［摘 要］ 為了增強(qiáng)酵母對香草醛的耐受性，并探究其潛在機(jī)理，以Starmerella bacillaris R5為研究對象，評估外源組氨酸的添加對R5菌株香草醛耐受情況的影響，并進(jìn)一步通過酵母測定胞內(nèi)的過氧化氫、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，以及細(xì)胞膜的通透性和胞內(nèi)活性氧的變化，來揭示組氨酸對提高酵母香草耐受性的機(jī)理。結(jié)果表明，添加組氨酸可縮短R5菌株的生長延滯期，提高其對香草醛的耐受性。具體而言，胞內(nèi)過氧化氫含量降低79.37%， SOD酶活性提升17.78% ，而CAT酶活性提高1405倍。此外，PI 染色的細(xì)胞數(shù)目降低了 79.17%，ROS 染色細(xì)胞數(shù)降低了 48.89%。這說明組氨酸的添加能夠減少菌株胞內(nèi)活性氧含量和降低氧化脅迫，有效提高了Starmerella bacillaris R5對香草醛的耐受性。

［關(guān)鍵詞］ 組氨酸； 香草醛； Starmerella bacillaris； 耐受性； 乙醇生產(chǎn)

［中圖分類號］ TS7 ［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］ A

生物乙醇因其可持續(xù)、可再生、易于生產(chǎn)和無毒性的優(yōu)勢，被視為化石燃料最理想的替代品[1]。而木質(zhì)纖維原料在預(yù)處理過程中，會(huì)產(chǎn)生包括香草醛在內(nèi)的酚類化合物、糠醛等呋喃醛化合物和乙酸等有機(jī)酸。這些物質(zhì)會(huì)抑制酵母的生長[2]。香草醛屬于含愈創(chuàng)木基的酚類化合物，即使在低濃度條件下也可對釀酒酵母產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，常被作為研究酚類化合物對酵母影響的代表性物質(zhì)。香草醛可以通過氧化反應(yīng)引起細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]，導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子發(fā)生氧化損傷[4]；它還能抑制細(xì)胞翻譯進(jìn)程，造成大量未被翻譯的mRNA與信使核蛋白積累，形成細(xì)胞質(zhì)加工小體和脅迫斑粒 [5-6]。此外，香草醛還能引發(fā)細(xì)胞凋亡反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和功能障礙，對細(xì)胞的生長和發(fā)育產(chǎn)生不利影響。

目前，提高酵母香草醛耐受性方法主要有基因工程改造和適應(yīng)性進(jìn)化[7-10]，這些方法雖取得了一定的進(jìn)展，但都需要長時(shí)間的實(shí)驗(yàn)觀察，且基因工程可能會(huì)使酵母失去其原有的優(yōu)良特性。而向培養(yǎng)基中添加保護(hù)劑的方法不僅可以縮短實(shí)驗(yàn)周期，還不會(huì)損害酵母原有特性。氨基酸作為微生物生長發(fā)育不可或缺的物質(zhì)，不僅作為氮源，一些生糖氨基酸起到了保護(hù)作用[11-15]，且易于透過生物膜的短肽被吸收利用，減少能量消耗。然而，關(guān)于通過添加氨基酸來提高酵母對香草醛耐受性的研究尚未見報(bào)道。

Starmerella bacillaris是一種非釀酒酵母菌，常用于葡萄酒釀造，也是本實(shí)驗(yàn)室從梨子表面篩選得到的一種耐高糖酵母。在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究旨在探究組氨酸對Starmerella bacillaris在香草醛脅迫下的生長延滯期和乙醇產(chǎn)量的影響，并通過測定酵母胞內(nèi)過氧化氫和過氧化氫酶、超氧化物歧化酶，以及細(xì)胞膜通透性及胞內(nèi)活性氧的變化，揭示組氨酸提高酵母對香草耐受性的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌種保藏方法

Starmerella bacillaris R5，實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 耐香草醛能力測定

菌種保藏斜面培養(yǎng)基：10 g/L酵母浸粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，20 g/L瓊脂，115℃滅菌20 min。

在YEPD培養(yǎng)基中加入不同濃度的香草醛（0、1.0、2.0、3.0 g/L），研究香草醛對Starmerella bacillaris R5的潛在影響。

評估在香草醛脅迫（3.0 g/L）條件下，不同濃度組氨酸（0 、100、500、1000 mg/L）對Starmerella bacillaris R5的保護(hù)效果。

采用DNS法測定葡萄糖的含量，使用生物傳感器檢測乙醇的含量。

1.3 胞內(nèi)過氧化氫含量、過氧化氫酶活、超氧化物歧化酶活的測定

1）過氧化氫含量

n（H2O2）=10×（ΔA測定管 -ΔA空白管）÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)管 -ΔA空白管）

2）過氧化氫酶活力

式中：271為斜率倒數(shù)，常數(shù)，直接使用；V樣為取樣量，0.1 mL；T為反應(yīng)時(shí)間，60 s；N為樣本測試前稀釋倍數(shù)。

3）超氧化物歧化酶活力

ASOD=（A）對照-A對照空白）-（A測定-A測定空白）A對照-A對照空白×100%÷50%×反應(yīng)體系0.24 mL稀釋倍數(shù)0.02 mL

1.4 細(xì)胞膜通透性和胞內(nèi)活性氧含量檢測

細(xì)胞膜完整性的測定，使用流式細(xì)胞儀（Becton- Dickinson）監(jiān)測釀酒酵母在香草醛脅迫和組氨酸補(bǔ)充下的生理應(yīng)激反應(yīng)。碘化丙啶（PI）用于監(jiān)測膜完整性，2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFDA）用于測定ROS的積累。

1.5 數(shù)據(jù)處理

研究中所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，以確保結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式，以準(zhǔn)確反映數(shù)據(jù)的集中趨勢和離散程度。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖形表示是通過使用OriginPro 2019b軟件（Northampton， MA， USA）和FlowJo_V10軟件精心繪制的。這些工具數(shù)據(jù)處理和圖形繪制功能強(qiáng)大，便于觀察和分析數(shù)據(jù)趨勢。

2 結(jié)果與討論

2.1 香草醛對Starmerella bacillaris R5菌株的生長及產(chǎn)乙醇的影響

圖1為R5菌株在不同香草醛濃度下的生長曲線，可以看出香草醛對R5菌株的生長有明顯的抑制作用。當(dāng)香草醛濃度為3 g/L時(shí)，菌株延滯期最長約為60 h；而在4 g/L香草醛濃度下，菌株沒有生長跡象。說明香草醛濃度越大，對R5菌株的抑制效果越強(qiáng)，這與前期關(guān)于抑制物影響釀酒酵母生長的結(jié)果一致：5 mmol/L的香草醛對葡萄糖消耗和乙醇產(chǎn)率具有顯著抑制作用，與對照組相比，發(fā)酵8 h時(shí)分別下降31.4%和29.8%；當(dāng)香草醛濃度為30 mmol/L時(shí)，細(xì)胞生長被完全抑制[16]。

圖2a為R5菌株在不同香草醛濃度下的糖耗曲線。由圖可得，香草醛濃度越大，細(xì)胞開始消耗葡萄糖的時(shí)間越遲，對酵母細(xì)胞的生理活動(dòng)影響越大，這與前期生長曲線的結(jié)果一致。圖2b為R5菌株在不同香草醛濃度下最高乙醇產(chǎn)量柱狀圖，空白組（香草醛濃度0 g/L）最高乙醇產(chǎn)量6.06 g/L，且乙醇的最大產(chǎn)量隨著香草醛濃度增加而減少。

結(jié)合生長曲線和糖耗曲線得出，低濃度香草醛對R5菌株影響較小，高濃度表現(xiàn)出明顯的抑制效果，3 g/L香草醛對R5菌株的抑制作用較大。

2.2 組氨酸對R5菌株耐受香草醛的影響

在3 g/L香草醛脅迫下，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的組氨酸，分析添加組氨酸對R5菌株香草醛耐受性的影響。

圖3a為R5菌株在添加不同濃度組氨酸 （3 g/L香草醛） 的培養(yǎng)基中生長的情況。 在3 g/L香草醛濃度下， 添加組氨酸后的 R5 菌株， 其延滯期明顯縮短， 分別縮短了 8 h（100 mg/L）、 26 h（500 mg/L）、 28 h（1000 mg/L）、 28 h（1500 mg/L）。 因此， 向培養(yǎng)基中添加一定濃度的組氨酸， 可以有效提高酵母細(xì)胞對香草醛的耐受性， 促進(jìn)酵母細(xì)胞的生長發(fā)育。

圖3b為3 g/L香草醛濃度下，向培養(yǎng)基中添加不同濃度組氨酸后R5菌株的糖耗曲線。分析曲線得出，葡萄糖的消耗與生長曲線的趨勢基本一致，即延滯期葡萄糖的消耗速度很慢，30 h內(nèi)只消耗了4 g/L左右的葡萄糖，且添加不同濃度的氨基酸對前期糖耗影響不大。中后期（30～48 h）葡萄糖消耗速率相差較大，500、1000和1500 mg/L在48 h左右葡萄糖消耗殆盡。

圖3c描繪了在 3 g/L 香草醛濃度下，組氨酸對R5菌株在香草醛脅迫下產(chǎn)乙醇能力的影響?？梢悦黠@看出，當(dāng)組氨酸濃度為500" mg/L 時(shí)，其最大乙醇產(chǎn)量僅為 2.39 g/L。這一現(xiàn)象可能歸因?yàn)槠咸烟谴x通路中轉(zhuǎn)化為乙醇的分支酶活性受到抑制，這一點(diǎn)還需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。與對照組（3 g/L 香草醛+0 mg/L組氨酸）相比，100 mg/L 組氨酸的處理使乙醇產(chǎn)量提高了15%。

前期研究表明，當(dāng)額外添加500和1000 mg/L脯氨酸時(shí)，在混合抑制劑（糠醛、乙酸和苯酚）脅迫下，延滯期沒有明顯縮短，生物量略有提高；而添加1500 mg/L脯氨酸后，延滯期縮短12 h，顯著提高了菌株對混合抑制劑的耐受性。另外，添加1000 mg/L肌醇能將延滯期縮短了20 h，展現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢[19]。這些結(jié)果與本文的發(fā)現(xiàn)基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了組氨酸的加入對于提高酵母的香草醛耐受性，優(yōu)勢更加明顯。

2.3 組氨酸提高R5菌株香草醛耐受性的機(jī)理

2.3.1 酵母細(xì)胞內(nèi)過抗氧化系統(tǒng)分析 超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體超氧自由基清除因子，能夠催化超氧負(fù)離子和氫離子的反應(yīng)，生成過氧化氫和水。過氧化氫是對機(jī)體有害的活性氧，需要在過氧化氫酶作用下繼續(xù)分解為完全無害的水。前期研究表明，經(jīng)過3 h香草醛處理的熱帶假絲酵母樣品中，過氧化物酶基因和超氧化物歧化酶基因呈現(xiàn)上調(diào)的表達(dá)情況。這說明在香草醛處理過程中，細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶系統(tǒng)在清除自由基方面起到了關(guān)鍵作用[20]。為進(jìn)一步解析組氨酸提高酵母R5香草醛耐受性的機(jī)理，分別測定了對數(shù)生長期的前期酵母胞內(nèi)抗氧化酶活及過氧化氫的含量。

胞內(nèi)超氧化物歧化酶活的結(jié)果 （圖4a） 可以清晰看出，相較對照組，培養(yǎng)基中添加組氨酸的R5菌株在前期胞內(nèi)外超氧化物歧化酶含量有所提高，在添加100 mg/L組氨酸條件下，胞內(nèi)SOD含量提高了17.78% ；添加1000 mg/L 組氨酸條件下，胞內(nèi)SOD含量提高了13.45% 。圖4b可以明顯看出添加100 mg/L組氨酸條件下，胞內(nèi) CAT 酶活提高了388倍；添加1000 mg/L 組氨酸條件下，胞內(nèi)CAT酶活提高了1405倍。這說明組氨酸可以通過提高酵母的抗氧化性能來增強(qiáng)菌株的香草醛耐受性。

圖4c清晰展示了 R5 菌株在3 g/L香草醛脅迫下對數(shù)生長期前期胞內(nèi)過氧化氫含量的變化。圖中可見，對照組R5菌株在對數(shù)生長期前期胞內(nèi)過氧化氫含量較高。與對照組相比，添加組氨酸的R5菌株胞內(nèi)外過氧化氫含量明顯降低。具體而言，在添加100 mg/L組氨酸條件下，胞內(nèi)過氧化氫含量減少了35.41%；而在添加1000 mg/L 組氨酸條件下，胞內(nèi)過氧化氫含量更是減少了79.37%。這些結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組R5菌株受到的氧化脅迫小于對照組，即添加組氨酸通過減少酵母胞內(nèi)的氧化脅迫，有效提高了菌株對香草醛的耐受性。

2.3.2 組氨酸對R5在香草醛脅迫下細(xì)胞膜和活性氧水平的影響 酚類化合物可以改變酵母細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[21]，為了解析組氨酸提高R5香草醛耐受性的機(jī)制，對比了在香草醛脅迫下不同濃度組氨酸加入后細(xì)胞膜通透性的變化。圖5為R5菌株于對數(shù)生長期前期，在3 g/L香草醛脅迫下添加不同濃度組氨酸后的碘化丙啶（PI）染色圖。細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜通透性增大，使得PI染料能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并插入DNA分子中。由圖可得，在3 g/L香草醛脅迫下，實(shí)驗(yàn)組菌株染色細(xì)胞比例低于對照組菌株，實(shí)驗(yàn)組菌株P(guān)I染色分別為1.07%和0.27%，表明這部分細(xì)胞失去活性，相對于對照組菌株1.3%而言，死亡細(xì)胞比例減少，即細(xì)胞死亡率有所下降，說明添加組氨酸可提高酵母細(xì)胞膜的完整性，增強(qiáng)了對香草醛的耐受性。這一機(jī)制與麥角甾醇通過提高釀酒酵母細(xì)胞膜的完整性而增強(qiáng)其糠醛耐受性的機(jī)理相似[1]。

先前的研究結(jié)果揭示，香草醛可以觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的ROS積累，并且這種積累與香草醛濃度呈劑量依賴關(guān)系。香草醛所引發(fā)的氧化損傷進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體的斷裂和片段化[3]。

圖6展示了 R5 菌株在3 g/L香草醛脅迫下對數(shù)生長期前期， 添加不同濃度組氨酸后的 ROS 染料 （2， 7-二氯熒光素二乙酸酯） 染色情況。 活性氧， 包括超氧陰離子、 過氧化氫、 羥自由基等， 是細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中具有高度反應(yīng)性的氧分子， 過量的活性氧會(huì)對細(xì)胞造成損害， 與細(xì)胞內(nèi)的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)， 導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能的改變。 因此， 細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平能體現(xiàn)出細(xì)胞受到自由基損傷的情況。

由圖6a可見，在香草醛（3 g/L）脅迫下，實(shí)驗(yàn)組菌株的活性氧含量有所降低，對照組菌株ROS染色比例為 1.35%，而實(shí)驗(yàn)組菌株ROS染色比例分別為0.82%和0.69%，說明添加了組氨酸后，胞內(nèi)活性氧含量降低，從而增強(qiáng)對香草醛的耐受性。這一發(fā)現(xiàn)與前述抗氧化體系及過氧化氫的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究以香草醛作為生物質(zhì)預(yù)處理液中的抑制劑，模擬脅迫環(huán)境，以Starmerella bacillaris R5 為研究對象，探討添加組氨酸對其香草醛耐受性的影響。研究結(jié)果表明，添加組氨酸能夠提高R5菌株對高濃度香草醛（3 g/L）的耐受性，特別是添加1000 mg/L組氨酸時(shí)，可縮短28 h的生長延滯期。與對照組菌株相比，實(shí)驗(yàn)組菌株胞內(nèi)過氧化氫含量降低，SOD和CAT酶活提高。另外，添加組氨酸后，菌株細(xì)胞膜通透性有所降低，胞內(nèi)活性氧含量減少?？偟膩碚f，添加組氨酸能緩解香草醛的氧化脅迫響應(yīng)，提高R5細(xì)胞對香草醛的耐受性，并在一定程度上能縮短生長延滯期。

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The Effect of Histidine on the Tolerance ofStarmerella Bacillis R5 to Vanillin

WANG Rui1，YAO Lan2，YANG Haitao1

（1" School of Material and Chemistry Engineering， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China;2 School of Biological Engineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China）

Abstract： The development of renewable energy can reduce the dependence of human society on fossil fuels. Bioenergy， which is renewable， has received increasing attention in recent years. At present， the inhibitors generated during biomass pretreatment， especially vanillin， could inhibit yeast growth and reduce ethanol productivity. In order to improve the tolerance of yeast to vanillin， this study was focused on Starmerella bacilli R5. Furthermore， different concentrations of histidine on the tolerance of R5 strain to vanillin and the underlying mechanism was investigated by comparing intracellular hydrogen peroxide， catalase， SOD， cell membrane permeability， and reactive oxygen species. The results showed that adding of histidine could enhance the tolerance of R5 strains to high concentrations of vanillin by reducing lag phase. Compared with the control group， adding histidine showed a 79.37% decrease in intracellular hydrogen peroxide content， an increase in SOD enzyme activity of 17.78%， and a 1405 fold increase in CAT enzyme activity. The number of cells stained with PI decreased by 79.17%， while the number of cells stained with ROS decreased by 48.89%. The results indicate that the addition of histidine can reduce the intracellular reactive oxygen species content of the strain and reduce oxidative stress to increase vanillin tolerance of Starmerella bacilli R5.

Keywords： histidine; Vanillin; Starmerella bacillis; tolerance; ethanol production

［責(zé)任編校： 張 眾］

［收稿日期］ 2023-08-08

［基金項(xiàng)目］ 湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（D20211404），湖北省中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目（T2022011）

［第一作者］ 王 睿（1999-）， 女， 湖北黃岡人， 湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生， 研究方向?yàn)樯镔|(zhì)資源工程。

［通信作者］ 楊海濤（1979-）， 男， 湖北廣水人， 湖北工業(yè)大學(xué)教授， 研究方向?yàn)樯镔|(zhì)資源工程及木質(zhì)素化學(xué)。