摘要：人血清白蛋白（HSA）是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能及臨床用途。易于儲存、半衰期長且充足、穩(wěn)定的功能性HSA分子供應(yīng)，一直是未被滿足的臨床需求，因此，亟需開發(fā)大規(guī)模生產(chǎn)HSA的替代方法?；蚬こ碳夹g(shù)可將HSA基因克隆到微生物、動物、植物宿主上進(jìn)行高效表達(dá)，為HSA的大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的可能。本文通過對重組HSA（rHSA）在不同表達(dá)系統(tǒng)以及利用異種動物如豬、牛等生產(chǎn)rHSA的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期引發(fā)對基因工程技術(shù)在HSA生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力以及rHSA在未來生物醫(yī)藥領(lǐng)域重要性的關(guān)注。

關(guān)鍵詞：人血清白蛋白；肝疾病；基因工程

基金項目：國家自然科學(xué)基金（U24A20654，82170602）；吉林省中青年科技創(chuàng)新卓越人才項目（20220508079RC）；吉林省自然科學(xué)基金自由探索重點項目（YDZJ202401427ZYTS）；吉林省肝臟代謝重點實驗室（YDZJ202502CXJD002）；國家重點研發(fā)計劃（2024YFE0213800）

The development and application of genetically engineered human serum albumin

GAO Yanhang 1，2，3 ，NIU Junqi 1，2，3

1. Department of Hepatology，The First Hospital of Jilin University，Center of Infectious Diseases and Pathogen Biology，Changchun130021，China；2. Jilin Provincial Key Laboratory of Metabolic Liver Diseases，Jilin University，Changchun 130021，China；3. China-Singapore Belt and Road Joint Laboratory on Liver Disease Research，Changchun 130021，China Corresponding author：NIU Junqi，junqiniu@aliyun.com （ORCID：0000-0002-1696-6008）

Abstract：Human serum albumin （HSA） is the most abundant protein in plasma and has many biological functions and clinical applications. An adequate and stable supply of functional HSA molecules that are easy to store and have a long half-life is still an unmet clinical need. Therefore，it is extremely necessary to develop alternative methods for large-scale production of HSA. Genetic engineering techniques can clone the HSA gene into microorganism，animal，and plant hosts for efficient expression，which provides new possibilities for the large-scale production of HSA. This article reviews the advances in recombinant HSA （rHSA） in different expression systems and the production of rHSA by xenogeneic animals such as pigs and cattle，in order to draw attention to the application potential of genetic engineering techniques in HSA production and the importance of rHSA in the biomedical field in future.

Key words：Human Serum Albumin；Liver Diseases；Genetic Engineering

Research funding：National Natural Science Foundation of China （U24A20654，82170602）；The Project for Middle-aged and Young Excellent Technological Innovation Talents of Jilin Province （20220508079RC）；Natural Science Foundation for Self-Exploration Research of Jilin Province （YDZJ202401427ZYTS）；Jilin Provincial Key Laboratory of Metabolic Liver Diseases（YDZJ202502CXJD002）；National Key Research and Development Program of China （2024YFE0213800）

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，可通過分離人血漿產(chǎn)生。由于血液來自各行各業(yè)的獻(xiàn)血者，此類制劑存在含有病毒或朊病毒污染物的風(fēng)險，對使用者健康構(gòu)成潛在威脅。此外，人體血漿的供應(yīng)也受到多方面因素影響。易于儲存、半衰期長且充足、穩(wěn)定的功能性白蛋白分子供應(yīng)，一直是未被滿足的臨床需求。因此，開發(fā)大規(guī)模生產(chǎn)HSA的替代方法是十分必要的，有利于改善血液和血液制品的短缺問題。重組DNA技術(shù)為生物制藥的大規(guī)模生產(chǎn)提供了新可能，從而無需單一依賴人類血液制品。

通過基因工程技術(shù)將 HSA 基因克隆到微生物、動物、植物宿主上進(jìn)行高效表達(dá)，是一種具有前景的方法。2024年4月，全球首例重組HSA（rHSA）注射液在俄羅斯成功上市，這也是目前唯一上市銷售的rHSA注射液產(chǎn)品，填補(bǔ)了世界生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的空白。這一產(chǎn)品由我國通化安睿特生物制藥股份有限公司自主研發(fā)，筆者團(tuán)隊牽頭完成了Ⅱ、Ⅲ期多中心臨床試驗。

rHSA在不同表達(dá)系統(tǒng)中的研究進(jìn)展表明，酵母和細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)是目前比較成熟的生產(chǎn)方式，尤其是酵母表達(dá)系統(tǒng)，因其高表達(dá)量和相對簡單的提取技術(shù)而具有工業(yè)化潛力。武漢禾元生物科技股份有限公司利用基因工程技術(shù)合成HSA，其核心產(chǎn)品HY1001植物源rHSA注射液（OsrHSA）已完成Ⅲ期臨床試驗。此外，尚有利用異種動物如豬、牛等生產(chǎn)rHSA等。該領(lǐng)域的不斷進(jìn)步將有力提升基因工程技術(shù)在HSA生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力以及rHSA在未來生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要性。

1 HSA的生物學(xué)特性及在慢性肝病中的應(yīng)用

正常情況下，人體總HSA水平為3.5～5.0 g/kgBW，主要通過調(diào)節(jié)白蛋白的合成、分布和降解來維持。HSA的主要臨床用途是維持膠體滲透壓和增加循環(huán)血漿容量，適用于糾正低血容量、燒傷和導(dǎo)致白蛋白丟失的各種疾病，經(jīng)典劑量為每劑超過10 g。

1.1 HSA的合成、分布與降解 HSA的合成屬于自我調(diào)節(jié)，發(fā)生在肝細(xì)胞核糖體中，98%的HSA被釋放，其余被保留。生理條件下，機(jī)體每日可合成10～15 g HSA。在晚期肝病患者中，肝細(xì)胞受損及持續(xù)性炎癥等導(dǎo)致白蛋白合成能力下降，進(jìn)而引發(fā)低白蛋白血癥。

HSA在合成后30 min內(nèi)進(jìn)入血液循環(huán)，約40%停留在血管床內(nèi)，其余則移至血管外，血管內(nèi)外之間的運動被稱為經(jīng)毛細(xì)血管逃逸。經(jīng)毛細(xì)血管逃逸率被用于定義H SA 的有效水平。白蛋白以每小時5%的速率從血漿滲漏到淋巴循環(huán)，以相同的速率（100 mL/h）通過淋巴系統(tǒng)返回。肝硬化伴或不伴腹水患者的門靜脈高壓和內(nèi)皮損傷，白蛋白經(jīng)毛細(xì)血管逃逸翻倍，導(dǎo)致液體潴留、雙下肢浮腫和腹水等。清蛋白激活蛋白是一種糖蛋白60受體，存在于諸多器官（大腦除外）的血管床中，其與 HSA結(jié)合，并在不到13 s的時間內(nèi)將HSA運送到間質(zhì)側(cè)。輸注H SA 的分布取決于受者的血容量和蛋白質(zhì)狀態(tài)。根據(jù)白蛋白經(jīng)毛細(xì)血管逃逸率的不同，擴(kuò)容僅持續(xù)12～24 h。

在健康個體中，HSA的合成和降解處于穩(wěn)定狀態(tài)。半衰期為12.7～18.2 d，降解率約為14 g/d。主要降解部位包括肌肉和皮膚（40%～60%）、肝臟（10%～15%）、腎臟（10%）和胃（10%）。在肝硬化患者中，血管內(nèi)皮受損，導(dǎo)致老化、結(jié)構(gòu)改變或變性的HSA分子堆積，這些分子可長時間停留于循環(huán)中，并可能對機(jī)體產(chǎn)生不利影響［1］。

1.2 HSA的結(jié)構(gòu)與功能 成熟HSA具有585個氨基酸（AA）殘基的單肽鏈，分子量為66.438 kD。HSA是非糖基化的，帶負(fù)電荷，并且具有獨特的35個半胱氨酸（Cys） AA殘基，其中，34個形成二硫鍵以保持穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)，在34位留下一個自由殘基（Cys34殘基），構(gòu)成了血漿中的主要硫醇庫。HSA的晶體結(jié)構(gòu)顯示出3個同源結(jié)構(gòu)域，形成一個心形的三級結(jié)構(gòu)。在危重型肝硬化患者中，該結(jié)構(gòu)隨機(jī)體pH值、溫度、化學(xué)環(huán)境和/或配體相互作用等發(fā)生暫時或永久性改變。

HSA的生理功能大致可以分為膠體滲透壓功能和非膠體滲透壓功能。白蛋白占血液中血漿膠體滲透壓（25～33 mmHg）的 80%，約 2/3 的膠體滲透壓作用與白蛋白的分子質(zhì)量有關(guān)，其余部分與白蛋白的負(fù)電荷有關(guān)。負(fù)電荷吸引帶正電荷的分子（例如Na + ）進(jìn)入血管內(nèi)部，稱為Gibbs-Donnan效應(yīng)［1］。

HSA運輸藥物、金屬陽離子、氣體、難溶于水的分子（膽鹽、膽固醇、脂肪酸、膽紅素等）、激素（類固醇、甲狀腺素）等。由于 HSA分子上酸性殘基與堿性殘基的比例，其表現(xiàn)趨于弱酸性。低白蛋白血癥增加陰離子間隙，進(jìn)而被動增加碳酸氫鹽濃度，導(dǎo)致代謝性堿中毒。HSA具有抗血栓特性，主要與亞硝基白蛋白（HSA-N-O）的形成有關(guān)，HSA-N-O可通過阻止NO的快速失活來增強(qiáng)血小板的抗聚集特性。H SA 還可調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的信號通路和促炎細(xì)胞因子的釋放，抑制補(bǔ)體因子（C5a）的分泌；其內(nèi)化和抑制內(nèi)源Toll樣受體信號并調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。HSA在血管內(nèi)皮穩(wěn)定和維持毛細(xì)血管通透性方面也發(fā)揮重要作用。在高膽紅素血癥和低白蛋白血癥中，一個HSA分子與眾多膽紅素分子結(jié)合，阻止其他配體的結(jié)合；外源性HSA可增加膽紅素結(jié)合能力，減少高膽紅素水平的不良影響［2］。

1.3 HSA在慢性肝病中的應(yīng)用 目前，HSA被認(rèn)為是機(jī)體中重要的抗氧化分子。在以系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激增強(qiáng)為特征的疾?。ㄈ绺斡不┲校瑫l(fā)生HSA的結(jié)構(gòu)和功能損害，HSA構(gòu)象改變對疾病進(jìn)展的影響尚有待探索。 “有效白蛋白濃度”的提出拓寬了對HSA在慢性肝病中應(yīng)用的認(rèn)知，即不僅僅是為了提高HSA水平。近期研究表明，有效白蛋白濃度可有助于肝硬化患者的分層，提高對預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性［3］。

HSA輸注目前用于短期或長期預(yù)防或治療失代償期肝硬化的各種并發(fā)癥，也用于改善生活質(zhì)量。在大量穿刺放液、肝腎綜合征/急性腎損傷、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎、失代償期肝硬化伴腹水中，長期HSA治療獲得了肯定的療效。此外，HSA輸注在高容量性低鈉血癥、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎以外的細(xì)菌感染和肝性腦病中的應(yīng)用也獲得了較為明確的療效［4］。

H SA 長期治療費用昂貴，且不易儲存，易被病原體污染。因此，rHSA作為其替代品是未來的發(fā)展方向，基因工程技術(shù)提供了未來發(fā)展的可能性。

2 基因工程HSA進(jìn)展

rHSA的大規(guī)模生產(chǎn)對重組蛋白生產(chǎn)技術(shù)極具挑戰(zhàn)性。產(chǎn)品極高純度、降低rHSA的單位生產(chǎn)成本以及大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等要求，加大了這一領(lǐng)域的研發(fā)難度。近40年以來，國際上眾多實驗室和公司已陸續(xù)嘗試通過遺傳工程開發(fā)HSA，其基因已被引入細(xì)菌、真菌、植物以及動物中進(jìn)行表達(dá)。

2.1 利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá) rHSA 促進(jìn)非動物源性rHSA的生產(chǎn)，大腸桿菌是最方便的宿主之一。大腸桿菌具有生長迅速、使用廉價以及短時間達(dá)到高細(xì)胞密度的特點，與其他表達(dá)宿主相比，其發(fā)酵過程更經(jīng)濟(jì)，衍生的重組產(chǎn)品具有更大的經(jīng)濟(jì)潛力。目前，利用大腸桿菌作為宿主獲取富含二硫的多結(jié)構(gòu)域蛋白的主要瓶頸是形成過表達(dá)蛋白的聚集體。大部分表達(dá)的rHSA在大腸桿菌胞漿中形成包涵體（占總表達(dá)量的90%以上）。從包涵體中恢復(fù)有功能的rHSA不可取，獲取像rHSA這樣富含多結(jié)構(gòu)域二硫鍵天然形式的有功能大分子蛋白質(zhì)十分困難，凈化過程繁瑣、耗時、費力且費用昂貴。由于上述限制，大腸桿菌宿主系統(tǒng)在過去的幾十年中，在rHSA基因工程生產(chǎn)領(lǐng)域未能得到足夠的重視。

近期，有研究利用大腸桿菌作為宿主的能力來增強(qiáng)rHSA的功能性生產(chǎn)，通過優(yōu)化細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、溫度、誘導(dǎo)類型、誘導(dǎo)持續(xù)時間、細(xì)胞裂解條件等參數(shù)，提高所需蛋白在體內(nèi)的天然形式的生產(chǎn)水平。同時，研究還探索了不同類型的外源伴侶系統(tǒng)對rHSA在大腸桿菌宿主系統(tǒng)中的功能表達(dá)的影響。通過上述改進(jìn)，大腸桿菌宿主系統(tǒng)展現(xiàn)出快速生長、發(fā)酵成本低、可擴(kuò)展的特性，作為微生物工廠，可用于增強(qiáng)rHSA的功能性生產(chǎn)［5］。

為進(jìn)一步克服在大腸桿菌中產(chǎn)生功能性rHSA的難題，有研究通過對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊的生物系統(tǒng)進(jìn)行工程改造，純化了大腸桿菌衍生的rHSA。通過監(jiān)測其構(gòu)象性質(zhì)、二級和三級結(jié)構(gòu)元素、表面性質(zhì)、配體結(jié)合性質(zhì)、穩(wěn)定性等問題，對其進(jìn)行詳細(xì)的物理化學(xué)表征，并將上述參數(shù)與天然存在的人源蛋白進(jìn)行比較，結(jié)果提示，重組蛋白與天然蛋白完全相同［6］。

大分子量和較高二硫化物含量阻礙了細(xì)菌宿主對rHSA的表達(dá)和產(chǎn)生。有研究采用融合技術(shù)和工程大腸桿菌菌株的策略來提高可溶性rHSA在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)。在Origami 2中表達(dá)的人蛋白二硫異構(gòu)酶（PDIb'a'）和麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)記的rHSA b'a'結(jié)構(gòu)域，在18 °C下的溶解度分別顯著提高了90.1%和96%。通過建立簡單有效的rHSA純化方案，成功地從500 mL純度為97%的培養(yǎng)物中獲得約9.46 mg rHSA。rHSA主要以可溶性低聚物形式獲得，進(jìn)一步通過引入簡單的重折疊和排粒徑層析步驟，以34%的回收率獲得了單體rHSA。天然聚丙烯酰胺凝膠電泳證實了大腸桿菌衍生的單體rHSA與商業(yè)單體HSA在分子量上的相似性［7］。

2.2 利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)rHSA 真核生物中應(yīng)用最廣泛的是酵母表達(dá)系統(tǒng)。用低等真核生物酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因，可將基因工程產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基內(nèi)。培養(yǎng)基內(nèi)是氧化環(huán)境，有利于二硫鍵形成以及表達(dá)出天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。

利用甲基營養(yǎng)型酵母畢赤酵母已成功生產(chǎn)出rHSA。為提高rHSA在畢赤酵母中的產(chǎn)量，已有研究小組建立了一種優(yōu)化的補(bǔ)料分批重復(fù)發(fā)酵方法。通過建立分批補(bǔ)料發(fā)酵的仿真模型，采用動態(tài)規(guī)劃法計算5個不同補(bǔ)料周期的最優(yōu)甲醇補(bǔ)料策略。從計算結(jié)果中收集必要的狀態(tài)變量，用于進(jìn)一步優(yōu)化重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵。利用預(yù)先收集的狀態(tài)變量，研究最優(yōu)操作策略。結(jié)果表明，第2次補(bǔ)料分批發(fā)酵初始細(xì)胞質(zhì)量為35或40 g，甲醇加料時間為 264 h。采用最優(yōu)操作策略重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵時，實際培養(yǎng)體積與模型方程模擬值吻合較好，但 rHSA 產(chǎn)量存在一定差異。這項研究確定的重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵的最佳策略（即4次重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵）可使 rHSA 年產(chǎn)量增加 47%。即使在簡單（不重復(fù)）補(bǔ)料分批發(fā)酵中，培養(yǎng)周期的優(yōu)化也使 rHSA 年產(chǎn)量增加28%［8］。

通過流水線技術(shù)純化的 rHSA 與血漿來源的 HSA（pdHSA）相同，未檢測到來自畢赤酵母的甘露聚糖成分。rHSA的結(jié)構(gòu)和功能特性與pdHSA相似。臨床前和臨床試驗證實了該rHSA制劑在不同疾病情況下的安全性和有效性，如失血性休克、肝硬化合并腹水以及其他與血漿容量和膠體滲透壓相關(guān)的危重臨床情況［9］。

近期，有團(tuán)隊通過基因工程技術(shù)提高畢赤酵母中重組蛋白的分泌滴度。研究者通過刪除不需要的內(nèi)源性蛋白，細(xì)胞資源可以從生產(chǎn)內(nèi)源性蛋白重新定向分配至生產(chǎn)重組蛋白。通過質(zhì)譜分析和信號肽預(yù)測，發(fā)現(xiàn)一組內(nèi)源性分泌蛋白，而這組蛋白受到必需基因的調(diào)控。為了預(yù)測必需基因，研究者設(shè)計、轉(zhuǎn)化并測序了一個引導(dǎo)RNA文庫，用于CRISPR-cas9介導(dǎo)的所有內(nèi)源性分泌蛋白的敲除；利用預(yù)測基因必要性來指導(dǎo)多達(dá)11個非必需基因的迭代破壞。工程菌株的HSA產(chǎn)量增加了20倍。結(jié)果表明，只要破壞6個基因即可增加重組蛋白的產(chǎn)量，進(jìn)一步降低畢赤酵母菌的內(nèi)源蛋白質(zhì)可進(jìn)一步提高菌株的性能［10］。

來自食品級表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)可用于食品和醫(yī)療實踐。以乳酸克魯維酵母GG799為宿主對HSA進(jìn)行分泌表達(dá)。以pPIC9k-HSA為模板，采用帶有XhoⅠ和NotⅠ酶切位點的引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增獲得HSA基因，經(jīng) XhoⅠ和 NotⅠ雙酶切后插入 pKLAC1，構(gòu)建表達(dá)載體pKLAC1-HSA。經(jīng)SalⅡ線性化后，轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799，用含5 mmol/L乙酰胺的YCB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取基因組DNA，采用PCR對轉(zhuǎn)化子鑒定后進(jìn)行發(fā)酵。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及 Western Blot分析發(fā)酵上清液中的表達(dá)產(chǎn)物，并初步分析酵母基礎(chǔ)N源（YNB）對rHSA在乳酸克魯維酵母GG799中表達(dá)的影響。結(jié)果表明，rHSA成功在乳酸克魯維酵母GG799中分泌表達(dá)，表達(dá)量為81 μg/mL，遺傳穩(wěn)定性好。

將URA3缺失菌株與無耐藥選擇的質(zhì)粒載體結(jié)合，可作為乳酸克盧維酵母表達(dá)載體的一步構(gòu)建方法。通過與特殊的重組酶反應(yīng)，以靶向方式組裝載體的鄰近DNA元件，形成質(zhì)粒載體。去除不需要的含有pUC來源和氨芐西林耐藥基因的片段，分離純化轉(zhuǎn)化前的載體。PCR、測序和Western Blot分析均表明載體構(gòu)建和rHSA表達(dá)方法是成功的。該方法適用于任何含有URA3基因的物種，該系統(tǒng)有望成為促進(jìn)食品安全物種中蛋白質(zhì)表達(dá)的安全而有力的工具［11］。

釀酒酵母是一種廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞工廠。提高酵母菌的蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力將有利于獲得重組蛋白作為產(chǎn)品或發(fā)揮其在強(qiáng)化生物加工中的能力。異源蛋白的表達(dá)通常會對細(xì)胞施加壓力，提高細(xì)胞應(yīng)對壓力的能力可以提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。HAC1 是未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。有研究者選擇與UPR信號通路相關(guān)的幾個基因，包括未折疊蛋白傳感、HAC1 mRNA剪接、mRNA連接、mRNA衰變、翻譯和HAC1p降解，作為改造酵母菌的靶點。最終，工程菌株 rHSA 的產(chǎn)量達(dá)到對照菌株的 15.3 倍。結(jié)果表明，對UPR關(guān)鍵節(jié)點HAC1相關(guān)基因進(jìn)行細(xì)胞工程處理可顯著增加蛋白分泌，遺傳修飾為構(gòu)建酵母細(xì)胞工廠以高效生產(chǎn)蛋白質(zhì)提供了有用的靶點［12］。

白蛋白在肝臟合成后進(jìn)入體循環(huán)，會經(jīng)歷氧化、糖基化、氨基酸缺失及聚合等老化修飾，導(dǎo)致有效成分下降。重組白蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)時會發(fā)生糖基化，生產(chǎn)過程中也可能產(chǎn)生聚合、氧化等修飾，這些修飾會降低其與配體的結(jié)合能力，并可能引發(fā)免疫原性。血漿提取的人血清白蛋白約有40%在體內(nèi)老化，而酵母表達(dá)的重組白蛋白結(jié)構(gòu)與天然白蛋白高度相似（gt;90%），因此在結(jié)構(gòu)和體外藥效學(xué)上優(yōu)于人血清白蛋白。

2.3 利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)rHSA 為了確定植物細(xì)胞培養(yǎng)是否可以提供替代來源，有研究小組利用豇豆花葉病毒蛋白表達(dá)系統(tǒng)（CPMV-HT）在煙草Bright Yellow-2（BY-2）細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)rHSA。rHSA在培養(yǎng)基中穩(wěn)定生成，產(chǎn)量高達(dá) 11.88 g/mL，占可溶性蛋白總量的 0.7%。在 pH值為8.0的改良Murashige和Skoog培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，rHSA的產(chǎn)量提高了2倍。研究者自行開發(fā)簡單的純化方案，從培養(yǎng)基中純化 rHSA，使分泌的 rHSA回收率達(dá)到48.41%?；|(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜分析和N端序列分析表明，植物細(xì)胞源性rHSA與血漿源性HSA相同。結(jié)果表明，CPMV-HT系統(tǒng)可以用于在轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞中高水平表達(dá)rHSA［13］。

禾元生物自主研發(fā)的國際領(lǐng)先植物重組蛋白表達(dá)與純化技術(shù)平臺成功解決了rHSA的純度、規(guī)?；统杀締栴}。利用水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器高效重組蛋白表達(dá)平臺OryzHiExp和重組蛋白純化技術(shù)平臺OryzPur，高效表達(dá)各種醫(yī)藥蛋白，利用較為簡單的工藝獲得高純度，高活性，低宿主蛋白和核酸殘留的高純化重組蛋白，且能實現(xiàn)從毫克級到千克級，乃至噸級的不同蛋白質(zhì)純化規(guī)?；a(chǎn)。植物源rHSA注射液（OsrHSA，HY1001）是利用水稻胚乳細(xì)胞表達(dá)，經(jīng)提取、純化的rHSA產(chǎn)品并經(jīng)臨床Ⅰ期研究結(jié)果證明OsrHSA具有良好的安全性和耐受性。筆者團(tuán)隊牽頭完成了該產(chǎn)品的Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗。在Ⅱ期試驗中，達(dá)到主要臨床研究終點；在Ⅲ期臨床試驗中，療效不劣于對照HSA，安全性良好。

2.4 利用轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)rHSA 在諸多情況下，對大型家養(yǎng)動物進(jìn)行精確的基因組修飾是可行的。有研究利用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶和11.5 kb的HSA小基因供體構(gòu)建物共同轉(zhuǎn)染純種牛成纖維細(xì)胞，用于同時破壞和取代牛血清白蛋白在肝臟和牛奶中的表達(dá)，并控制rHSA的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞中，HSA基因的靶向整合率約為11%，利用體細(xì)胞核移植從目標(biāo)成纖維細(xì)胞中獲得了轉(zhuǎn)基因牛胚胎。該研究為下一代轉(zhuǎn)基因rHSA牛奠定了基礎(chǔ)，有望作為大規(guī)模、可靠和質(zhì)量控制的rHSA來源［14］。

尚有研究將人白蛋白cDNA敲入豬白蛋白基因座以生產(chǎn)rHSA，結(jié)果顯示，同源重組可在豬受精卵中高效發(fā)生。經(jīng)過處理的受精卵所生仔豬（n=16）均攜帶預(yù)期的敲入蛋白等位基因，并進(jìn)一步證實其血液中存在人白蛋白。此外，敲入等位基因成功通過種系傳播。綜上所述，將豬和其他大型家養(yǎng)動物作為生物反應(yīng)器的更多研究探索，對推進(jìn)生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)及更理想性狀牲畜品種的選育具有重要意義［15］。

3 結(jié)語

HSA是臨床常用藥物，目前仍以傳統(tǒng)方法從人血漿中分離。國內(nèi)生產(chǎn)供不應(yīng)求，尚有部分缺口依賴國外進(jìn)口?；蚬こ蘃SA具有純度更高、無動物組分、無病毒殘留等優(yōu)勢，隨著HSA供需矛盾的加劇和質(zhì)量控制要求的提高，其市場前景十分廣闊，同時也需要接受未來更多臨床實踐的檢驗。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：高沿航負(fù)責(zé)論文設(shè)計，擬定寫作思路，撰寫論文；牛俊奇指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2025-01-13；錄用日期：2025-02-01

本文編輯：邢翔宇

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