摘要：研究了菌株P(guān)seudochrobactrum sp. BSQ-1在土壤中降解百菌清（TPN）的效率以及對(duì)土壤中微生物群落多樣性的影響。結(jié)果表明，在21 d內(nèi)，菌株BSQ-1對(duì)TPN的降解率約為60%，并且通過(guò)MiSeq技術(shù)發(fā)現(xiàn)，施加降解菌株BSQ-1可部分恢復(fù)土壤中微生物群落的豐富度和多樣性，能緩解TPN污染對(duì)土壤微生物的威脅。

關(guān)鍵詞：百菌清；降解菌株；生物強(qiáng)化；土壤微生物群落

中圖分類號(hào)：S154.3;X53" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2025）03-0055-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.03.009 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effect of the application of chlorothalonil-degrading strains on its degradation effect and

soil microbial community structure

LIU Xiao-mei1， CAO Lu-lu2， CHEN Jian-fang1， WANG Yan-fang1， REN Ke1，

ZHANG Tao1， MEI Jian-jun1， XU Xi-hui2

（1.Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou" 014040， Inner Mongolia， China;

2.College of Life Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing" 210095， China）

Abstract： The degradation efficiency of chlorothalonil （TPN） by strain Pseudochrobactrum sp. BSQ-1 in soil and its effect on microbial community diversity in soil were studied. The results showed that the degradation rate of TPN by strain BSQ-1 was about 60% within 21 days. The application of degrading strain BSQ-1 could partially restore the richness and diversity of microbial communities in soil and alleviate the threat of TPN pollution to soil microorganisms by MiSeq technology analysis.

Key words： chlorothalonil; degrading strains; bioaugmentation; soil microbial community

百菌清（四氯間苯二甲腈，TPN）俗稱達(dá)克靈、桑瓦特等，是一種廣譜的非內(nèi)吸型保護(hù)性殺菌劑。百菌清有2個(gè)同分異構(gòu)體，即四氯鄰苯二甲腈和四氯對(duì)苯二甲腈。百菌清對(duì)鳥(niǎo)類、魚(yú)類以及水生無(wú)脊椎動(dòng)物具有很高的毒性，在生態(tài)環(huán)境中被廣泛地檢測(cè)到。百菌清及其異構(gòu)體導(dǎo)致的污染已經(jīng)引起了社會(huì)各界的關(guān)注。隨著百菌清的廣泛應(yīng)用（中國(guó)的年均使用量超過(guò)8 000 t，美國(guó)的年均使用量超過(guò)5 000 t），其進(jìn)入環(huán)境的幾率相應(yīng)增大。百菌清在自然環(huán)境中很難被降解，再加上極難溶于水，其殘留所引起的環(huán)境安全等問(wèn)題不容忽視[1]。作為一種使用范圍較廣的有機(jī)氯殺菌劑，百菌清主要被用于多種作物的真菌病害預(yù)防，例如蔬菜等作物的病害防治。近年來(lái)，百菌清在蔬菜中被越來(lái)越頻繁地檢出，其殘留問(wèn)題的解決迫在眉睫。生物修復(fù)百菌清及其同分異構(gòu)體污染的環(huán)境是簡(jiǎn)便、可靠、有效并且無(wú)二次污染的修復(fù)方法。因此，獲得高效降解百菌清的微生物菌株資源并研究其在微生物修復(fù)中的生態(tài)學(xué)效應(yīng)具有重要的理論意義以及應(yīng)用價(jià)值。利用降解菌株或其降解酶修復(fù)百菌清及其異構(gòu)體所造成的環(huán)境污染問(wèn)題是非常有前景的方法。細(xì)菌因其強(qiáng)大的降解有機(jī)以及無(wú)機(jī)污染物的能力，在生物降解中扮演重要角色[2]，已經(jīng)陸續(xù)分離出了多株具有百菌清降解能力的細(xì)菌菌株[3，4]。百菌清的代謝途徑主要包括4種，水解脫鹵、還原脫氯、甲硫基或甲氧基取代氯原子的取代反應(yīng)以及腈基的氧化或者水解作用[5]。

然而，通過(guò)添加外源菌株降解農(nóng)藥受多種因素的影響，如農(nóng)藥類型、外源降解菌株的特征以及環(huán)境條件等[6，7]，同時(shí)土壤中的微生物群落（土著微生物）、降解菌株與農(nóng)藥之間充滿了復(fù)雜而又有序的互動(dòng)。研究表明，化學(xué)農(nóng)藥的應(yīng)用已經(jīng)對(duì)土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響[8，9]。接種的菌株通常會(huì)與土著微生物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，這可能導(dǎo)致所接種菌株的生存能力和適應(yīng)能力變差[10]。但是，接種菌株在降解農(nóng)藥的同時(shí)能夠緩解農(nóng)藥對(duì)土著微生物群落的選擇性壓力[11]。某些農(nóng)藥可以為接種菌株提供碳源或者氮源，所以這些農(nóng)藥反而能夠幫助接種菌株在土壤中生存繁殖。此外，微生物群落之間復(fù)雜的相互作用也能影響菌株對(duì)農(nóng)藥的降解速率以及最終的降解產(chǎn)物[12，13]。所以，了解接種菌株以及農(nóng)藥對(duì)土著微生物的影響將有助于降解菌株的選擇同時(shí)提高其降解速率，因?yàn)樯镄迯?fù)的成功與否主要取決于接種菌株對(duì)環(huán)境的生存以及適應(yīng)能力[10]。因此，本試驗(yàn)研究了百菌清降解菌Pseudochrobactrum sp. BSQ-1對(duì)污染土壤中百菌清的降解能力以及對(duì)土壤中微生物群落的影響，以期為百菌清污染土壤的生物修復(fù)提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為百菌清高效降解菌Pseudochrobactrum sp. BSQ-1。供試土壤采自內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市井坪公園表層5～10 cm土壤。供試農(nóng)藥為百菌清原藥（CTN）（純度為98.5%），由江陰蘇利精細(xì)化工有限公司饋贈(zèng)，使用濃度50 mg/kg。供試試劑二氯甲烷（分析純）、丙酮（色譜純）等購(gòu)自上海化學(xué)試劑有限公司，乙腈（色譜純）等由德國(guó)的Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

土壤中分別噴灑50 mg/kg百菌清，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笾糜趯?shí)驗(yàn)室中待土壤中的甲醇揮發(fā)。12 h后，處理組中按照108 CFU/g干土的接種量分別接入剛培養(yǎng)好的含有菌株BSQ-1生理鹽水的菌懸液，陰性對(duì)照中加入等體積的無(wú)菌生理鹽水并且充分拌勻，分裝入花盆（上口直徑為22 cm，底面直徑為15 cm，高度為16 cm）中，同時(shí)添加沒(méi)有百菌清和BSQ-1菌劑的空白對(duì)照，每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，調(diào)節(jié)土壤中的含水量到20%左右。將花盆全部放置在模擬自然環(huán)境光照時(shí)間的20 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，光照時(shí)間設(shè)為12 h/d。采用稱重的方法補(bǔ)水使土壤中的含水量基本保持不變。連續(xù)培養(yǎng)21 d，每7 d取1次土樣。

CK表示沒(méi)有經(jīng)任何處理的空白土樣，樣品編號(hào)SL代表只添加50 mg/kg百菌清的土壤處理，樣品編號(hào)BSQ代表只添加菌株BSQ-1的土壤處理，樣品編號(hào)SLBSQ代表同時(shí)添加50 mg/kg百菌清和菌株BSQ-1的土壤處理；樣品中編號(hào)最后一個(gè)數(shù)字表示取樣時(shí)間，1代表7 d時(shí)所取土樣，2代表14 d時(shí)所取土樣，3代表21 d時(shí)所取土樣。例如，SLBSQ1、SLBSQ2與SLBSQ3表示7、14、21 d時(shí)添加50 mg/kg百菌清與菌株BSQ-1的土壤樣品。待測(cè)樣品編號(hào)與對(duì)應(yīng)取樣時(shí)間如表1所示。

1.3 菌株的培養(yǎng)及菌懸液的制備

將菌株BSQ-1分別劃線接種于含50 mg/kg百菌清的固體培養(yǎng)基上；挑取單菌落接種于裝有3 mL的LB液體培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜；將上述活化的菌液按1%的接種量接種于裝有100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)至菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；6 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用生理鹽水洗滌2遍并重懸，測(cè)定并調(diào)整菌懸液的濃度，使其在600 nm處的吸光度（OD600 nm）為1.0，均勻噴灑于試驗(yàn)土壤中。

1.4 土壤中百菌清濃度的檢測(cè)

采用五點(diǎn)取樣法，取10 g土壤樣品，添加20 mL丙酮與二氯甲烷的混合液（體積比 1︰1）160 r/min，30 ℃搖床振蕩5 h，取下層有機(jī)相，重復(fù)上述步驟2次，合并提取的有機(jī)相后，置于通風(fēng)櫥中揮發(fā)，用2 mL的乙腈（色譜純）定容，有機(jī)濾膜過(guò)濾（0.22 μm）后采用HPLC檢測(cè)樣品中的百菌清含量。該方法對(duì)土壤中百菌清的提取回收率高達(dá)92.5%±0.9%，可有效提取土壤中的百菌清。

1.5 Myseq-PE250測(cè)序

測(cè)序服務(wù)由上海派森諾生物科技股份有限公司提供。測(cè)序策略：Miseq-PE250。上游引物序列（338F）：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游引物序列（806R）：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中百菌清的降解效果

如圖1所示，在含有50 mg/kg百菌清的土壤中，菌株BSQ-1能在21 d內(nèi)將百菌清降解到20 mg/kg左右，降解率約為60%，明顯低于Xu等[14]研究中菌株BSQ-1在土壤中對(duì)TPN的降解率，主要原因在于南北方土壤以及氣候的差異影響了菌株BSQ-1的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響其對(duì)TPN的降解。圖1的結(jié)果說(shuō)明，菌株BSQ-1可以作為北方地區(qū)TPN污染土壤原位修復(fù)的應(yīng)用菌株。

2.2 微生物群落豐度與多樣性

通過(guò)MiSeq-PE250測(cè)序，共得到384 778條OTUs，各樣本文庫(kù)的覆蓋度（Coverage）都在0.985 0以上（表2），表明測(cè)序結(jié)果可以反映土壤中微生物群落的真實(shí)情況。由Chao1豐度指數(shù)可知，CK0的微生物豐度最高，其余各樣品的Chao1豐度指數(shù)為1 144～1 487，相對(duì)變化較小，表明TPN與菌株BSQ-1的加入對(duì)微生物群落的多樣性影響較低。與CK相比，只加TPN的樣品（SL1、SL2、SL3）Shannon多樣性指數(shù)的降幅較大，說(shuō)明TPN的加入在一定程度上影響了土壤中微生物的多樣性，混合施加TPN和菌株BSQ-1的樣品的Shannon多樣性指數(shù)有所提高，表明菌株BSQ-1的加入緩解了TPN對(duì)土壤中微生物群落的威脅。其余各組樣品Shannon多樣性指數(shù)的變化幅度較小，說(shuō)明各組樣品之間的微生物多樣性差異較小。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

土壤樣品中不同門(mén)水平的相對(duì)豐度如圖2所示，相對(duì)豐度從高到低依次為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、 放線菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、專利菌門(mén)（Patescibacteria）、粘球菌門(mén)（Myxococcota）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）?？傮w上，放線菌門(mén)是土壤樣品初期（0 d）的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其相對(duì)豐度在50%以上，變形菌門(mén)是BSQ、SLBSQ各土壤樣品的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，相對(duì)豐度均在30%以上，其中同時(shí)添加百菌清與菌株BSQ-1的土壤樣品（SLBSQ）中變形菌門(mén)的相對(duì)豐度都在70%以上。

在屬水平上，土壤樣品中不同屬水平的相對(duì)豐度如圖3所示，相對(duì)豐度從高到低依次為偽蒼白桿菌屬（Pseudochrobactrum）、偽關(guān)節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、馬賽菌屬（Massilia）、甲藻菌屬（Methylotenera）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、諾維草螺菌屬（Noviherbaspirillum）、馬闊里類芽孢桿菌屬（Paenisporosarcina）、芽生球菌屬（Blastococcus）。偽關(guān)節(jié)桿菌屬是空白對(duì)照（CK）土壤樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬；在添加菌株BSQ-1（BSQ）、混合施加百菌清和菌株BSQ-1（SLBSQ）的土壤樣品中，優(yōu)勢(shì)菌屬是偽蒼白桿菌屬，說(shuō)明菌株BSQ-1成功定植，并具有較強(qiáng)的生存能力。

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

主坐標(biāo)分析（PCoA）如圖4所示，施加降解菌株與不施加降解菌株在PC1相距較遠(yuǎn)，表明施加降解菌株的處理（BSQ）與空白對(duì)照（CK）以及施加百菌清的處理（SL）的微生物群落組成差異較大。施加降解菌株（BSQ）與同時(shí)施加降解菌株及TPN的處理（SLBSQ）沒(méi)有顯著差異，空白對(duì)照（CK）與施加百菌清（SL）的處理沒(méi)有顯著差異。聚類分析結(jié)果與主坐標(biāo)分析結(jié)果一致。

3 討論

本試驗(yàn)研究了菌株BSQ-1對(duì)土壤中TPN的降解效果及其對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。菌株BSQ-1通過(guò)水解脫鹵途徑以羥基取代TPN的4號(hào)位氯原子（4-OH-TPN）。盡管只有一個(gè)氯原子被取代，但代謝物4-OH-TPN比TPN的毒性更小，并且4-OH-TPN的水溶性明顯提高[3]，更容易從土壤中去除。

接種菌株處理（BSQ、SLBSQ）中偽蒼白桿菌屬的相對(duì)豐度較高，這表明菌株BSQ-1在與土著微生物競(jìng)爭(zhēng)時(shí)具有較強(qiáng)的生存能力。無(wú)論是外源添加降解菌株或外源污染物都會(huì)降低樣品的微生物群落多樣性，但是施加降解菌株BSQ-1可部分恢復(fù)土壤中微生物群落的豐富度和多樣性，表明菌株BSQ-1能夠緩解TPN污染對(duì)土壤微生物的威脅。同時(shí)，混合施加TPN和菌株BSQ-1（SLBSQ）的土壤樣品的多樣性指數(shù)有所提高，同時(shí)其屬水平的物種豐富度逐步轉(zhuǎn)變?yōu)閭紊n白桿菌屬，說(shuō)明菌株BSQ-1的施加即生物強(qiáng)化的過(guò)程，可馴化土壤中的微生物群落向提高降解TPN速率的方向演變。一些研究也表明，降解菌株的添加可以顯著改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[13，15]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)菌株BSQ-1降解百菌清的研究結(jié)果與Xu等[14]對(duì)菌株BSQ-1的研究結(jié)果稍有差異，究其主要原因在于土壤的理化性質(zhì)以及地理環(huán)境的不同，這表明相較于南方地區(qū)（南京市），菌株BSQ-1在北方地區(qū)（內(nèi)蒙古自治區(qū)）土壤中的競(jìng)爭(zhēng)力及生存力更強(qiáng)，較適合應(yīng)用于去除北方地區(qū)土壤中的TPN。這說(shuō)明除了接種物和農(nóng)藥的特征外，土壤性質(zhì)也會(huì)影響微生物的降解過(guò)程，如土壤中的有機(jī)質(zhì)含量和pH[4]等。

參考文獻(xiàn)：

[1] 乙小娟， 朱加葉.高效液相色譜法快速測(cè)定大米中的4種煙堿農(nóng)藥殘留量[J].食品科學(xué)， 2011， 32 （6）： 233-235.

[2] WANG G L， LIANG B， LI F， et al. Recent advances in the biodegradation of chlorothalonil[J]. Current microbiology， 2011， 63： 450-457.

[3] LIANG B， WANG G L， ZHAO Y， et al. Facilitation of bacterial adaptation to chlorothalonil-contaminated sites by horizontal transfer of the chlorothalonil hydrolytic dehalogenase gene[J]. Applied environmental microbiology， 2011， 77（12）： 4268-4272.

[4] SINGH B K， WALKER A， WRIGHT D J. Bioremedial potential of fenamiphos and chlorpyrifos degrading isolates： In?uence of dierent environmental conditions[J]. Soil biology and biochemistry， 2006， 38（9）： 2682-2693.

[5] LIANG B， JIANG J， ZHANG J， et al. Horizontal transfer of dehalogenase genes involved in the catalysis of chlorinated compounds： Evidence and ecological role[J]. Critical reviews microbiology， 2012， 38： 95-110.

[6] THOMPSON I P， VAN DER GAST C J， CIRIC L， et al. Bioaugmentation for bior-emediation：The challenge of strain selection[J]. Environmental microbiology， 2005， 7（7）： 909-915.

[7] TYAGI M， DA FONSECA M M R， DE CARVALHO C C C R. Bioaugmentation and biostimulation strategies to improve the effectiveness of bioremediation processes[J]. Biodegradation，2011，22（2）： 231-241.

[8] ?AWNICZAK ?， SYGUDA A， BORKOWSKI A， et al. In?uence of oligomeric herbicidal ionic liquids with MCPA and dicamba anions on the community structure of autochthonic bacteria present in agricultural soil[J]. Science of the total environment， 2016， 563-564： 247-255.

[9] HSIAO Y L， HO W H， YEN J H. Vertical distribution in soil column and dissipation in soil of benzoylurea insecticides diflubenzuron， ?ufenoxuron and novaluron and effect on the bacterial community[J]. Chemosphere， 2013， 90（2）：380-386.

[10] SZULC A， AMBROZEWICZ D， SYDOW M， et al. The in?uence of bioaugmentation and biosurfactant addition on bioremediation effciency of diesel-oil contaminated soil： Feasibility during field studies[J].Journal of environmental management，2014，132： 121-128.

[11] REN X， LI H， CHEN S. Cloning of the chlorothalonil-degrading gene cluster and evidence of its horizontal transfer[J]. Current microbiology， 2011， 62（3）： 1068-1073.

[12] ?NNEBY K， JONSSON A， STENSTR?M J. A new concept for reduction of diffuse contamination by simultaneous application of pesticide and pesticide-degrading microorganisms[J]. Biodegradation， 2010， 21（1）： 21-29.

[13] KATO S， HARUTA S， CUI Z J， et al. Stable coexistence of five bacterial strains as a cellulose-degrading community[J]. Applied and environmental microbiology， 2005， 71（11）： 7099-7106.

[14] XU X H， LIU X M， ZHANG L， et al. Bioaugmentation of chlorothalonil-contaminated soil with hydrolytically or reductively dehalogenating strain and its effect on soil microbial community[J]. Journal of hazardous materials， 2018， 351： 240-249.

[15] FESTA S， COPPOTELLI B M， MORELLI I S. Comparative bioaugmentation with a consortium and a single strain in a phenanthrene-contaminated soil： Impact on the bacterial community and biodegradation[J]. Applied soil ecology， 2016， 98： 8-19.