Abstract：Thecultivationand production of Medicago satiua L.are affected byabrupt cold and extreme low temperature，which seriously afect the healthy development offorage industry in China.Inthis study，two cultivars of alfalfa with diferent fall dormancy，‘Xinjiang Daye’ and‘Zhaodong'，were treated with low temperature for （2號(hào) and ， and cold response genes were screened by transcriptome sequencing technology. After of low temperature treatment，the cold resistanceof‘Zhaodong’was significantly higher than that of‘Xinjiang Daye’at 192 h. Through transcriptome sequencing analysis at and ， 13 differentially expressed genes related to cold resistance were further screened. After qRT-PCR fluorescence quantification was verified，7 genes with expression patterns consistent with the transcriptome data were identified： 2 genes with opposite expression trends in the two varieties of alfalfa，and 5 genes with the same expresion trend in the two varieties ofalfalfa. Inaddition，KEGG pathway enrichment analysis was performed on all diferentially expressed genes，and11 metabolic pathways related to cold resistance including starch and sucrose metabolism，MAPK signaling pathway and galactose metabolism were identified.The diferential genes and metabolic pathways screened in this study would provide references for subsequent studies on cold resistance mechanism and molecular breeding of alfalfa.

Key words：Alfalfa；Low temperature；Cold hardiness； Gene response； Metabolism response

紫花苜蓿（MedicagosatiuaL.）是一種優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草，具有蛋白質(zhì)含量高、消化率高、生長(zhǎng)快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特性，且能夠再生并多年利用，在我國(guó)畜牧產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮著不可或缺的作用。然而，我國(guó)紫花苜蓿集中種植的內(nèi)蒙古、新疆、甘肅和東北等地區(qū)[2]頻繁遭遇極端天氣[3-4]，這不僅給紫花苜蓿自身的生理生長(zhǎng)帶來(lái)極大的阻礙，也對(duì)經(jīng)濟(jì)造成極大的損失[5]。紫花苜蓿在遭受低溫時(shí)，其表面發(fā)生病變、變色、組織破壞、加速衰老甚至腐爛，還會(huì)破壞其細(xì)胞膜系統(tǒng)，改變質(zhì)膜特性及滲透平衡，降低光合和呼吸效率，促進(jìn)蛋白質(zhì)變性和活性氧、脫落酸的累積[6]

在面對(duì)低溫脅迫時(shí)，植物自身的保護(hù)機(jī)制便開(kāi)始響應(yīng)。研究指出，當(dāng)植物暴露在非冰凍的低溫環(huán)境中時(shí)，會(huì)經(jīng)歷抗凍能力增強(qiáng)的過(guò)程，這一過(guò)程被稱為冷馴化。在冷馴化過(guò)程中，數(shù)以千計(jì)的基因在表達(dá)情況上發(fā)生了改變，其中一些基因編碼了參與抗氧化防御和滲透物（如可溶性糖和脯氨酸）生物合成的關(guān)鍵酶8]。可溶性糖除了可以作為滲透保護(hù)劑、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還能通過(guò)與脂質(zhì)雙分子層相互作用等多種途徑發(fā)揮保護(hù)植物細(xì)胞免受冷脅迫傷害的作用9。抗氧化防御系統(tǒng)中的抗氧化酶以及非酶抗氧化劑通過(guò)清除植物體內(nèi)活性氧，來(lái)調(diào)節(jié)植物非生物脅迫耐受性。此外，在紫花苜蓿應(yīng)對(duì)低溫響應(yīng)方面，DREB/CBF，CAMTA，MYB-like和AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子[10-12]、WOX家族成員[13]，以及CML8，ATGs14，eEF-2[15，RLKs等蛋白/酶被人們發(fā)現(xiàn)它們通過(guò)調(diào)控眾多基因的表達(dá)或調(diào)節(jié)代謝物的水平進(jìn)而調(diào)節(jié)了紫花苜蓿的耐寒性。

此外，紫花苜蓿還有一個(gè)重要的自我保護(hù)機(jī)制，即在秋季由生長(zhǎng)狀態(tài)過(guò)渡到休眠狀態(tài)，這種現(xiàn)象被稱為秋眠[17]。夏末秋初收獲后，不同紫花苜蓿品種因秋眠引起的生長(zhǎng)速度不同，導(dǎo)致秋季株高差異顯著，因此，紫花苜蓿被劃分了不同的秋眠型。秋眠程度不同的紫花苜蓿其耐寒性也有所不同。為了更深層次地了解紫花首蓿的抗寒機(jī)制，本研究對(duì)兩個(gè)秋眠性不同的紫花苜蓿品種進(jìn)行低溫處理，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究其抗寒過(guò)程中的關(guān)鍵基因，并嘗試從中找出造成不同秋眠級(jí)紫花苜蓿抗寒性差異的關(guān)鍵基因。從而為紫花苜蓿的抗寒性研究提供新的參考思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選擇‘新疆大葉’（半秋眠型）、‘肇東’（秋眠型）2個(gè)品種紫花苜蓿作為試驗(yàn)材料[18]，進(jìn)一步開(kāi)展低溫處理試驗(yàn)。首先，在試驗(yàn)田里選擇2個(gè)品種大小接近一致的一年生苗分別移栽到直徑 的PVC管內(nèi)進(jìn)行恢復(fù)生長(zhǎng)。待恢復(fù)生長(zhǎng)一個(gè)月后，將PVC管移到培養(yǎng)箱（LRG-LED-35O-D，杭州綠博，中國(guó)）內(nèi)進(jìn)行一周的適應(yīng)性生長(zhǎng)（常溫），隨后進(jìn)行低溫處理。其中，適應(yīng)性生長(zhǎng)的溫度條件為 （光/暗），光照條件為時(shí)長(zhǎng) （光/暗）光照強(qiáng)度 O

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

低溫處理時(shí)，將培養(yǎng)箱的溫度設(shè)置從 （光/暗）降低到 光/暗），光照條件的設(shè)置不變?？紤]基因變化的時(shí)間20和抗寒性變化的時(shí)間，本研究分別在低溫處理開(kāi)始后的 和 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行同一批次處理的不同樣品取樣，取樣部位為紫花苜蓿的根頸，每個(gè)品種3次生物學(xué)重復(fù)。其中， 和 的樣品用于基因變化的分析， 和 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品用于低溫半致死溫度的分析。

1.3低溫半致死溫度的測(cè)定

本研究依據(jù)徐洪雨21所描述的方法，采用低溫半致死溫度 來(lái)表征試驗(yàn)樣品的抗寒性。先將紫花苜蓿根頸樣品在恒溫循環(huán)儀（ZX-5C，上海知信）中進(jìn)行梯度冷凍，然后采用電導(dǎo)率法測(cè)定并計(jì)算細(xì)胞液的相對(duì)滲透率，最后根據(jù)梯度冷凍溫度和細(xì)胞液相對(duì)滲透率進(jìn)行Logistic方程模擬，計(jì)算細(xì)胞液相對(duì)滲透率為 50 % 時(shí)所對(duì)應(yīng)的冷凍溫度，即為 。在梯度冷凍的過(guò)程中， 取樣點(diǎn)樣品冷凍溫度的具體設(shè)置為 - 1 2 和 取樣點(diǎn)樣品冷凍溫度的具體設(shè)置為 - 2 ， - 5 ， - 7 ， - 9 ， - 1 0 ， - 1 2 ， - 1 4 ， - 1 6 和 ： 取樣點(diǎn)樣品冷凍溫度的具體設(shè)置為- 2 ， - 4 ， - 6 ， - 8 ， - 1 0 ， - 1 2 ， - 1 4 ， - 1 6 和 。

使用SPSSV.19對(duì) 數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，分析方法為L(zhǎng)SD法，差異顯著水平為 O

1.4轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及新基因分析

從樣品中提取總RNA，為每個(gè)樣品構(gòu)建信使RNA（mRNA）文庫(kù)，并使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾、測(cè)序錯(cuò)誤率檢測(cè)、GC含量檢查后得到CleanReads。利用HISAT2軟件將CleanReads與紫花苜蓿全基因組數(shù)據(jù)（https：//figshare.com/projects/whole_genome_sequencing_and_assem-bly_of_Medicago_sativa/6638O）進(jìn)行比對(duì)注釋。根據(jù)比對(duì)上基因組Reads的位置信息，使用StringTie軟件將Reads組裝成轉(zhuǎn)錄本，從拼接的轉(zhuǎn)錄本與基因注釋的比較結(jié)果中提取新轉(zhuǎn)錄本信息，從基因組中提取新基因的序列，使用diamond軟件將新基因與KEGG，NR等數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)得到注釋結(jié)果。使用FeatureCountsv1.6.2軟件對(duì)基因比對(duì)情況進(jìn)行計(jì)算，并采用每百萬(wàn)映射片段的轉(zhuǎn)錄本每千堿基的片段數(shù)（FragmentsPerKilobaseoftranscriptperMillionfragmentsmapped，F(xiàn)PKM）值作為衡量轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的水平。FPKM值的計(jì)算公式如下：

轉(zhuǎn)錄本的映射片段FPKM = 映射片段總數(shù)（百萬(wàn) ） × 轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度（kb）

注：其中，轉(zhuǎn)錄本的映射片段數(shù)表示比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄本上的片段數(shù)，即雙端Reads數(shù)目；映射片段總數(shù)表示比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本上的片段總數(shù)，以 為單位；轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度，以 個(gè)堿基為單位。

1.5差異基因篩選及KEGG富集分析

輸人基因的未經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的reads計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，使用DEseq2軟件進(jìn)行樣品間的差異表達(dá)分析獲得兩個(gè)生物學(xué)條件之間的差異表達(dá)基因集。差異分析之后，用Benjamini-Hochberg方法對(duì)假設(shè)檢驗(yàn)概率 P value）進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)矯正，得到錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（Falsediscoveryrate，F(xiàn)DR）。差異基因篩選條件為llog2FoldChange ，且FDR lt; 0 . 0 5 。對(duì)兩品種紫花苜蓿所有差異基因分別開(kāi)展KEGG通路分析，篩選相關(guān)代謝通路。結(jié)合FPKM表達(dá)數(shù)據(jù)以及差異基因篩選數(shù)據(jù)，進(jìn)一步篩選出可能影響紫花首蓿耐寒性的關(guān)鍵基因。為了更直觀的展示基因表達(dá)量變化，本研究使用Excel繪制基因相對(duì)表達(dá)量熱圖，并將這些基因與NR數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)一步預(yù)測(cè)其功能。

1. 6 基因表達(dá)驗(yàn)證

篩選出關(guān)鍵基因后，再次利用這2個(gè)品種紫花苜蓿開(kāi)展相同的低溫處理試驗(yàn)，并分別在0h和24h時(shí)間點(diǎn)取樣，每個(gè)品種取5次生物學(xué)重復(fù)。樣品提取RNA后采用實(shí)時(shí)熒光定量法（qRT-PCR）檢測(cè)篩選基因在紫花苜蓿中的表達(dá)情況，檢測(cè)基因、內(nèi)參基因（Actin2）及其引物信息見(jiàn)表1。qRT-PCR檢測(cè)使用的試劑盒包括RNA提取試劑盒[TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，（Takara，日本）]、反轉(zhuǎn)錄試劑盒［PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime），（Takara，日本）]和熒光定量試劑盒［Green？Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus），（Takara，日本）]。

2 結(jié)果與分析

2.1低溫半致死溫度

圖1為紫花苜蓿根頸樣品 在3次取樣點(diǎn)的大小。從圖中可以看出，與0h時(shí)相比，兩品種紫花苜蓿在冷處理 后的 并無(wú)顯著性變化，但在冷處理192h后它們的 均發(fā)生顯著降低（ P lt; 0.05），即抗寒性均有顯著性提高。另外，在冷處理前期，‘肇東'與‘新疆大葉'品種間的抗寒性無(wú)顯著性差異，但在 時(shí)，‘肇東'的 顯著低于‘新疆大葉 ，即‘肇東'的抗寒性顯著高于‘新疆大葉’。

2.2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及新基因分析

本研究針對(duì) 樣點(diǎn)和 樣點(diǎn)的樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。經(jīng)過(guò)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾、測(cè)序錯(cuò)誤率檢查和GC含量分布檢查，獲得后續(xù)分析使用的cleanreads。結(jié)果顯示，12個(gè)樣本測(cè)序所得原始序列介于 之間，過(guò)濾后序列介于 p之間，錯(cuò)誤率為0 . 0 3 % ，Q30（質(zhì)量值 ？ 3 0 堿基百分比）介于

9 3 . 3 5 % ～ 9 4 . 1 6 % 之間，GC含量在 4 0 . 5 2 % ～ 41. 7 5 % 之間，測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠（表2）?！陆笕~'中共有64405個(gè)基因被注釋，其中，9109個(gè)為新基因（novel基因）；‘肇東'中共有63279個(gè)基因被注釋，其中8599個(gè)為新基因。

2.3差異基因及抗寒相關(guān)關(guān)鍵基因的篩選

根據(jù)差異基因的篩選條件，在 樣點(diǎn)和 樣點(diǎn)之間，‘新疆大葉'紫花苜蓿中共篩選到3725個(gè)差異基因，包括1581個(gè)下調(diào)基因和2144個(gè)上調(diào)基因；‘肇東'紫花苜蓿中共篩選到3040個(gè)差異基因，包括1478個(gè)上調(diào)基因和666個(gè)下調(diào)基因（圖2）。差異基因的表達(dá)情況見(jiàn)圖3。

本研究中篩選到較多試驗(yàn)處理前后差異表達(dá)的基因，這些基因可能都與紫花苜蓿的冷響應(yīng)有關(guān)。但是，為進(jìn)一步縮小研究范圍，找出與紫花苜?？购韵嚓P(guān)性最強(qiáng)的關(guān)鍵基因，根據(jù)差異基因表達(dá)量最大和表達(dá)差異倍數(shù)最大兩個(gè)原則做進(jìn)一步篩選，最終從眾多差異基因中篩選出13個(gè)重要基因作為進(jìn)一步分析和深入研究的目標(biāo)對(duì)象。其中，5個(gè)基因在‘新疆大葉'和‘肇東'中呈現(xiàn)了截然不同的表達(dá)變化趨勢(shì)；有6個(gè)基因在兩品種呈現(xiàn)了相同的表達(dá)變化趨勢(shì)。此外，本研究篩選到1個(gè)僅在‘肇東'中差異表達(dá)基因和一個(gè)僅在‘新疆大葉'中差異表達(dá)的基因（見(jiàn)圖4）?；蚬δ茏⑨尳Y(jié)果見(jiàn)表3。

注：圖（A）為‘新疆大葉'基因表達(dá)火山圖，圖（B）為‘肇東'基因表達(dá)火山圖。橫坐標(biāo)表示基因表達(dá)的差異倍數(shù)，縱坐標(biāo)表示基 因表達(dá)差異性的顯著水平。紅點(diǎn)代表上調(diào)差異表達(dá)基因，綠點(diǎn)代表下調(diào)差異表達(dá)基因，藍(lán)點(diǎn)代表非差異表達(dá)基因 Note：The Fig.（A）isthe geneexpresson volcano mapof‘Xinjiang Daye’，and theFig.（B）is the gene expresion volcano map of‘Zhaodong’.Thehorizontalcoordinateshowsthediferentmultiplesofgeneexpressionbeforeandaftertreatment，thedinate indicates thesignificantlevelofdiferenceingeneexpresionbeforeandaftertreatment.Reddotsrepresentup-regulateddifren tiall expresedgnes，greendotsrepresentdow-regulateddiferentiallyexpressedgenes，andbluedotsrepresentnondiferen tially expressed genes

2.4差異基因KEGG通路富集分析

將兩個(gè)品種紫花苜蓿中篩選到的所有差異基因分別進(jìn)行KEGG富集分析，圖5展示了其中被富集到的前20條通路。在富集到的前20條通路中，主要包括4大類，包括環(huán)境信息處理、新陳代謝、生物系統(tǒng)和細(xì)胞過(guò)程。其中，植物晝夜節(jié)律、淀粉和蔗糖代謝、代謝途徑、植物MAPK信號(hào)途徑、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、多種N-聚糖的生物合成、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解、半乳糖代謝、肌醇磷酸代謝以及次級(jí)代謝物的生物合成等11條代謝通路在兩個(gè)品種紫花苜蓿中均被顯著富集到。這些代謝通路在紫花苜?？购^(guò)程中可能均發(fā)揮著重要作用。

2.5 基因表達(dá)驗(yàn)證

為保證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本研究對(duì)這13個(gè)基因進(jìn)行了qRT-PCR基因表達(dá)量驗(yàn)證。結(jié)果表明，有7個(gè)基因符合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)：低溫脅迫時(shí)，基因nouel.12052和MS.gene065152在‘肇東'紫花苜蓿中上調(diào)，而在‘新疆大葉’中下調(diào)；基因MS.gene42333和MS.gene064674在2個(gè)品種紫花苜蓿中均下調(diào)，MS.gene008206，MS.gene41026和MS.gene40758均上調(diào)（圖6）。

3討論

3.1基因與紫花苜?？购缘年P(guān)系

3.1.1在兩品種紫花苜蓿中表達(dá)趨勢(shì)相反的5個(gè)基因在本研究中篩選到的13個(gè)基因，通過(guò)與NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，最終有9個(gè)基因被注釋到。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中在兩種紫花苜蓿中表達(dá)趨勢(shì)相反的5個(gè)基因中，在后續(xù)qRT-PCR試驗(yàn)中僅novel.12052和MS.gene065152這2個(gè)基因符合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。基因novel.12052被注釋為跨膜蛋白?？缒さ鞍讌⑴c植物的多種生理活動(dòng)，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和能量轉(zhuǎn)化[22]。一些跨膜蛋白感知并響應(yīng)各種環(huán)境脅迫，這些跨膜蛋白在遇到冷脅迫時(shí)表達(dá)上調(diào)。一些跨膜蛋白調(diào)控基因在低溫脅迫下的下調(diào)可能促進(jìn)氣孔關(guān)閉，延緩細(xì)胞脫水，從而幫助植物耐受低溫脅迫[23]?；騇S.gene065152被注釋為谷氨酰胺—tRNA合成酶（GlnRS）[24]，是氨基?；鵷RNA合成酶（ARSs）的一種，其是蛋白質(zhì)合成的必需酶，具有進(jìn)化保守的酶促機(jī)制[25]。正確的氨基酸首先被ATP激活，形成氨酰腺苷酸，然后轉(zhuǎn)移到tRNA的 端核苷酸上[26]。MS.gene065152表達(dá)量的差異，可能會(huì)導(dǎo)致可溶性蛋白合成量的差異，進(jìn)而導(dǎo)致兩品種紫花苜?？购猿霈F(xiàn)差異。

表3基因功能注釋表

qRT-PCR驗(yàn)證試驗(yàn)中，novel.19075，MS.gene061814，n0vel.211663個(gè)基因在兩個(gè)品種紫花苜蓿中表現(xiàn)出了相同的趨勢(shì)。novel.19075被注釋為含DEK結(jié)構(gòu)域的染色質(zhì)相關(guān)蛋白，DEK最初出現(xiàn)在對(duì)人類髓性白血病患者中，并以患者的首字母縮寫(xiě)命名[27]。在哺乳動(dòng)物中，DEK在體外被證明具有組蛋白伴侶活性，對(duì)異染色質(zhì)完整性很重要。此外，DEK還與DNA復(fù)制、DNA雙鏈斷裂修復(fù)、mRNA剪接和轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[28]。在最近的一項(xiàng)關(guān)于植物的研究中發(fā)現(xiàn)，DEK很可能是擬南芥逆境耐受性的調(diào)節(jié)因子，在擬南芥受到鹽脅迫時(shí)，DEK顯著下調(diào)[29]。在本研究的qRT-PCR試驗(yàn)中，兩個(gè)品種紫花苜蓿在遭受低溫脅迫時(shí)，基因novel.19075呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，與前人的研究結(jié)果一致，這表明該基因很有可能也在紫花苜?？购邪l(fā)揮重要作用。MS.gene061814被注釋為跨膜Emp24結(jié)構(gòu)域蛋白（TMED）[30]，TMED家族蛋白是分泌途徑運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，但其在植物中的功能尚未被充分研究31。在后續(xù)驗(yàn)證中，基因MS.gene061814在兩個(gè)品種紫花苜蓿中同樣呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，表明該基因也有可能在紫花苜?？购邪l(fā)揮重要作用。

植物晝夜節(jié)律Circadianrhythm-plant .淀粉和蔗糖代謝Starch and sucrose metabolism代謝途徑Metabolic pathways-丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝Alaninespatatendgutamatemetm q value植物MAPK信號(hào)途徑MAPK signaling pathway-plant 1.00磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)Phosphatidylinositol signalingsystem植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Plant hormone signal ransduction . 0.75糖酵解/糖異生Glycolysis Gluconeogenesis . 0.50多種N-聚糖的生物合成Various types ofN-glycan biosynthesis0.25Tropanepiped .Valine酸亮氨亮氨解 ： 0.00氨基酸糖和核苷酸糖代謝Aminosugar andnucleotidesugar metabolism .類黃酮的生物合成Flavonoid biosynthesis- . 數(shù)目Number半乳糖代謝Galactosemetabolism- ·. 200核苷酸糖的生物合成Biosynthesis of nucleotide sugars . . 400肌醇磷酸代謝Inositol phosphate metabolism ·600N-聚糖的生物合成N-Glycan biosynthesis- ·次級(jí)代謝物的生物合成Biosynthesis of secondary metabolites-氨基酸的生物合成Biosynthesisof amino acids ·自噬-其他 Autophagy-other ·0.04 0.06 0.08 0.10Rich factorKEGG富集統(tǒng)計(jì)分析StatisticsofKEGG enrichmient（B）植物晝夜節(jié)律Circadian rhythm-plant .植物MAPK信號(hào)途徑MAPK signaling pathway-plant植物與病原體的相互作用Plant-pathogeninteraction氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解 q valueValine，leucineandisoleucinedegradation 1.00植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Plant hormone signal transduction0.75淀粉和蔗糖代謝Starch and sucrose metabolism .代謝途徑Metabolic pathways- 0.50甘油磷脂代謝Glycerophospholipid metabolism . 0.25半乳糖代謝Galactose metabolism- .0.00肌醇磷酸代謝Inositolphosphate metabolism .·數(shù)目Number·Glycosphigolip和系 . 100甘油磷脂代謝Glycerophospholipid metabolism ·200葡萄糖苷酸的生物合成Glucosinolate biosynthesis- 300果糖和甘露糖代謝Fructoseandmannosemetabolism ·400半胱氨酸和蛋氨酸代謝Cysteine and methioninemetabolism- ·500氰基氨基酸代謝Cyanoamino acid metabolism ·類胡蘿卜素的生物合成Carotenoid biosynthesis .次級(jí)代謝物的生物合成Biosynthesis of secondary metabolites0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07Rich factor所有差異基因KEGG通路富集分析

注：圖（A）為‘新疆大葉’，圖（B）為‘肇東’?？v坐標(biāo)表示KEGG通路，橫坐標(biāo)表示富集因子（注釋到該條目下的差異基因的數(shù)量與注釋到該條目下基因總數(shù)的比值）。富集因子越大，表示富集的程度越大。點(diǎn)的大小代表該通路富集的基因的數(shù)量，數(shù)量越多點(diǎn)越大。點(diǎn)的顏色代表該通路富集的顯著性，用校正后的PH值 value）進(jìn)行評(píng)估。 q value值越接近0，顏色越紅，代表富集越顯著。圖中只展示了富集程度最顯著的20條通路

Note：TheFig.（A）is‘XinjiangDaye’，theFig.（B）rightis‘Zhaodong’.Theverticalcoordinaterepresents theKEGG path way，andthehorzontaloordinaterepresentstheRichfactor（theatiooftheumbrofdiferetialgenesanotatedtothetryto thetotalnumberofgenesannotatedtotheentry.）ThelargertheRichfactor，thegreatertheenrichment.Thesizeofthedotsrepresents thenumberof genes enrichedinthepathway，thelargerdotsthe more number.Thecolourofthedots represents the sig nificance of the pathway's enrichment，as assessed by the corrected $＼boldsymbol { ＼mathscr { P } }$ value （ q value）. q values closer to O，and reddish colours， represent more significant enrichment.Only the 2O most significantly enriched pathways are shown

3.1.2在兩品種紫花首蓿中表達(dá)趨勢(shì)相同的6個(gè)基因在兩品種紫花苜蓿表達(dá)趨勢(shì)相同的6個(gè)基因中，經(jīng)qPT-PCR驗(yàn)證后，有MS.gene008206，MS.gene41026，MS. gene40758，MS. gene42333，MS.gene0646745個(gè)基因的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。MS.gene008206注釋為冷調(diào)節(jié)蛋白（COR）。其編碼的是在低溫下表達(dá)的親水性多肽，通過(guò)形成α -螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)產(chǎn)生脫水的細(xì)胞脂膜起到穩(wěn)定作用，從而使植物獲得抗寒性[32-33]。在過(guò)去的研究中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)許多轉(zhuǎn)錄因子，如DREB1/CBF，CCA1/LHY，RVE4/RVE8，HD2C，HOS15，PWR和 C U L 4 等，它們能夠在寒冷的條件下直接或間接調(diào)控 C O R 基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物的抗寒性[10]

基因MS.gene41026在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋為O-糖基水解酶家族蛋白。在O-糖基水解酶家族蛋白中，糖基水解酶是一類廣泛存在的酶，可水解兩個(gè)或多個(gè)碳水化合物之間或碳水化合物與非碳水化合物部分之間的糖苷鍵。該家族蛋白參與許多重要的生物學(xué)過(guò)程，包括水解結(jié)構(gòu)或儲(chǔ)存多糖，防御病原體，細(xì)胞表面碳水化合物的轉(zhuǎn)換等[34]。此外，還有研究表明，高脯氨酸含量的O-糖蛋白在細(xì)胞膜系統(tǒng)中進(jìn)行組裝和修飾，在植物遭受逆境時(shí)發(fā)揮作用[35]。但到目前為止，O-糖蛋白在植物中的功能尚未被充分研究。

基因MS.gene40758被注釋為半乳糖醇合酶，它是合成棉子糖和水蘇糖的關(guān)鍵酶之一[21]?？扇苄蕴窃谧匣ㄜ俎？购邪l(fā)揮了極大的作用：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[36]、信號(hào)傳導(dǎo)[37]、滲透保護(hù)劑[38]、活性氧清除劑[39]等。目前已有眾多研究表明棉子糖合成酶步驟中的半乳糖醇合酶、棉子糖合成酶以及水蘇糖合成酶在紫花苜蓿遭受低溫脅迫時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)4，進(jìn)而影響紫花苜?？购?。

此外，MS.gene42333，MS.gene0646742個(gè)基因在兩個(gè)品種紫花苜蓿遭受低溫脅迫時(shí)表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì)并且得到驗(yàn)證。雖然本研究并未注釋到這2個(gè)基因的功能，但其仍然可能是紫花苜?？购年P(guān)鍵基因。

3.1.3在兩紫花苜蓿品種中特異表達(dá)的2個(gè)基因本研究中，在兩品種紫花苜蓿中特異表達(dá)的基因的驗(yàn)證結(jié)果均與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不符。驗(yàn)證結(jié)果表明，這2個(gè)基因在2種紫花苜蓿中均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)?；騇S.gene058382在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋為致病相關(guān)蛋白BETVI家族蛋白。BET（BromoandExtra-Terminal，溴域和外端）蛋白在人體中對(duì)正常的細(xì)胞過(guò)程至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈兛刂萍?xì)胞周期進(jìn)程、神經(jīng)發(fā)生、分化、紅細(xì)胞成熟和精子的發(fā)生等。它還與許多病理疾病有關(guān)，包括癌癥、炎癥、感染、腎臟疾病和心臟病[41]。在本研究中，基因MS.gene058382編碼BETVI家族蛋白，其為存在于花粉和植物性食物中的一大群過(guò)敏原[42]。目前為止，在植物中對(duì)該基因的研究較少。基因MS.gene29584為糖磷酸鹽/磷酸鹽易位器。糖磷酸化是碳水化合物分解代謝驅(qū)動(dòng)ATP生成和生物量積累的第一步。磷酸化本身是一種能量消耗行為[43]，當(dāng)紫花苜蓿遭受低溫時(shí)，能量消耗會(huì)隨之減少，基因MS.gene29584在2個(gè)品種紫花苜蓿中的下調(diào)也印證了這一點(diǎn)。

3.2代謝通路與紫花苜蓿抗寒性的關(guān)系

在本研究中，圖5展示了兩種紫花苜蓿中差異基因KEGG富集分析的前2O條代謝通路。其中，有11條代謝通路在兩品種紫花苜蓿中均被顯著富集。研究表明，這些代謝通路在植物抗寒過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括淀粉和蔗糖代謝[44]、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)[45]、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[46]、各種類型的N-糖的生物合成[47]、氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解[48]、半乳糖代謝[49]、肌醇磷酸鹽代謝[50]以及次級(jí)代謝物的生物合成[51]等。

在篩選到的代謝通路中，晝夜節(jié)律通過(guò)調(diào)控冷響應(yīng)基因，廣泛影響植物的低溫適應(yīng)過(guò)程。在對(duì)擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，大約三分之一的基因受晝夜節(jié)律所調(diào)控[52]。CBF是 C O R 基因下游靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄激活因子，通過(guò)對(duì) C O R 基因啟動(dòng)子區(qū)域的擴(kuò)展分析顯示，晚間元件 （ E E ） 、核心時(shí)鐘成分（CCA1）和 L H Y 識(shí)別的順式元件在植物中普遍存在。而CBF轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)態(tài)水平和其冷誘導(dǎo)由晝夜控制，許多CORs基因的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄水平也受晝夜節(jié)律所影響[53]CBF啟動(dòng)子中的 E E 元件通常與ABA響應(yīng)順式元件偶聯(lián)，而這兩個(gè)元件都是 C O R s 基因冷誘導(dǎo)所必需的，這也就說(shuō)明晝夜節(jié)律是植物冷響應(yīng)機(jī)制中不可或缺的部分[54]。另外， I C E 1 是CBF的主要調(diào)控因子，部分MPK會(huì)影響ICE1的穩(wěn)定性進(jìn)而調(diào)控植物的抗寒性。其中，MPK是MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的三種蛋白激酶之一[55]，在本研究中，植物MAPK信號(hào)途徑在兩種紫花苜蓿中均被顯著富集到。通過(guò)對(duì)這些代謝通路所涉及到的基因、蛋白、代謝物本身及上下游調(diào)控的研究，可更加深入地解析紫花苜蓿的抗寒機(jī)制，并為分子育種工作奠定基礎(chǔ)。

4結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)兩種紫花苜蓿冷處理前后轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，分別篩選到3000余個(gè)差異表達(dá)基因。通過(guò)差異基因表達(dá)量最大和表達(dá)差異倍數(shù)最大兩個(gè)原則做進(jìn)一步篩選后，最終篩選到13個(gè)與紫花首蓿抗寒冷適應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵基因。經(jīng)qPT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證，有7個(gè)基因符合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。后通過(guò)對(duì)差異基因的KEGG富集分析，篩選到11條在兩種紫花苜蓿中均被顯著富集的代謝通路。本研究所篩選出來(lái)的關(guān)鍵基因和代謝通路，將為紫花苜?？购畽C(jī)制的深入研究以及分子育種設(shè)計(jì)提供參考。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）