[摘要] 目的 利用光刻技術(shù)制備圖案化的細(xì)胞差異黏附表面，探討?zhàn)じ矫娣e對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞極化與成牙向分化的影響。方法 利用光刻技術(shù)和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA） 水凝膠制備了具有差異黏附特性的圖案化微陣列，通過對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生限域作用，促使人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs） 呈現(xiàn)天然成牙本質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)。篩選孤立培養(yǎng)的單個(gè)hDPSCs，探究不同面積（1 800、2 700、3 600 μm2） 對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞極化和分化的影響。通過免疫熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)，明確高爾基體和細(xì)胞核在hDPSCs 中的定位及取向，分析不同面積對(duì)細(xì)胞極化的作用。通過堿性磷酸酶染色檢測hDPSCs 成牙向分化率和平均光密度值，探究不同面積對(duì)細(xì)胞分化的作用。結(jié)果 成功分離了hDPSCs 并對(duì)其鑒定，制備了仿成牙本質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的圖案化微陣列，通過鬼筆環(huán)肽染色證實(shí)了細(xì)胞形狀與微圖案形狀高度相符。免疫熒光染色結(jié)果顯示限域面積為3 600 μm2時(shí)，孤立hDPSCs 中各項(xiàng)極化和分化水平均明顯高于1 800 μm2和2 700 μm2限域面積的孤立hDPSCs （Plt;0.05）。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)通過微陣列技術(shù)證實(shí)了限域面積參與調(diào)控成牙本質(zhì)細(xì)胞極化和分化進(jìn)程，隨著限域面積增大，孤立hDPSCs 極化和分化水平升高。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞極化； 圖案化； 成牙本質(zhì)細(xì)胞； 細(xì)胞分化

[中圖分類號(hào)] R781.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2025.2024392

目前齲病治療后存在材料降解、粘接強(qiáng)度降低等不良情況，因而失敗率仍較高[1]。同時(shí)，通過組織工程技術(shù)再生的牙本質(zhì)存在牙本質(zhì)小管數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)紊亂，甚至小管結(jié)構(gòu)消失等問題，難以恢復(fù)天然牙本質(zhì)的神經(jīng)感受和機(jī)械傳導(dǎo)的功能。因此，功能性牙本質(zhì)再生仍未實(shí)現(xiàn)[2]。在牙發(fā)育中，牙本質(zhì)小管是由極化的成牙本質(zhì)細(xì)胞沿著細(xì)胞突起側(cè)分泌基質(zhì)，隨后基質(zhì)發(fā)生礦化，從而形成容納成牙本質(zhì)細(xì)胞突起的管狀結(jié)構(gòu)。因此，成牙本質(zhì)細(xì)胞極化是牙本質(zhì)小管形成的前提條件[3-4]。細(xì)胞極化是以細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞器重定位以及生物大分子非對(duì)稱分布為特征的細(xì)胞活動(dòng)[5]。在成牙本質(zhì)細(xì)胞發(fā)生極化時(shí)，細(xì)胞器的形態(tài)、定位與取向會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化以適應(yīng)細(xì)胞的功能活動(dòng)。極性的形成對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化成熟和功能發(fā)揮至關(guān)重要，但影響成牙本質(zhì)細(xì)胞極化的具體機(jī)制尚不明確。

微陣列技術(shù)目前已較為成熟，常用陣列制備方法包括光刻技術(shù)、軟光刻技術(shù)、熱模壓印技術(shù)等，由于其可以模擬人體內(nèi)微環(huán)境的形貌結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，將細(xì)胞限制在特定區(qū)域內(nèi)，從而調(diào)控細(xì)胞形狀和面積，多用來探究微環(huán)境中各種物理或化學(xué)因素對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控作用，常用于細(xì)胞增殖、極化和分化等方面的研究[6]。

本研究通過微陣列技術(shù)促使體外孤立的人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）呈現(xiàn)出了與天然成牙本質(zhì)細(xì)胞高度相似的細(xì)胞形態(tài)，并基于此探究了限域面積與成牙本質(zhì)細(xì)胞極化和分化的相關(guān)性，推斷細(xì)胞面積可能是影響成牙本質(zhì)細(xì)胞極化和分化的重要因素。

1 材料和方法

1.1 圖案化微陣列的設(shè)計(jì)與制備

利用Adobe Illustrator 軟件設(shè)計(jì)，繪制出由正方形與三角形組合而成的模擬成牙本質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的非對(duì)稱圖案，正方形邊長與三角形高度比值為2∶1，面積分別為1 800、2 700、3 600 μm2，以探究不同面積的微圖案對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控影響。根據(jù)設(shè)計(jì)好的微陣列參數(shù)，制作玻璃光刻掩模板。將載玻片裁成預(yù)設(shè)尺寸，無水乙醇和去離子水依次浸泡沖洗吹干后，放入plasma 機(jī)器進(jìn)行表面等離子體清洗10 min，使載玻片表面活化為硅羥基便于接枝。將處理好的載玻片浸入無水乙醇（Et-OH） 和硅烷偶聯(lián)劑（silane coupling agent，SCA）（Sigma 公司，美國） 的混合硅烷溶液中，30 min后無水乙醇充分清洗樣品吹干備用。使用凝膠單體聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEGDA）、2-羥基-4’ - （2-羥乙氧基） -2-甲基苯丙酮配置水凝膠溶液。將載玻片置于光刻機(jī)載物臺(tái)上，在其上方滴加50 μL凝膠預(yù)聚體，蓋上掩模板，紫外光（ultraviolet，UV） 曝光10 s 后獲得目標(biāo)PEGDA凝膠圖案用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1）。

1.2 細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

將因正畸需要拔出的人離體牙置于含有1%青霉素?鏈霉素（Sigma 公司，美國） 的PBS 溶液中，利用酶消化法提取hDPSCs，隔3 d 換1 次液，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)傳代，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用P3-P5細(xì)胞。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測hDPSCs 表面標(biāo)志物，陽性標(biāo)志物為CD90、CD105，陰性標(biāo)志物為CD34、CD45。實(shí)驗(yàn)由吉林大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：SJDKQ2024031。

1.3 細(xì)胞接種

將微圖案樣品置于6 孔板中，75%乙醇浸泡，同時(shí)紫外滅菌30 min。PBS 緩沖液洗滌樣品去除殘留乙醇。細(xì)胞懸液接種至樣品表面，接種密度為每孔4×104個(gè)，貼壁1 h 后用PBS 緩沖液沖洗未貼壁細(xì)胞，隨后細(xì)胞在孵箱（37 ℃，5%CO2） 內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 免疫熒光染色

細(xì)胞培養(yǎng)1 d與成骨誘導(dǎo)5 d后，分別進(jìn)行高爾基體基質(zhì)蛋白130 （golgi matrix protein 130，GM-130） 和Ⅰ型膠原α1 鏈（collagen type Ⅰalpha 1chain，Col1α1） 的染色。4%多聚甲醛固定15 min，在0.2%Triton X-100PBS 中透化5 min，5%牛血清白蛋白（北京蘭杰柯科技有限公司） 阻斷1 h。標(biāo)記細(xì)胞骨架微絲用羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（北京索萊寶科技有限公司） 在室溫孵育30 min。標(biāo)記高爾基體與Col1α1 用稀釋比1∶200 的GM130 （BD公司，美國） 與Col1α1 （武漢三鷹生物技術(shù)有限公司） 一抗過夜孵育，后續(xù)以1∶200 的稀釋比孵育二抗Fitc 偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG （武漢三鷹生物技術(shù)有限公司） 與Fitc 偶聯(lián)山羊抗兔IgG （武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞核使用4’ ，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’ ，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（北京索萊寶科技有限公司） 染色7 min。洗凈后使用抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 堿性磷酸酶染色

P3 的細(xì)胞培養(yǎng)1 d 后，加入成骨誘導(dǎo)液（含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL 維生素C 和10 nmol/L 地塞米松的完全培養(yǎng)基），每隔3 d 換1 次液，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后用4%多聚甲醛固定15 min，堿性磷酸酶試劑盒進(jìn)行染色后置于顯微鏡下觀察。

1.6 極化與分化指征及Image J 分析

篩選微陣列上符合微圖案形狀且孤立存在的hDPSCs，對(duì)其進(jìn)行染色后，拍照取圖。通過查閱文獻(xiàn)定義了以下極化及分化指標(biāo)，示意圖見圖2。極化指標(biāo)：1） 細(xì)胞極化角：當(dāng)高爾基體位于穿過細(xì)胞核質(zhì)心和仿成牙本質(zhì)細(xì)胞微圖案突起尖端長軸兩側(cè)120°范圍內(nèi)時(shí)表示發(fā)生極化[7]；2） 細(xì)胞核?高爾基體距離：在成牙本質(zhì)細(xì)胞極化中，高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核和成牙本質(zhì)細(xì)胞突起之間的核上區(qū)域，當(dāng)細(xì)胞核與高爾基體質(zhì)心相距越遠(yuǎn)表示極化程度越高[8]；3） 細(xì)胞核重定位距離：細(xì)胞核質(zhì)心距離細(xì)胞質(zhì)心后移程度越大，細(xì)胞極化程度越高；4） 細(xì)胞核重定向角：細(xì)胞核長軸與細(xì)胞長軸之間夾角越小表示極化程度越高；5） 細(xì)胞核面積：細(xì)胞核面積越大，細(xì)胞極化程度越高；6） 細(xì)胞核縱橫比（aspect ratio，AR）：細(xì)胞核AR越大，細(xì)胞極化程度越高。分化指標(biāo)：1） 細(xì)胞成牙向分化率：堿性磷酸酶染色后，孤立hDPSCs 中發(fā)生成牙向分化的單細(xì)胞百分率；2） 細(xì)胞平均光密度值（average optical density，AOD）：Image J軟件進(jìn)行堿性磷酸酶的AOD值的半定量分析；3）Col1α1 平均熒光強(qiáng)度值（mean fluorescent intensity，MFI）：Image J 軟件進(jìn)行Col1α1 的MFI 值的半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析定量數(shù)據(jù)，Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hDPSCs 的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

酶消化法培養(yǎng)5 d 后，可見有部分hDPSCs 貼壁增殖。待細(xì)胞長至對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行傳代，1 d后，鏡下可見細(xì)胞增殖至80%～90%，呈長梭形，立體飽滿，形態(tài)似成纖維細(xì)胞。傳至第3 代可見細(xì)胞生長狀態(tài)良好。流式細(xì)胞鑒定顯示，細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90 和CD105 的陽性率為99.9%和97.1%，CD34 和CD45 的表達(dá)為陰性（圖3）。

2.2 微陣列技術(shù)通過限域作用調(diào)控hDPSCs 形態(tài)

光鏡觀察證實(shí)PEGDA微圖案與光刻板設(shè)計(jì)圖樣精準(zhǔn)匹配。細(xì)胞接種后，篩選僅容納單個(gè)hDPSCs的微圖案，肌動(dòng)蛋白染色提示細(xì)胞形狀與微圖案形狀高度相符，呈現(xiàn)成牙本質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)。統(tǒng)計(jì)3 種面積圖案化微陣列上的細(xì)胞分布，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接種率均高于50%，證實(shí)所構(gòu)建的材料體系生物安全性較好。同時(shí)，DAPI 熒光染色證實(shí)3 種面積微圖案的單細(xì)胞接種率均高于41.6%，可有效分析孤立hDPSCs 的細(xì)胞行為。因此，本研究利用微陣列技術(shù)成功構(gòu)建了適用于探究成牙本質(zhì)細(xì)胞極化的體外研究平臺(tái)（圖4）。

2.3 微陣列限域面積調(diào)控hDPSCs 極化

通過對(duì)孤立hDPSCs 進(jìn)行免疫熒光染色，比較3 種不同面積圖案下孤立hDPSCs 的極化水平。首先，以細(xì)胞極化角作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)在3 600 μm2 面積微圖案上的孤立hDPSCs 中，約58%的細(xì)胞高爾基體定位在穿過細(xì)胞核質(zhì)心與圖案突起尖端長軸兩側(cè)120°范圍內(nèi)，這一比例顯著高于1 800 μm2 （Plt;0.05）。其次，在成熟的成牙本質(zhì)細(xì)胞中，高爾基體移動(dòng)至極化頂端一側(cè)，而在3 600 μm2面積時(shí)，孤立hDPSCs 中細(xì)胞核?高爾基體距離最大（Plt;0.05）。3 種面積下細(xì)胞核重定向角差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3 600 μm2 微圖案中孤立hDPSCs 細(xì)胞核的后移距離最遠(yuǎn)（Plt;0.05），細(xì)胞核面積與AR的數(shù)值也較高（Plt;0.05）。綜上提示，孤立hDPSCs 極化水平與細(xì)胞鋪展面積呈正相關(guān)（圖5）。

2.4 微陣列限域面積調(diào)控hDPSCs 分化

堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示，在1 800、2 700、3 600 μm2面積中孤立hDPSCs 的成牙向分化率分別為10.69%、13.48% 和17.08%，其中3 600 μm2 面積微圖案中細(xì)胞的成牙向分化率最高（Plt;0.05）。對(duì)發(fā)生成牙向分化的孤立細(xì)胞進(jìn)行AOD分析，發(fā)現(xiàn)3 600 μm2面積時(shí)AOD值最高（Plt;0.05）。Col1α1熒光染色結(jié)果顯示，在1 800、2 700、3 600 μm2面積中孤立hDPSCs 的MFI 分別為13.34、14.01 和18.21，其中3 600 μm2面積微圖案中細(xì)胞的MFI 值最高（Plt;0.005）。以上結(jié)果提示孤立hDPSCs 分化水平與細(xì)胞鋪展面積也存在正相關(guān)關(guān)系（圖6）。

3 討論

齲或外傷等多種外部刺激可引起局部成牙本質(zhì)細(xì)胞變性壞死，此時(shí)牙髓中未分化的間充質(zhì)細(xì)胞可遷移至損傷部位，形成修復(fù)性牙本質(zhì)，一定程度上阻斷外部刺激對(duì)牙髓的損傷[9]。然而在修復(fù)性牙本質(zhì)形成過程中，部分間充質(zhì)細(xì)胞難以發(fā)生極化，致使細(xì)胞胞體被包裹在其分泌的基質(zhì)中，形成骨樣牙本質(zhì)[10]。骨樣牙本質(zhì)因缺乏天然牙本質(zhì)的管狀結(jié)構(gòu)，難以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)感受和機(jī)械傳導(dǎo)作用，因而其生理性功能不完善。

牙發(fā)育鐘狀期，牙乳頭未分化的間充質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)釉上皮誘導(dǎo)下逐漸分化成熟，轉(zhuǎn)化為高柱狀、具有頂端突起且細(xì)胞器重定位的成牙本質(zhì)細(xì)胞[11]。隨后，細(xì)胞沿突起周圍分泌基質(zhì)，胞體后退，進(jìn)而形成管狀牙本質(zhì)[12]。因此，成牙本質(zhì)細(xì)胞極化是牙本質(zhì)管狀結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)。然而除上述形態(tài)學(xué)特征外，目前關(guān)于成牙本質(zhì)細(xì)胞極化的研究仍較少，調(diào)控極化的具體因素和機(jī)制尚不明確，闡明這一問題有望為功能性牙本質(zhì)再生提供理論依據(jù)。

利用光刻等技術(shù)，研究人員可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建對(duì)細(xì)胞黏附/鋪展具有限制作用的微圖案。PEGDA水凝膠因其出色的生物相容性和持久的抗蛋白黏附特性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于微陣列制備[13]。細(xì)胞接種于PEGDA水凝膠微陣列后，其黏附/鋪展受邊界抗黏附材料的限制，致使細(xì)胞呈現(xiàn)與微圖案一致的細(xì)胞形態(tài)[14]。微陣列技術(shù)有助于探討微環(huán)境中各種物理參數(shù)對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控作用[15]。此外，通過篩選適宜的微圖案面積，研究人員得以分離并培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞，從而排除細(xì)胞間通訊對(duì)細(xì)胞行為的干擾，在單細(xì)胞層面展開研究，更為精密準(zhǔn)確。本研究基于以PEGDA水凝膠為抗黏附材料的微陣列技術(shù)，構(gòu)建了模擬天然成牙本質(zhì)細(xì)胞極化形態(tài)的微圖案，促使孤立hDPSCs 呈現(xiàn)出了與天然成牙本質(zhì)細(xì)胞高度相似的極化形態(tài)。

因本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的微圖案陣列具有一定厚度（約10 μm），因此所培養(yǎng)的hDPSCs 可同時(shí)兼具二維培養(yǎng)和部分三維培養(yǎng)的特征。本課題組前期測得，培養(yǎng)在納米纖維表面時(shí)hDPSCs 面積約1 900 μm2，因此本實(shí)驗(yàn)中選取1 800 μm2作為小面積參數(shù)，保證細(xì)胞可完全鋪滿微圖案。同時(shí)，培養(yǎng)在平整表面時(shí)hDPSCs 面積約3 287 μm2，因此本實(shí)驗(yàn)選取3 600 μm2作為大面積參數(shù)。最后，選取二者中間數(shù)2 700 μm2作為中間面積參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

目前有關(guān)成牙本質(zhì)細(xì)胞極化的相關(guān)指標(biāo)較少，本研究根據(jù)成牙本質(zhì)細(xì)胞極化時(shí)的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞器取向、排列的變化，參照前期極化相關(guān)文獻(xiàn)，補(bǔ)充定義了以下6 種極化指標(biāo)。研究[16]認(rèn)為細(xì)胞核重定位是細(xì)胞極化中最先發(fā)生的細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)，Cdc42-MRCK通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白的逆向流動(dòng)，使細(xì)胞核向后移動(dòng)。Fructuoso 等[17]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞極化時(shí)細(xì)胞核位移至近基底側(cè)，核長軸與細(xì)胞遷移軸平行，且細(xì)胞核重定向在細(xì)胞極化和定向遷移中發(fā)揮重要作用。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，隨著肌動(dòng)球蛋白的收縮能力增加，橫跨細(xì)胞核的肌動(dòng)蛋白纖維對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生垂直壓縮力，使細(xì)胞核變得伸長和扁平，由此認(rèn)為在仿成牙本質(zhì)細(xì)胞中，細(xì)胞核面積越大， 且細(xì)胞AR 越大， 細(xì)胞的極化程度越高。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過比較3 種面積的仿成牙本質(zhì)細(xì)胞的極化程度，發(fā)現(xiàn)在3 600 μm2時(shí)細(xì)胞的多項(xiàng)極化指標(biāo)表達(dá)最高，即極化率最高。此外發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核重定向角在3 個(gè)面積間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Maninová 等[19]認(rèn)為細(xì)胞核長軸與遷移方向趨于一致是在核旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)被限制的情況下發(fā)生的，因此推斷可能是由于本實(shí)驗(yàn)中微圖案的寬度較大，對(duì)細(xì)胞核產(chǎn)生的限制效應(yīng)不足以限制核旋轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致核重定向未出現(xiàn)顯著差異。

McBeath 等[20]將人間充質(zhì)干細(xì)胞接種至2 種面積的正方形微圖案中進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)較大面積中細(xì)胞的成骨分化率更高。因此，細(xì)胞的形狀面積可調(diào)控細(xì)胞分化。本研究探究了不同面積仿成牙本質(zhì)細(xì)胞形態(tài)微圖案對(duì)孤立hDPSCs 成牙分化的影響，發(fā)現(xiàn)面積越大，越有利于細(xì)胞分化的發(fā)生，無論是堿性磷酸酶染色陽性率和AOD，還是Col1α1 的MFI，均在3 600 μm2時(shí)表達(dá)最高，即成牙本質(zhì)細(xì)胞分化水平與限域面積密切相關(guān)。

牙發(fā)育中，隨著成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化成熟，極性相關(guān)蛋白的表達(dá)也隨之增加[21]，本課題組前期也證實(shí)了孤立hDPSCs 極化和分化呈現(xiàn)伴行關(guān)系[22]。本實(shí)驗(yàn)中，孤立hDPSCs 極化結(jié)果與分化結(jié)果的趨勢一致，均隨著限域面積增大，細(xì)胞極化和分化水平升高，再次驗(yàn)證了二者的伴行關(guān)系。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（本文編輯 杜冰）