摘要：根結(jié)線蟲病作為世界范圍內(nèi)危害植物最為廣泛的土傳病害之一，給農(nóng)作物生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。番茄作為新疆紅色支柱產(chǎn)業(yè)，其設(shè)施生產(chǎn)飽受線蟲病的侵害。目前，生產(chǎn)上對根結(jié)線蟲病的防治多以化學(xué)防治為主，但藥劑的頻繁使用給生態(tài)環(huán)境帶來了巨大壓力。近年來，生物防治的綠色可持續(xù)優(yōu)勢逐漸擴大，但生防資源少、田間防治效果差異大等缺陷也掣肘了其應(yīng)用。優(yōu)質(zhì)基因資源的挖掘與利用，仍是從根本上解決番茄抗病的最佳策略。本文首先介紹番茄Mi基因家族中已發(fā)掘的10個成員在分子層面的研究進展，闡釋番茄抗根結(jié)線蟲病的現(xiàn)有分子機理；Mi基因可使用的抗源單一、抗病范圍有限及土壤溫度等條件的制衡，阻礙了優(yōu)質(zhì)番茄種質(zhì)的抗性改良，更多非R基因的挖掘變得尤為重要。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在作物生物脅迫調(diào)控方面扮演重要角色，本文綜述近年來WRKY在作物防衛(wèi)根結(jié)線蟲病方面的研究應(yīng)用，以期為后續(xù)番茄從不同層面并避免完全依賴Mi基因的抗病育種提供新思路。

關(guān)鍵詞：番茄；Mi基因；根結(jié)線蟲；WRKY轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號：S436.412.1+9" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0016-07

收稿日期：2024-04-08

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號：32302652）；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號：2022D01B95）。

作者簡介：陳銀霞（1996—），女，河南淮陽人，碩士研究生，研究方向為番茄分子遺傳育種。E-mail：cyx61222@163.com。

通信作者：杜 崇，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事番茄分子遺傳育種研究。E-mail：godv2018@163.com。

根結(jié)線蟲（root-knot nematodes，RKN）是一種專性植物寄生線蟲。1855年，自Berkeley首次發(fā)現(xiàn)以來，世界各地有關(guān)根結(jié)線蟲病報道逐年增多，其中危害嚴重、分布較廣的有南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）、爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）、花生根結(jié)線蟲（M. arenaria）、北方根結(jié)線蟲（M. hapla）。根結(jié)線蟲體型小而透明，幼蟲通常為細長的蠕蟲形態(tài)，成蟲雌雄異體，雌蟲呈梨形狀，雄蟲呈線狀。雌蟲卵囊表面粗糙不平，通常呈棕褐色［1］。

RKN的寄主范圍廣泛，涉及114科3 000多種植物；研究發(fā)現(xiàn)，蔬菜中的茄科、葫蘆科、十字花科等植物受害較為嚴重［2］。RKN每年造成世界農(nóng)作物平均減產(chǎn)24.5%，經(jīng)濟損失超過1 000億美元，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了不小的沖擊［3］。番茄（Solanum lycopersicum L.）是對RKN最為敏感的作物之一，在我國新疆，特別是在伊犁哈薩克自治州、吐魯番市、烏魯木齊市、巴音郭楞蒙古自治州、阿克蘇地區(qū)的設(shè)施番茄生產(chǎn)上，RKN均普遍發(fā)生。番茄受侵染后，植株呈現(xiàn)矮小、發(fā)育不良的現(xiàn)象，果實品質(zhì)大幅下降，一般造成減產(chǎn)30%～50%，嚴重時可達80%，甚至絕收［4-5］。

目前，化學(xué)防治仍是應(yīng)對RKN的主要手段，但隨著毒性增大、生態(tài)環(huán)境嚴重污染、線蟲抗藥性產(chǎn)生等問題［6］凸顯，一些高毒性的殺線蟲劑已被嚴禁使用。生物防治具有綠色環(huán)保且可持續(xù)等優(yōu)點，逐漸成為作物病害防治的首選方法，但也存在可用生防資源少、田間防治效果參差不齊等缺點［7］。因此，通過尋找優(yōu)質(zhì)抗?。≧）基因和非典型R基因進行抗性改良，仍是從根本上解決作物抵御線蟲入侵的最佳策略。

1 番茄抗根結(jié)線蟲病Mi基因家族成員

Mi基因家族是番茄中抗RKN的主效基因家族，該家族中，一個名為Meloidogyne incognita-1（Mi-1）的顯性基因，定位于6號染色體上，于1941年被首先發(fā)現(xiàn)。Mi-1基因可誘導(dǎo)番茄對3個有絲分裂孤雌生殖群體（M. incognita、M. arenaria、M. javanica）產(chǎn)生較強的抗性，同時具有溫敏性，即土壤溫度高于28 ℃時，Mi-1失去抗性。目前，Mi-1基因是唯一用于商業(yè)育種的R資源，其提供的抗性最早在番茄發(fā)芽2周后便被誘導(dǎo)，并在番茄植株的葉、根中大量表達［8］。研究表明，野生番茄具有能夠在線蟲抗性位點處發(fā)生變異的遺傳系統(tǒng)，從而產(chǎn)生新的抗性指標。在后續(xù)探索過程中，以Mi-1為首的其他Mi家族成員也相繼被發(fā)掘與鑒定。在鑒定出的10個抗源中，有7個（Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-9、Mi-HT）基因表現(xiàn)出熱穩(wěn)定的抗性，即土壤溫度達到32 ℃，植株抗性仍存在［9］，其余3個熱穩(wěn)定R基因均未被定位（表1）。

2 番茄抗根結(jié)線蟲病的分子機制

植物與病原體之間的相互作用被概括為zigzag模型，這種先天免疫系統(tǒng)，可以識別病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），從而觸發(fā)第1道免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）［11］，但部分病原體可積極抑制PTI，將病原效應(yīng)因子釋放到宿主植物中，而植物體內(nèi)特異性抗病蛋白（R）通過響應(yīng)此類效應(yīng)子，觸發(fā)第2道防線——效應(yīng)子觸發(fā)免疫（effector-triggered immunity，ETI）［12］。在ETI中，抗體-病原相互作用有直接和間接2種模式（圖1）。直接方式取決于基因?qū)颍╣ene-for-gene）假說，在該模式下，番茄中相應(yīng)受體蛋白與線蟲效應(yīng)子直接相互作用［13］。

根據(jù)Bakker等的理論，番茄抗性的遺傳與RKN致病能力均由成對的匹配基因所控制［14］。Mi基因可特異性地識別來自RKN中Avr基因編碼的效應(yīng)因子，這類防御的表征之一是局部程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD），最終導(dǎo)致超敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR）［15］。線蟲進入番茄根部后，其Avr基因產(chǎn)生的效應(yīng)物以不親和互作的方式觸發(fā)Mi基因的表達，因此沒有形成侵蝕位點，從而阻礙巨型細胞的進一步形成［16］。

另一種間接方式稱為保護假說，該理論機制是由病原體效應(yīng)物觸發(fā)植物的毒力因子/蛋白，最終誘發(fā)R基因表達［17-18］。在這種情況下，線蟲Avr基因與番茄輔助蛋白相互作用，導(dǎo)致該蛋白發(fā)生修飾，從而被NB-LRR（nucleotide binding-leucine rich repeat）型蛋白所識別。在RKN侵染時，例如AvrB和AvrRpm1可磷酸化RIN4，AvrRpt2則通過自身的半胱氨酸蛋白酶活性降解RIN4，而作為樞紐的RIN4是多種毒力效應(yīng)因子的靶向，其磷酸化和降解可活化R蛋白活化RPM1和RPS2來介導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)［19-20］。這種間接相互作用的最終結(jié)果同樣是通過抑制進食部位的形成來防止線蟲侵入［21］。

3 Mi基因家族成員研究進展與利用

Mi-1基因首先在野生秘魯番茄中被發(fā)現(xiàn)，隨后被引入到栽培番茄中，該基因?qū)?種典型的RKN均具有抗性［22］。到目前為止， Mi-1是番茄商業(yè)育

種中唯一的抗性來源，但存在溫敏性。Mi-1及其同源物分為2個簇，分別包括3、4個拷貝，間隔大概300 kb。1998年，在Mi位點發(fā)現(xiàn)了3個基因：Mi-1.1、Mi-1.2、Mi-1.3，但只有Mi-1.2基因具有對RKN的抗性。Mi-1.2基因全長3 774 bp，編碼1 257個氨基酸，它的3個外顯子中有2個可以進行翻譯，屬于典型的NBS-LRR基因，在NBS結(jié)構(gòu)域之前包含1個CC結(jié)構(gòu)域［23］。Mi-1位于6號染色體短臂上。在諸多茄科植物中，6號染色體上該區(qū)域是R基因的重要分布區(qū)［24］。

Mi-2基因是顯性基因，在30～32 ℃土壤溫度下秘魯番茄PI 270435和PI 126433品種中不僅表現(xiàn)出對南方根結(jié)線蟲的熱穩(wěn)定抗性同時對北方根結(jié)線蟲也具有抗性，目前為止，該基因仍未被定位［25］。Mi-4基因的研究相對較少，該基因同樣未被定位，秘魯番茄LA1708在32 ℃土壤溫度條件下，對花生根結(jié)線蟲表現(xiàn)出抗性，這可能是由Mi-4行使功能所引起的［8］。Mi-5作為熱穩(wěn)定R位于12號染色體端粒區(qū)，與Mi-3連鎖在一起表達。Mi-5、Mi-3均存在于1MH-clone PI126443中（表1），研究表明，在大多數(shù)涉及弱連鎖的條件下，這2個耐熱基因可能作為單個位點起作用［26］。Mi-6作為熱穩(wěn)定基因?qū)KN表現(xiàn)出較好的抗性，在3MH-clone PI270435中被發(fā)現(xiàn)，與Mi-7之間存在弱連鎖關(guān)系，而Mi-7介導(dǎo)植株的抗性卻不表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性［27］。Mi-8是2R2-clone PI270435中的顯性基因，和Mi-2存在弱連鎖關(guān)系，但與Mi-7一樣，為非熱穩(wěn)定抗源，可介導(dǎo)番茄植株在常溫下表現(xiàn)出對南方根結(jié)線蟲的抗性［28］。

Mi-3、Mi-9是現(xiàn)在研究相對較多的抗病R基因。Mi-3基因的遺傳特性為單基因顯性遺傳，可在32 ℃土壤溫度條件下賦予對線蟲的抗性。隨后發(fā)現(xiàn)，盡管其純合子和雜合子均顯示出較強的抗性，但純合子的抗性要比雜合子更強。Yaghoobi等將Mi-3定位到番茄12號染色體短臂的端粒區(qū)域，并在Mi-3側(cè)翼標記TG180、NR18之間發(fā)現(xiàn)1個600 kb的重疊群，其遺傳距離約為7.2 cM；在Mi-3已定位到的12號染色體的區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在其他茄科植物上還分配了重要的R基因，包括馬鈴薯中針對胞囊線蟲的R基因、辣椒中針對RKN的R基因Me3、Me4，以及抗黃瓜花葉病毒（CMV）的R基因。然而，很少有常用標記在12號染色體上定位R基因，并且尚無更多信息可確認Mi-3是否與這些R基因等位［29］。與Mi-3一樣，Mi-9為單基因顯性遺傳，在常溫條件下對南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和茄生根結(jié)線蟲3種常見的RKN都有較強的抗性。先前的研究表明，Mi-9不能有效抵抗可突破Mi-1基因抗性的重要RKN生理種。就RKN特異性而言，Mi-9與Mi-1的表達具有相同的作用與模式，但是表型鑒定的唯一區(qū)別是在土壤高溫下的穩(wěn)定抗性；Mi-9基因在土壤溫度32 ℃以上仍具有抗性。RNA沉默試驗證實Mi-9是Mi-1的同源基因，Mi-9位于2個標記（C32.1、C8B）之間的6號染色體的短臂上［30］。最新研究結(jié)果表示，通過納米孔（nanopore）長讀長、Illumina短讀長、Hi-C 測序，對野生番茄LA2157進行染色體水平的基因組組裝，結(jié)合文獻報道的Mi-9分子標記REX-1、C8B，將7個候選基因定位在12.96 Mb的范圍內(nèi)，而 NBS-LRR 基因主要分布在706 kb的區(qū)域內(nèi)，最終通過RNAi挖掘到了Mi-9基因［31］。

Mi-HT被認為是在番茄源ZN17中發(fā)現(xiàn)的1個新R基因，被定位在6號染色體短臂上，與Mi-1、Mi-9連鎖，具有較好的熱穩(wěn)定抗性［32］。

4 WRKY轉(zhuǎn)錄因子

WRKY轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）是一類DNA結(jié)合蛋白，作為TFs中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，N端有一段由60個氨基酸組成的高度保守結(jié)構(gòu)域［33］。該結(jié)構(gòu)域包含1～2個WRKYGQK七肽序列，C端包含C2H2（CX4-5CX22-23HXH）或C2HC（CX7CX23HXC）型鋅指結(jié)構(gòu)［34-35］。WRKY通常分為三大類：第Ⅰ類含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域和1個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)［36］；第Ⅱ類只含1個WRKY結(jié)構(gòu)域和1個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，根據(jù)氨基酸序列特點，Ⅱ類WRKY蛋白又可分為a～e這5個亞類；第Ⅲ類也只含1個WRKY結(jié)構(gòu)域，但鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型［37］。大多數(shù)WRKY屬于第Ⅱ類，第Ⅲ類較多存在于高等植物中，為了反映WRKY的系統(tǒng)演化，也有將WRKY TF分為Ⅰ、Ⅱa+Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd+Ⅱe和Ⅲ［38］。此外，WRKY TF中富含絲/蘇氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸等，還含有TIR-NBS-LRR、激酶結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈等其他組分［39］。

WRKY的N末端含有保守的七肽序列WRKYGQK，導(dǎo)致WRKY可特異性結(jié)合啟動子區(qū)域內(nèi)W-box元件參與復(fù)雜的生物學(xué)途徑［40］。基于此特征，WRKY可被MAPK級聯(lián)激活信號磷酸化修飾來調(diào)節(jié)PTI、ETI進程；同時，許多WRKY蛋白是SA-/JA-介導(dǎo)植物防御途徑中的共同組成部分，包括激活水楊酸（salicylic acid，SA）介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance，ISR）等［41］；除此之外，WRKY還可以通過影響效應(yīng)蛋白形成復(fù)合體或直接調(diào)控R基因的表達，來改變植物的抗病能力［42］。

5 WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物抗RKN的研究進展

近年來，諸多WKRY蛋白在不同植物抗RKN過程中被相繼篩選與鑒定。前期利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測序聯(lián)合分析接種南方根結(jié)線蟲的豌豆材料發(fā)現(xiàn)，防衛(wèi)網(wǎng)絡(luò)的核心集中在NBS-LRR、WRKY基因之間的相互作用，來激活R基因表達，產(chǎn)生蛋白酶抑制劑并維持細胞骨架，從而阻止巨細胞的形成［43］。香蕉基因組共鑒定出153個WRKY基因，通過測序和接種試驗發(fā)現(xiàn)，WRKY52、-69、-92對RKN入侵表現(xiàn)出特異性表達［44-45］。通過對272份野生稻進行RKN抗性鑒定，基于Affymetrix芯片分型SNP進行全基因組關(guān)聯(lián)研究，在鑒定出的40份抗性種質(zhì)中，共篩出7個含有WRKY基因的QTL位點，接種試驗發(fā)現(xiàn)這些基因被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達［46］。利用RT-PCR對黃瓜材料9930侵染RKN的根系中分離到24個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，通過qPCR發(fā)現(xiàn)8個WRKY基因上調(diào)表達，2個WRKY下調(diào)表達［47］。野生番茄材料F5利用RNA-Seq技術(shù)分析，南方根結(jié)線蟲侵染過程中15個WRKY家族差異表達明顯［48］。通過對秘魯番茄材料LA3858設(shè)置土壤溫度（25、34 ℃）形成抗感態(tài)進行RNA-Seq，共76個WRKY基因被篩選，鑒定出6個目標WRKY在接種南方根結(jié)線蟲的植株根部高差異表達，并且積極響應(yīng)并參與SA、JA、ROS信號的調(diào)節(jié)來介導(dǎo)抗病進程［49-50］。這些成果為后續(xù)功能研究及分子標記輔助育種提供了重要依據(jù)。

在具體功能鑒定方面，Warmerdam等在擬南芥中，通過T-DNA插入獲得WRKY19基因的突變體wrky19-1，在該突變體中，DSC1基因表達量嚴格下調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，dsc1-1突變體增強了對于 M. incognita 的敏感性，因此，WRKY19很可能正向調(diào)控DSC1的表達來改變植株的抗性［51］。CaWRKY30、CaWRKY6基因受非毒性M. incognita的誘導(dǎo)而上調(diào)表達；CaWRKY6基因的沉默降低了辣椒對根結(jié)線蟲的抗性，轉(zhuǎn)基因超表達CaWRKY30基因的番茄植株對南方根結(jié)線蟲入侵的敏感性增大，植株的抗性降低［52］。Zhang等在茄子中，通過對抗性品種TG1轉(zhuǎn)錄圖譜進行篩選，共9個WRKY基因差異表達，qPCR驗證發(fā)現(xiàn)WKRY75很可能參與TG1植株防衛(wèi)RKN的入侵［53］。辣椒CM-334對于RKN表現(xiàn)出較強抗性水平，這緣于WRKY1、WRKY-a的高量表達，易感品種超表達上述基因，伴隨根系過氧化氫酶（CAT）活性增強，綠原酸含量升高，從而導(dǎo)致植株對RKN的敏感性減弱［54］。在番茄中，WRKY72型轉(zhuǎn)錄因子SlWRKY72、SlWRKY73、SlWRKY74均積極調(diào)控著 Mi-1 介導(dǎo)的對RKN和馬鈴薯蚜蟲的ETI過程［55］。Chinnnapanndi等研究發(fā)現(xiàn)，SlWRKY45的超表達下調(diào)了JA、SA信號途徑中標記基因（PR-1、Pin2）的表達［56］。Huang等進一步研究發(fā)現(xiàn)，SlWRKY45可特異性結(jié)合JA合成基因SlAOC的啟動子，抑制其表達，從而增強植株對根結(jié)線蟲的易感性［57］。Chinnnapanndi等發(fā)現(xiàn)，SlWRKY3、SlWRKY35在RKN感染后5 d內(nèi)的番茄根部攝食處被顯著誘導(dǎo)，其中SlWRKY3在SA信號中積極響應(yīng)，超表達和敲除SlWRKY3表明其正向調(diào)控番茄對M. javanica的抗性［58］。Nie等根據(jù) RNA-Seq 對 Mi-3 番茄材料篩選出了目標WRKY，根據(jù)組織特異性表達、根部表達模式鑒定及病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）初步功能驗證，挖掘到SlWRKY80在番茄防衛(wèi)RKN的入侵過程中可作為正調(diào)控因子參與抗病調(diào)控［59］。

6 研究問題與展望

Mi基因家族作為番茄防衛(wèi)RKN的主效R基因，其使用存在一定的局限性。首先，Mi基因不是對所有類型的RKN都起抗性作用。例如，象耳豆根結(jié)線蟲（M. enterolobii）、M. hapla，尤其是 M. enterolobii，它的致病性強，經(jīng)常突破番茄Mi-1基因和辣椒Me3、Me4基因介導(dǎo)的抗性［60］。除此之外，美國弗羅里達州首次發(fā)現(xiàn)的瑪雅古根結(jié)線蟲（sM. mayaguensis）同樣可以讓Mi番茄植株產(chǎn)生致病態(tài)［61］。大多數(shù)線蟲物種中，孤雌生殖為其主要繁殖方式，盡管孤雌繁殖會影響RKN物種數(shù)量，但物種內(nèi)部和物種之間針對的宿主范圍以及RKN本身的毒力存在顯著的波動性，這就導(dǎo)致在不同外界因素干擾下，盡管抗性番茄（Mi）也會被RKN所感染［62］。溫度不但影響Mi的抗性，同時也影響RKN的侵染活力，前期研究表明，土壤溫度在不超過 27 ℃ 時，RKN保持高效的入侵能力，而Mi-1基因在28 ℃土壤溫度條件下，抗性大幅減弱，導(dǎo)致植株的敏感性驟增呈感病態(tài)。Mi基因家族中，雖然大部分成員表現(xiàn)為熱穩(wěn)定抗性，但是現(xiàn)在唯一能利用商業(yè)育種的Mi-1卻呈現(xiàn)非熱穩(wěn)定性，掣肘了其高效的利用［63-64］。

番茄抗RKN的入侵仍然依賴于Mi基因，可利用抗源單一，其有效性也面臨著線蟲種類、毒力及外界因素等多重影響的挑戰(zhàn)，因此，挖掘其他有價值基因?qū)τ诜逊N質(zhì)抵御RKN的抗性改良顯得尤為重要。WRKY蛋白作為植株中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，在抗病領(lǐng)域的研究也愈發(fā)深入，其對于抗病信號及進程的調(diào)控功能在種質(zhì)抗性改良方面具有重要的研究和應(yīng)用價值。因此，育種人可以嘗試不依賴于R基因提高作物抗病能力的傳統(tǒng)策略，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面及其他非典型R基因的發(fā)掘入手，完成番茄對RKN的抗性改良。本文可為今后番茄抗根結(jié)線蟲病育種突破瓶頸提供新思路。

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