[摘要] 目的 探究人參皂苷Rb3 （Rb3） 在牙周炎癥環(huán)境中對(duì)成骨的促進(jìn)作用，并闡述其機(jī)制。方法 組織塊法培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs），通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞干性鑒定。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）、鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（Calcein-AM） 與碘化丙啶（PI） 檢測(cè)Rb3 對(duì)hPDLSCs 活力的影響。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、10 μg/mL 脂多糖（LPS） 組、10 μg/mL LPS+100 μmol/L Rb3 組和10 μg/mL LPS+200 μmol/L Rb3 組。堿性磷酸酶（ALP） 染色檢測(cè)成骨誘導(dǎo)后各組hPDLSCs 的ALP 活性。定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 法檢測(cè)成骨誘導(dǎo)后各組hPDLSCs 中白細(xì)胞介素-6 （IL-6）、白細(xì)胞介素-8 （IL-8）、runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （RUNX2）、轉(zhuǎn)化生長因子-β （TGF-β） 基因的表達(dá)情況。蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot） 檢測(cè)各組hPDLSCs 內(nèi)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-ERK） 相關(guān)蛋白表達(dá)情況。Sprague-Dawley 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、結(jié)扎組、結(jié)扎+Rb3 組。對(duì)左側(cè)磨牙-上頜骨組織行顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-CT） 檢測(cè)；檢測(cè)完成后，將左側(cè)磨牙-上頜骨制作牙周組織切片。蘇木精-伊紅（HE） 染色檢測(cè)炎細(xì)胞浸潤、附著喪失情況。馬松（Masson） 染色檢測(cè)牙齦膠原纖維的破壞情況。免疫熒光染色檢測(cè)RUNX2 蛋白、p-ERK蛋白表達(dá)情況。qRT-PCR 法檢測(cè)大鼠牙齦組織中TGF-β 的表達(dá)情況。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 檢測(cè)大鼠外周血清IL-6 蛋白表達(dá)情況。大鼠心臟血行流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)Treg細(xì)胞占比。采用GraphPad Prism 10.1.2 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 Rb3 對(duì)hPDLSCs 活性無影響。hPDLSCs 成骨誘導(dǎo)后的qRT-PCR與ALP 染色結(jié)果顯示Rb3 可抑制炎癥性hPDLSCs 內(nèi)IL-6、IL-8 基因表達(dá)，促進(jìn)TGF-β 基因表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)炎癥性hPDLSCs 成骨分化。Western blot 結(jié)果顯示Rb3 抑制炎癥性hPDLSCs p-ERK蛋白表達(dá)。micro-CT、Masson 染色、HE染色結(jié)果顯示Rb3 可促進(jìn)牙周炎大鼠牙槽骨的形成，同時(shí)抑制牙周纖維組織破壞、附著喪失及炎癥細(xì)胞浸潤。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Rb3 可促進(jìn)牙周炎大鼠外周血Treg 細(xì)胞分化。ELISA與qRT-PCR結(jié)果顯示Rb3 可抑制牙周炎大鼠IL-6 蛋白表達(dá)，促進(jìn)TGF-β 基因表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示Rb3 可促進(jìn)牙周炎大鼠RUNX2 蛋白表達(dá)，抑制p-ERK蛋白表達(dá)。結(jié)論 Rb3 可能通過調(diào)控p-ERK通路減輕牙周炎大鼠牙周組織炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)hPDLSCs 成骨分化。

[關(guān)鍵詞] 人參皂苷Rb3； 磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶； 成骨分化； 牙周炎；牙槽骨吸收

[中圖分類號(hào)] R781.4 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2025.2024393

牙周炎是由牙菌斑生物膜引起，發(fā)生在易感宿主牙周組織中的慢性炎癥性疾病，造成骨吸收與骨形成之間的失衡，臨床表現(xiàn)為牙齦出血、牙周附著喪失、牙槽骨吸收，進(jìn)而引起牙齒松動(dòng)脫落，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。目前牙周炎的治療方法主要通過清除菌斑生物膜來控制牙周炎癥，然而，單純的物理治療手段在調(diào)控易感宿主免疫炎癥反應(yīng)方面效果不佳，難以實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生。

人參皂苷Rb3 （ginsenoside Rb3，Rb3） 是人參的主要活性成分之一，研究[3]發(fā)現(xiàn)，Rb3 在減輕炎癥、調(diào)控免疫功能方面具有明顯功效。前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，Rb3具有顯著的抗炎和抗破骨作用，Rb3通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase，MAPK） 信號(hào)通路，抑制脂多糖（lipopolysaccharides，LPS） 引起的人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）促炎因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL） -6、IL-8、IL-1β 的表達(dá)；并通過調(diào)控MAPK通路中的外源性信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regula-ted kinase，ERK） 的活化，抑制破骨細(xì)胞分化。

hPDLSCs 是來自牙周組織的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具有成骨分化能力，是牙周組織再生及免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的種子細(xì)胞[5]。然而，在牙周炎癥條件下，hPDLSCs 的成骨分化能力受到抑制[6]。因此需要一種合適的藥物能夠調(diào)控易感宿主的免疫炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥條件下hPDLSCs 的成骨分化能力。MAPK 通路是一種經(jīng)典的信號(hào)傳遞通路，可調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等生物活動(dòng)[7-8]。牙周組織在病原微生物侵襲下會(huì)引發(fā)體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而激活MAPK 通路發(fā)揮免疫防御反應(yīng)，包括ERK、p38 絲裂原活化蛋白激酶和c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） 發(fā)揮免疫防御作用。早期研究[9]表明，適度的免疫防御情況下，ERK 通路蛋白磷酸化后將激活骨形成過程中的關(guān)鍵因子runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （runt-related transcription factor 2，RUNX2） 磷酸化，促進(jìn)骨形成。近年來研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，炎癥條件下激活的MAPK 通路將抑制堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP） 活性，降低RUNX2 表達(dá)，進(jìn)而抑制成骨。本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)探討了Rb3是否在炎癥條件下促進(jìn)hPDLSCs 成骨，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Rb3 對(duì)牙周結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠牙周炎的治療效果，并進(jìn)一步檢測(cè)了相關(guān)信號(hào)通路RUNX2 蛋白和磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phosphorrylatedextracellular signal-regulated kinase， p-ERK） 在牙周組織中的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)通過了山東第二醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（審查編號(hào)：2021SDL488）。SPF 級(jí)Sprague-Dawley （SD） 雄性大鼠30 只，4 周齡，體質(zhì)量（200±20） g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。所有大鼠于標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

青-鏈霉素、Ficoll-PaqueTM PREMIUM密度梯度離心介質(zhì)（思拓凡生物科技有限公司，美國），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、維生素C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、茜素紅S 染色液、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP） 與硝基藍(lán)四氮唑（nitrotetrazoliumblue chloride，NBT） 底物顯色試劑盒、抗熒光衰減封片劑（含4’ ， 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、羊抗兔免疫球蛋白G （immunoglobulinG，IgG） -異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）、羊抗小鼠IgG-FITC、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA） 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），異戊巴比妥（Aspen公司，南非共和國），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cellcounting kit-8，CCK-8）、鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（calcein acetoxymethyl ester，Calcein-AM） 和碘化丙啶（propidium Iodide，PI） 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、4%多聚甲醛固定液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），F(xiàn)ITC Anti-分化簇4 （cluster ofdifferentiation 4，CD4） 抗體（Biolegend 公司，美國），別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC） Anti-分化簇25 （cluster of differentiation 25，CD25） 抗體、藻紅蛋白（p-phycoerythrin，PE） Anti-轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白（forkheadbox protein 3，F(xiàn)OXP3） 抗體、最低必需培養(yǎng)基（minimum essential mdeiumα，α-MEM）（上海賽默飛世爾科技公司），F(xiàn)ix amp;Perm Kit 固定破膜劑（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司），超純RNA提取試劑盒（泰州康為世紀(jì)生物科技有限公司），第三代qPCR 專用逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液、通用型高靈敏度染料法定量PCR 檢測(cè)試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），Anti-RUNX2 抗體（Abcam 公司，英國）、ERK 抗體、p-ERK 抗體、辣根過氧化物酶二抗（CST 生物公司，美國），甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH） 偶聯(lián)抗體（湖北普美生物科技有限公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒（深圳欣博勝生物科技有限公司），Tris 緩沖鹽Tween洗滌緩沖液（tris saline with tween，TBST）（安徽白鯊生物公司）。

Supermax 3100 型酶標(biāo)儀（北京閃譜科技公司），Pannoramic MIDI 型病理切片掃描儀（3DHISTECH公司，匈牙利），JY-300E 型PCR儀（江蘇諾米醫(yī)療科技公司），Discovery V12 型體式顯微鏡（蔡司公司，美國），C6plus 型流式細(xì)胞儀（BD公司，美國），F(xiàn)C-3100 核酸蛋白分析儀（杭州遂真生物技術(shù)有限公司），Skyscan1172 高分辨顯微CT掃描儀（Bruker 公司，美國），NIB610 倒置顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司）。

1.2 hPDLSCs 原代培養(yǎng)及鑒定

選取山東第二醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科因正畸需要拔除的無齲壞、無牙周炎癥的健康前磨牙及無咬合功能的、無齲壞、無牙周炎癥的智齒。牙齒來自18～25 歲健康成年人。PBS 反復(fù)清洗去除血漬，用刀片刮取牙根中1/3 牙周膜，切碎后于25 cm2 密封蓋細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶中加入5 mL血清濃度為20%的α-MEM培養(yǎng)基。7～10 d 后原代hPDLSCs 從組織塊邊緣爬出，待其生長密度達(dá)80%后用胰酶消化傳代培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用第3 代到第5 代hPDLSCs。

第3 代hPDLSCs 消化后PBS 重懸，濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL。每個(gè)EP 管中加入200 μL細(xì)胞懸液后分別加入FITC-CD105 抗體、FITC-CD90 抗體、FITC-CD14 抗體和PE-CD73 抗體。細(xì)胞避光孵育后重懸，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 CCK-8 檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分組為： 對(duì)照組、50 μmol/L Rb3 組、100 μmol/L Rb3 組、200 μmol/L Rb3 組、400 μmol/LRb3組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將hPDLSCs（5 000個(gè)/孔）均勻接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的Rb3。5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后每孔加入10 μL CC-K8 試劑繼續(xù)孵育1 h，最后用Supermax 3100 酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔450 nm波長的吸光度值。

1.4 Calcein/PI 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)

將hPDLSCs （40 000 個(gè)/孔） 接種于24孔板中，分組及細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.3。48 h后終止培養(yǎng)，PBS洗滌。每孔加入250 μL Calcein-AM/PI 檢測(cè)工作液，避光孵育后于NIB610 倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5 ALP 染色

成骨誘導(dǎo)液配置：5 mg/mL 抗壞血酸500 μL、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉 500 μL、10 μmol/L 地塞米松250 μL 加至50 mL 血清濃度為10%的α-MEM培養(yǎng)基中。

實(shí)驗(yàn)分組： 對(duì)照組、10 μg/mL LPS 組、10 μg/mL LPS+100 μmol/L Rb3 組、10 μg/mL LPS+200 μmol/L Rb3 組。將hPDLSCs （2×105個(gè)/孔） 均勻接種于6 孔板中，藥物組首先加入Rb3 預(yù)處理2 h，然后加入10 μg/mL LPS，培養(yǎng)24 h 后更換為成骨誘導(dǎo)液，之后每3 d 更換新鮮的成骨誘導(dǎo)液，其中加入10 μg/mL LPS 和相應(yīng)濃度的Rb3。

染色：7 d 后棄成骨誘導(dǎo)液，PBS 洗滌，多聚甲醛固定30 min。PBS 洗滌后， 每孔加入1 mLBCIP/NBT 底物顯色試劑工作液，室溫避光下孵育30 min，Discovery V12 型體式顯微鏡下觀察并采集圖像，圖像處理軟件Image J 測(cè)量其著色面積并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 茜素紅染色

成骨誘導(dǎo)配置同實(shí)驗(yàn)方法1.5。21 d 后棄成骨誘導(dǎo)液，PBS 洗滌，多聚甲醛固定30 min。1%茜素紅S 染色液染色5 min，無酶水輕輕洗滌3 次后于Discovery V12 型體式顯微鏡下觀察著色鈣化結(jié)節(jié)。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）

實(shí)驗(yàn)分組及預(yù)處理同實(shí)驗(yàn)方法1.5。7 d 后棄成骨誘導(dǎo)液，細(xì)胞于4 ℃裂解、離心收集蛋白樣品。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度并調(diào)整至2 μg/μL，每組上樣20 μg，電泳后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride，PVDF）。PVDF 膜孵育p-ERK、ERK、GAPDH 一抗4 ℃孵育過夜，隨后孵育二抗1 h，顯色后使用FC-3100 核酸蛋白分析儀進(jìn)行顯影。

1.8 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reversetranscription polymerase chain reaction，qRTPCR）

大鼠牙齦組織及成骨誘導(dǎo)后的hPDLSCs 通過RNA 提取試劑盒提取總RNA，然后用HiScript ⅢRT SuperMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)Cham-Q SYBR qPCR Master Mix （low ROX Premixed）說明書配置PCR 擴(kuò)增體系。PCR 反應(yīng)程序設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行溶解曲線分析，條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。2?△△CT計(jì)算各基因的表達(dá)量。本次實(shí)驗(yàn)采用的基因引物序列見表1。

1.9 大鼠牙周炎模型建立

將SD 大鼠隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組、結(jié)扎組、結(jié)扎+Rb3 組。3%異戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，使用4-0 絲線結(jié)扎大鼠左側(cè)上頜第一磨牙，每2 d檢查結(jié)扎絲線是否脫落。結(jié)扎后2 d，用生理鹽水配置100 μmol/L Rb3，對(duì)結(jié)扎+Rb3 組大鼠進(jìn)行腹腔注射Rb3 1 mL，每2 d 給藥1 次，同時(shí)給對(duì)照組及結(jié)扎組大鼠注射等體積的生理鹽水。4 周后，3組大鼠注射過量3% 異戊巴比妥鈉安樂死，收集樣本。

1.10 顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（micro-computedtomography，micro-CT）

收集大鼠左側(cè)上頜牙齒-牙槽骨聯(lián)合標(biāo)本，多聚甲醛固定48 h 后，PBS 反復(fù)洗滌。Skyscan 1172高分辨顯微CT 掃描儀進(jìn)行掃描和分析。圖像處理軟件Image J 測(cè)量第一磨牙和第二磨牙之間釉牙骨質(zhì)界（cementoenamel junction，CEJ） 至牙槽嵴頂（alveolar crest，AC） 的距離并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.11 牙周組織染色

石蠟切片制作：左側(cè)上頜完整剝離后固定于4%多聚甲醛中48 h 后PBS 反復(fù)洗滌去除多余的甲醛固定液。組織依次經(jīng)30%～100%梯度乙醇脫水硬化后，進(jìn)行透明化處理，隨后浸蠟并石蠟包埋，最后連續(xù)切片，厚度控制在4～7 μm。蠟片附著于載玻片后于烘干箱中干燥。

Masson 染色：石蠟切片經(jīng)脫蠟處理后，依次浸入100%～70%梯度乙醇中進(jìn)行水化預(yù)處理。隨后依次浸染于蘇木素溶液、麗春紅酸性品紅液、磷鉬酸水、苯胺藍(lán)液中。染色完成的切片脫水透明化后封片。顯微鏡下觀察膠原纖維的著色情況，圖像處理軟件Image J 測(cè)量其面積并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

HE 染色：石蠟切片預(yù)處理同上，后浸入蘇木素、伊紅染液中，流水沖洗后脫水封片。

1.12 免疫熒光

切片預(yù)處理同方法1.11。標(biāo)記切片目標(biāo)區(qū)域后，經(jīng)胃蛋白酶修復(fù)，隨后進(jìn)行破膜封閉處理，并于4 ℃下孵育RUNX2、p-ERK一抗體過夜。次日，切片洗滌后孵育羊抗小鼠IgG-FITC 二抗，再次洗滌后滴加抗熒光衰減封片劑，最后在NIB610倒置顯微鏡下拍攝并采集圖像。

1.13 酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）

大鼠心臟血離心、取上層血清。按照IL-6ELISA 試劑盒中的說明書配置標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋液。按照實(shí)驗(yàn)要求將稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品加入孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。處理好的孔板避光孵育洗滌后，加入配置好的生物素化抗體稀釋液及生物素化抗體工作液，再次避光孵育洗滌?？装宓目瞻卓准按郎y(cè)孔中分別加入酶結(jié)合物稀釋液與酶結(jié)合物工作液，避光孵育洗滌?？装逯屑尤腼@色底物，避光孵育后加入反應(yīng)終止液，Supermax 3100 型酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.14 流式細(xì)胞術(shù)

15 mL 離心管中加入2 mL 大鼠心臟血、2 mLFicoll 溶液，水平梯度離心后取中間白膜層單核細(xì)胞。細(xì)胞濃度調(diào)整至（0.5～1.0） ×106/mL，取1 mL細(xì)胞懸液于EP 管中，加入FITC-CD4 抗體、APCCD25抗體，避光孵育后依次破胞膜及核膜，加入PE-FOXP3 抗體。PBS 洗滌重懸，上機(jī)檢測(cè)。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prism 10.1.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析，Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hPDLSCs 培養(yǎng)鑒定及Rb3 對(duì)其活力的影響

培養(yǎng)1 周后細(xì)胞從牙周膜組織塊中爬出，呈長梭形（圖1A）；ALP 染色及茜素紅染色表明該細(xì)胞具有成骨分化能力（圖1B、C）；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示該細(xì)胞高表達(dá)CD105、CD90、CD73，低表達(dá)CD14 （圖1D）。以上結(jié)果說明該細(xì)胞為hPDLSCs。

CCK8 及Calcein-AM/PI 染色結(jié)果顯示，Rb3濃度不超過400 μmol/L 時(shí)，對(duì)hPDLSCs 的細(xì)胞活力無影響（圖1E、F）。

2.2 Rb3 抑制hPDLSCs 內(nèi)炎癥基因表達(dá)，促進(jìn)炎性hPDLSCs 成骨

qRT-PCR 結(jié)果顯示（圖2），10 μg/mL LPS 刺激引起hPDLSCs 的炎癥反應(yīng)，相比對(duì)照組，促炎基因IL-6、IL-8 表達(dá)顯著升高、抗炎基因TGF-β 表達(dá)降低。同時(shí)10 μg/mL LPS 抑制了早期成骨指標(biāo)RUNX2 基因表達(dá)。Rb3 明顯改善LPS 引起的炎癥反應(yīng)，相比10 μg/mL LPS 組，顯著抑制IL-6 基因、IL-8 基因表達(dá)，并促進(jìn)TGF-β 基因和RUNX2 基因表達(dá)（圖2A）。

ALP染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10 μg/mLLPS 組的hPDLSCs 中ALP 表達(dá)下降；然而，在10 μg/mL LPS 條件下加入Rb3 后，ALP 表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性增加（圖2B、C）。

2.3 Rb3 治療促進(jìn)牙周炎大鼠牙槽骨形成

本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎法建立實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎模型，絲線結(jié)扎部位為上頜左側(cè)第一磨牙。micro-CT 影像分析顯示（圖3A，舌側(cè)），對(duì)照組第一磨牙與第二磨牙之間的牙槽骨未見明顯吸收，而結(jié)扎組的牙槽骨吸收至根尖1/3，結(jié)扎+Rb3 組的牙槽骨吸收至根中1/3。對(duì)3 組大鼠垂直切面第一磨牙與第二磨牙之間CEJ-AC的距離進(jìn)行測(cè)量分析（圖3A，垂直切面），結(jié)果顯示結(jié)扎組大鼠CEJ-AC 距離顯著大于對(duì)照組，而結(jié)扎+Rb3 組大鼠CEJ-AC距離較單純結(jié)扎組明顯減?。▓D3B）。

Masson 染色及定量分析結(jié)果顯示，結(jié)扎組大鼠牙周組織膠原纖維相比對(duì)照組有明顯破壞，而相較結(jié)扎組，結(jié)扎+Rb3 組大鼠牙周組織膠原纖維的破壞程度明顯減輕（圖3C、D）。

2.4 Rb3 治療促進(jìn)牙周炎大鼠Treg 細(xì)胞分化，減輕牙周組織炎癥反應(yīng)

FITC-CD4 抗體、APC-CD25 抗體、PE-FOXP3抗體對(duì)大鼠外周血中的Treg 細(xì)胞進(jìn)行共定位。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，結(jié)扎組中Treg 細(xì)胞分化減少，結(jié)扎+Rb3 組中Treg 細(xì)胞分化增加（圖4A）。HE染色結(jié)果顯示，結(jié)扎組相比對(duì)照組，結(jié)合上皮離開CEJ 向根方移位，表明附著喪失程度加重。與結(jié)扎組相比，結(jié)扎+Rb3 組大鼠結(jié)合上皮根方移位的距離明顯減小，表明牙周附著喪失得到改善。此外，HE 染色結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，結(jié)扎組大鼠牙齦上皮下有明顯的炎細(xì)胞浸潤，而結(jié)扎+Rb3 組牙齦組織中炎細(xì)胞浸潤程度減輕（圖4B）。

ELISA 與qRT-PCR 結(jié)果進(jìn)一步表明：與對(duì)照組相比，結(jié)扎組大鼠牙齦組中IL-6 蛋白表達(dá)顯著升高，TGF-β 基因表達(dá)顯著降低；而Rb3 治療可降低牙周炎大鼠牙齦組織中IL-6 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)TGF-β 基因表達(dá)（圖4C、D）。

2.5 Rb3 治療上調(diào)RUNX2 蛋白表達(dá)，抑制p-ERK蛋白活化

本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光染色檢測(cè)牙周組織中RUNX2 蛋白、p-ERK 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示， 同對(duì)照組相比， 結(jié)扎組大鼠牙周組織中RUNX2 蛋白的表達(dá)明顯降低； 而結(jié)扎+Rb3 組RUNX2 蛋白的表達(dá)較結(jié)扎組明顯增加（圖5A）。同時(shí)，結(jié)扎組大鼠牙周組織中p-ERK 蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高，而結(jié)扎+Rb3 組中p-ERK蛋白的表達(dá)較結(jié)扎組顯著降低（圖5B）。Westernblot 結(jié)果顯示，10 μg/mL LPS 組p-ERK蛋白表達(dá)水平相比對(duì)照組顯著升高，加入Rb3 后p-ERK 蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性顯著降低（圖5C、D）。

3 討論

牙周炎的致病機(jī)制涉及牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis，P. gingivalis），該菌種的LPS、菌毛及蛋白酶等成分促進(jìn)菌群生長與增殖[12]。本實(shí)驗(yàn)利用P. gingivalis LPS 作為誘導(dǎo)劑，探討其對(duì)hPDLSCs 炎癥反應(yīng)的影響。既往研究[13]顯示P.gingivalis LPS 能夠有效促進(jìn)IL-8 與IL-6 的分泌。IL-8 通過募集炎癥區(qū)域中性粒細(xì)胞，加速牙周炎癥進(jìn)展。IL-6 促進(jìn)輔助性T 細(xì)胞Th17 分化，進(jìn)而加速牙周組織附著能力喪失及牙槽骨吸收[14-15]。

因此，IL-6 與IL-8 可作為評(píng)估牙周炎癥嚴(yán)重程度的關(guān)鍵促炎因子。TGF-β 轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控其下游信號(hào)分子Smad 蛋白，進(jìn)而促進(jìn)hPDLSCs 增殖與分化[16-17]。Treg 細(xì)胞通過分泌包括TGF-β 在內(nèi)的抗炎細(xì)胞因子，促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞的活化，有利于牙槽骨的再生[18-19]。研究[20]表明，作為免疫抑制因子的TGF-β 在炎癥狀態(tài)下表達(dá)水平會(huì)受到抑制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了上述結(jié)論，即在炎癥條件下，IL-6 與IL-8 基因表達(dá)上調(diào)，TGF-β 基因表達(dá)下調(diào)。

本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎上頜第一磨牙的方法建立大鼠牙周炎模型，該方法已被研究[21]證實(shí)操作簡便且能有效誘導(dǎo)牙周炎。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)扎4 周后，大鼠上頜第一磨牙牙齦組織出現(xiàn)明顯紅腫，探診時(shí)伴有出血癥狀。HE 染色進(jìn)一步表明，牙齦上皮下存在廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤，且附著喪失程度顯著增加，提示大鼠牙齦炎癥明顯。micro-CT掃描顯示，結(jié)扎組大鼠牙槽骨吸收至根尖1/3 區(qū)域，Masson 染色結(jié)果證實(shí)牙周膠原纖維結(jié)構(gòu)破壞，表明已形成重度牙周炎。此外，對(duì)外周血的分析顯示，牙周炎大鼠Treg 細(xì)胞分化數(shù)量顯著減少，TGF-β 基因表達(dá)水平明顯降低，而IL-6 蛋白分泌量顯著增加。這些結(jié)果與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了炎癥狀態(tài)下TGF-β 抑制及IL-6 升高的病理特征。

在本項(xiàng)研究中初步評(píng)估了LPS 誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境對(duì)hPDLSCs 成骨分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS 處理的hPDLSCs 的ALP 活性顯著降低，且qRT-PCR 檢測(cè)到RUNX2 基因表達(dá)下降，表明炎癥條件下hPDLSCs 成骨分化能力受到抑制。近年研究[22]表明，hPDLSCs 具有顯著的牙周組織修復(fù)的潛能，其分泌的外泌體能夠有效促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化，有利于牙周組織的修復(fù)再生。然而，牙菌斑內(nèi)的病原體能夠激活牙周組織的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子的過度表達(dá)，抑制hPDLSCs 成骨分化[23]。研究[24]表明，ALP、RUNX2 等生物標(biāo)志物在成骨分化早期有著重要意義。Nagasaki 等[25]發(fā)現(xiàn)，ALP 作為成骨分化的早期關(guān)鍵標(biāo)志，通過水解焦磷酸鹽生成無機(jī)磷酸鹽，促進(jìn)了細(xì)胞礦化及牙周組織再生。Bronckers 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，RUNX2轉(zhuǎn)錄因子在成釉器、牙乳頭以及牙囊細(xì)胞中均有表達(dá)，參與牙齒及牙槽骨發(fā)育。近期，Xu 等[27]的研究進(jìn)一步指出，RUNX2 表達(dá)減低會(huì)導(dǎo)致結(jié)合上皮及牙槽骨結(jié)構(gòu)的顯著缺損。

牙周炎的有效治療策略在于控制炎癥進(jìn)展并促進(jìn)成骨以實(shí)現(xiàn)牙周組織再生。前期研究[3-4]證實(shí)，Rb3 能夠通過抗炎及抑制破骨作用有效控制牙周炎癥進(jìn)展。本研究探討了Rb3 對(duì)炎癥性hPDL-SCs 成骨分化的影響。結(jié)果顯示，Rb3 處理后，炎癥性hPDLSCs 在成骨誘導(dǎo)過程中TGF-β 基因顯著上調(diào)，IL-6、IL-8 基因表達(dá)降低。此外，ALP 染色表明Rb3 能夠增強(qiáng)10 μg/mL LPS 條件下hPDLSCs 的ALP 活性，并且通過qRT-PCR 進(jìn)一步檢測(cè)到Rb3處理后的炎癥性hPDLSCs 中RUNX2 基因表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明，Rb3 可能通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵信號(hào)通路和炎癥因子表達(dá)來促進(jìn)炎癥性hPDLSCs 的成骨分化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，Rb3 治療能夠改善牙周炎癥并抑制牙槽骨吸收。

為更深入探究Rb3 在調(diào)控牙周炎癥進(jìn)程及促進(jìn)成骨分化方面的潛在機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用了免疫熒光染色技術(shù)和Western blot 方法，結(jié)果顯示Rb3顯著抑制炎癥微環(huán)境下p-ERK 蛋白的過度表達(dá)。關(guān)于MAPK信號(hào)通路在牙周炎中的作用，Liu 等[28]研究表明，當(dāng)免疫細(xì)胞發(fā)揮防御反應(yīng)時(shí)，核因子κB 配體活化因子會(huì)激活破骨細(xì)胞受體，進(jìn)而激活ERK、p-38 和JNK 等MAPK 通路，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。

Lu 等[29]研究表示，抑制ERK磷酸化過程能夠有效降低IL-6、腫瘤壞死因子-α 等多種炎癥因子的表達(dá)水平，從而有助于減輕hPDLSCs 的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，Liang 等[10]研究表明抑制p-ERK的過度表達(dá)能夠增強(qiáng)hPDLSCs 的成骨分化能力。研究[30-31]表明，利鈉肽受體3 （natriuretic peptide receptor-3，NPR3） 是MAPK 的上游通路， 可限制骨生長。Zhang 等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)條件下，未經(jīng)藥物處理的hPDLSCs會(huì)激活NPR3，促進(jìn)p-ERK過度表達(dá)，進(jìn)而抑制hPDLSCs 的成骨分化能力。然而有研究[32， 5]得出相反的研究結(jié)果，調(diào)控ERK通路促進(jìn)p-ERK表達(dá)可促進(jìn)成骨。Jiang 等[33]研究表明，隨著藥物濃度的改變，通過激活ERK 信號(hào)通路，進(jìn)而正向調(diào)控Wnt/β-cantenin 通路，促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。因此ERK通路可因不同的藥物濃度及處理時(shí)間、不同的細(xì)胞體系在成骨分化過程中表現(xiàn)出雙向調(diào)控作用。

本次體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Rb3 通過抑制炎癥微環(huán)境下p-ERK 蛋白的過度表達(dá)，有效抑制炎性細(xì)胞因子釋放。這一機(jī)制進(jìn)一步促進(jìn)了ALP 及RUNX2 基因的表達(dá)，從而顯著增強(qiáng)了hPDLSCs 在炎性環(huán)境中的成骨分化能力。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Rb3 能夠降低牙周炎大鼠牙周組織中p-ERK蛋白的表達(dá)，同時(shí)提升RUNX2 蛋白的表達(dá)水平，因此減輕了牙周組織的炎癥反應(yīng)并促進(jìn)牙周炎大鼠牙槽骨再生。綜上所述，Rb3 可能通過調(diào)控p-ERK 信號(hào)通路，減輕牙周炎大鼠的牙齦炎癥及牙槽骨吸收程度，同時(shí)促進(jìn)了炎癥微環(huán)境下hPDLSCs的成骨分化。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（本文編輯 洪瀟）