NtSRS12(5.08)；脂肪族氨基酸指數(shù)平均值為

54.16，最大的是NtSRS2(67.58)，最小的是NtSRS16（46.27)；疏水性指數(shù)平均值為-0.72，最大的是NtSRS12(-0.49)，最小的是NtSRS16(-0.97)。

2.2 NtSRS亞細胞定位分析

亞細胞定位預測分析發(fā)現(xiàn)NtSRS1和NtSRS2定位在質外體，其他成員均定位在細胞核上(表3)。為進一步驗證預測結果，選擇亞細胞定位預測為核定位，且PCR擴增條帶最亮的NtSRS14和NtSRS16用于亞細胞定位試驗。結果表明（圖1)，NtSRS14和NtSRS16蛋白均定位于細胞核，與預測結果一致。

注：A和E分別為NtSRS14-GFP和NtSRS16-GFP綠色熒光蛋白在本氏煙葉表皮細胞中的定位（試驗組），B和F為細胞核定位標記mCherry在本氏煙表皮細胞中的定位(對照組)，C和G為試驗組和對照組的重疊圖像，D和H為視野明場。

Note:AndEaldossel andFepresentalood images，DandHare the brightfield views.

2.3NtSRS基因家族系統(tǒng)進化分析

為進一步研究SRS基因的系統(tǒng)進化關系，利用擬南芥、棘椒和番茄的SRS蛋白序列作為參考序列構建系統(tǒng)進化樹。煙草SRS基因家族可被劃分為5個亞家族（圖2)。NtSRS在5個亞家族（Groupl\\~Group5）中分布不均，Groupl 和Group2亞家族中各有2個NtSRS基因，Group3和Group4亞家族中各有4個，Group5亞家族中有6個。

2.4基因結構與蛋白結構域分析

NtSRS基因結構如圖3A所示，NtSRS基因家族成員有2\\~5個外顯子，1\\~4個內(nèi)含子。Groupl亞家族的NtSRS1和NtSRS2均含有5個外顯子，4個內(nèi)含子；Group2亞家族的NtSRS3和NtSRS4，Group5亞家族的NtSRS9和NtSRS10，以及Group4亞家族的NtSRS17均含有3個外顯子，2個內(nèi)含子；其余NtSRS基因均只含有2個外顯子，1個內(nèi)含子。

同一亞家族成員具有基本一致的基因結構，說明NtSRS基因家族的進化關系相對保守。

NtSRS蛋白結構如圖3B所示，共鑒定出10個保守基序(Motif)，其中Motifl、2、3、4、7共同組成了DUF702結構域。Group1亞家族的NtSRS1和 NtSRS2均只含有Motifl和Motif7;Group5亞家族的NtSRS7、NtSRS8包含全部Motif。Motif5只存在于Group4和Group5亞家族的蛋白中；Motif7存在于全部NtSRS蛋白中；Motif10只存在于Group2和Group5亞家族的NtSRS蛋白中。NtSRS蛋白中這些保守結構域的位置和次序高度一致，說明NtSRS蛋白結構高度保守。

2.5NtSRS基因啟動子順式作用元件分析

為進一步闡明NtSRS基因在煙草響應非生物脅迫中的作用，本研究對該基因家族各成員的啟動子序列進行了分析。結果表明(圖4)，即使同一亞家族成員，其啟動子區(qū)域內(nèi)的順式作用元件也存在明顯差異：例如，Group1亞家族的NtSRSI沒有低溫響應元件，而NtSRS2則具有低溫響應元件；

Group2亞家族的NtSRS3沒有茉莉酸甲酯響應元件，而NtSRS4則具有茉莉酸甲酯響應元件；Group3亞家族的NtSRS14和NtSRS16沒有干旱響應元件，而NtSRS13和NtSRS15則具有干旱響應元件；Group4亞家族的NtSRS6沒有脫落酸響應元件，而NtSRS5、NtSRS17和NtSRS18則具有脫落酸響應元件；Group5亞家族的NtSRS11具有機械損傷響應元件，而同屬該亞家族的其他成員則沒有機械損傷響應元件。大部分NtSRS基因啟動子序列中都包含茉莉酸甲酯和脫落酸響應元件。

2.6NtSRS基因表達模式分析

從數(shù)據(jù)庫中下載NtSRS基因在不同組織，及其在干旱和低溫處理下的表達量數(shù)據(jù)(FPKM值）并繪制熱圖。如圖5所示，Group1亞家族基因NtSRS1在花芽和種子表達量較高，NtSRS2在幼葉和種子表達量較高；NtSRS1和NtSRS2在干旱脅迫下表達量沒有顯著改變，在低溫處理下表達量顯著提高。Group2亞家族基因NtSRS3和NtSRS4主要在莖部表達；對干旱不敏感，低溫1d表達量較高。Group3亞家族基因NtSRS15在花芽中表達量較高，在干旱1d表達量顯著升高；NtSRS14在低溫1d表達量顯著升高。Group4亞家族基因NtSRS5和NtSRS6在莖中具有較高表達量，NtSRS5在干旱1d表達量顯著升高。Group5亞家族基因在成熟葉、成熟根以及種子中表達量較低。

2.7NtSRS基因在干旱、鹽和低溫脅迫條件下表達模式分析

為進一步探究NtSRS基因在非生物脅迫中的功能，分析了NtSRS基因在干旱、鹽以及低溫脅迫下的表達水平(圖6\\~8)。結果顯示，大部分NtSRS基因未被檢測到表達，這可能是因為本部分試驗使用的是4片真葉期的煙草幼苗，根據(jù)圖5數(shù)據(jù)，大部分NtSRS基因在幼葉中檢測不到表達。因此，對可以檢測到表達的基因進行進一步的脅迫響應分析(以處理0h為參比1)。

如圖6所示，NtSRS1和NtSRS16表達量在干旱處理1h時顯著升高，之后表達量顯著下降。NtSRS11表達量在干旱處理1h時顯著下降；隨后表達量較干旱處理1h后顯著上升，但仍顯著低于處理前。NtSRS3表達量在干旱處理3h時才開始顯著下降。NtSRS5表達量在干旱處理后呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。

如圖7所示，在鹽處理后，NtSRS5、NtSRS11和NtSRS13的表達量隨處理時間的延長波動較大，無明顯規(guī)律；NtSRS3表達量呈先下降再上升的變化。NtSRS16表達量在鹽處理6h時上調(diào)8倍。

如圖8所示，低溫處理時，NtSRSI、NtSRS3、NtSRS16和NtSRS18的表達量均為先顯著下降，而后在處理6h時又顯著升高。NtSRS13的表達量在處理1、3、6h顯著低于處理 0 h 。

3討論

SRS基因家族編碼一種植物特有的鋅指蛋白

A，NtSRS基因在各種組織中的表達水平；B，NtSRS基因在干旱和低溫脅迫下的表達水平。Note:Ateepesseh

注：圖中不同小寫字母代表 p < 0 . 0 5 水平差異顯著，下同。

Note:Different lowercase letters in figuresrepresent significant differences at the p < 0 . 0 5 level，the same asbelow.

轉錄因子，在植物生長[18]、葉片發(fā)育[19]、花誘導和花發(fā)育[20]、光形態(tài)發(fā)生[8]及植物形態(tài)建成[10]等生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。迄今為止，SRS基因家族成員已經(jīng)在紫花苜蓿[1]、擬南芥[6-7]、大豆[1]、水稻[10]、藜麥[21]、玉米[22]等多種植物中被鑒定出來，但煙草中尚未見相關報道。本研究基于煙草基因組數(shù)據(jù)，首次在普通煙草基因組中鑒定到18個SRS基因家族基因并進行了綜合的生物信息學分析，研究結果可用于進一步深入研究煙草SRS基因功能，為煙草的分子育種提供理論依據(jù)，

NtSRS基因家族分為5個亞家族，相同亞家族的成員具有基本一致的基因結構和保守基序，這表明它們可能在進化、功能和調(diào)控機制上存在一定的相似性。NtSRS蛋白氨基酸長度、分子量、等電點、脂肪族氨基酸比例、疏水性指標以及基因在染色體上的具體位置方面均存在差異，這可能與煙草SRS蛋白家族成員的生物學功能多樣性相關。啟動子結構分析進一步印證了該推斷，即使同一亞家族成員，其啟動子區(qū)域內(nèi)的順式作用元件也存在明顯差異。順式作用元件在植物響應生物和非生物脅迫中起重要作用，NtSRS基因的啟動子中存在大量響應激素、干旱和低溫的順式作用元件。除NtSRS3、NtSRS10、NtSRS11和NtSRS17之外，其余14個NtSRS基因啟動子中均含有茉莉酸甲酯響應元件；除NtSRS6、NtSRS7、NtSRS9和NtSRS10之外，其余14個NtSRS基因啟動子中均含有脫落酸響應元件，由此推斷NtSRS基因與茉莉酸甲酯、脫落酸等激素的調(diào)控密切相關。此外，大部分NtSRS基因啟動子中含有5\\~6種順式作用元件，特別是NtSRS18基因啟動子含有除光和機械損傷響應元件之外的全部8種順式作用元件，說明NtSRS基因可能參與更多的生長發(fā)育進程或者發(fā)揮不同的生物學功能。

一些擬南芥SRS基因在花和根中高表達，但在葉片中不表達[7，23-24]；水稻OsSHI1在根和穗中具有較高的表達量，但在葉片中不表達[10]；甘藍型油菜SRS基因主要表現(xiàn)出根的響應，但在葉片中不表達[25]。本研究中，不同NtSRS在普通煙草中的表達模式存在差異：少數(shù)幾個NtSRS基因在幼葉中少量表達；所有的NtSRS基因在成熟葉片中幾乎不表達；大部分NtSRS基因在莖和花芽中表達，且有的基因表達量較高；個別NtSRS基因在幼根高表達，成熟根中少量表達?？梢?，NtSRS在葉片中的組織表達模式與其他植物基本吻合，而在其他組織中的表達則具有自己的特點，推測這種差異可能與NtSRS在組織器官生長發(fā)育進程中所行使的功能有關。qRT-PCR結果分析表明，在響應非生物脅迫方面，NtSRS5和NtSRS11在干旱脅迫下表達量顯著下調(diào)，推測它們可能參與煙草響應干旱脅迫；NtSRS5和NtSRS16受鹽脅迫誘導表達顯著上調(diào)，推測它們可能參與煙草響應鹽脅迫；

NtSRS13的表達量在整個低溫處理過程中均顯著低于對照，推測它可能參與煙草響應低溫脅迫。其中NtSRS3和NtSRS16對干旱、鹽和低溫3種脅迫均有響應，且兩者在莖中都具有較高的表達量，推測這兩個基因不僅參與響應非生物脅迫，還可能與植物體內(nèi)物質運輸和植物生長發(fā)育過程有關。

4結論

本研究從普通煙草K326中鑒定出18個NtSRS基因，聚類為5個亞家族，NtSRS轉錄因子主要定位于細胞核。大部分NtSRS在莖和花芽等器官中表達量較高，NtSRS3和NtSRS16參與對干旱、鹽和低溫脅迫響應。以上結果為進一步探究NtSRS基因在煙草生長發(fā)育過程中的生物學功能研究奠定了基礎。

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