收稿日期：2024-07-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFD1400100、2021YFD1400103）

作者簡(jiǎn)介：侯雨萌（2000-），女，天津人，碩士研究生，主要從事玉米矮花葉病毒的研究；（E-mail）2192494895@qq.com。趙振興為共同第一作者。

通訊作者：張永江，（E-mail）zhangyjpvi@yeah.net；周 濤，（E-mail）taozhousig@163.com

摘要： 玉米矮花葉病毒（Maize dwarf mosaic virus，MDMV）是一種重要的檢疫性病毒，嚴(yán)重影響玉米的生產(chǎn)。為了有效防治玉米矮花葉病，本研究基于反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（RT-RAA）技術(shù)和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)構(gòu)建了一種MDMV快速檢測(cè)方法，將所有試劑集中在一個(gè)試管中進(jìn)行反應(yīng)，并通過(guò)側(cè)向流動(dòng)試紙條（LFD）檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果。本研究篩選得到的最佳反應(yīng)條件為，引物添加量2.8 μL、FB報(bào)告分子濃度100 nmol/L、RT-RAA系統(tǒng)反應(yīng)時(shí)間20 min、CRISPR/Cas12a系統(tǒng)反應(yīng)時(shí)間20 min。本研究構(gòu)建的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，且所用試驗(yàn)材料方便攜帶和運(yùn)輸，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞： 玉米矮花葉病毒；反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（RT-RAA）技術(shù)；CRISPR/Cas12a；側(cè)向流動(dòng)試紙條

中圖分類號(hào)： S513"" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A"" 文章編號(hào)： 1000-4440（2025）02-0268-08

A one-tube rapid detection method for maize dwarf mosaic virus based on RT-RAA and CRISPR/Cas12a

HOU Yumeng^1，2， ZHAO Zhenxing¹， WANG Siyuan¹， DONG Zheng¹， HU Zhongze³， ZHOU Tao²， ZHANG Yongjiang¹

（1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100176， China；2.College of Plant Protection， China Agricultural University， Beijing 100193， China；3.Taizhou Institute of Agricultural Sciences， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Taizhou 225300， China）

Abstract： Maize dwarf mosaic virus （MDMV） is an important quarantine virus that seriously affects maize production. To effectively prevent and control maize dwarf mosaic disease， this study constructed a rapid detection method for MDMV based on reverse transcription-recombinase aided amplification （RT-RAA） technology and the CRISPR/Cas12a system. All reagents were reacted in a single test tube， and the reaction results were detected by lateral flow dipstick （LFD）. The optimal reaction conditions screened in this study were as follows： primer addition amount of 2.8 μL， FB reporter molecule concentration of 100 mol/L， RT-RAA system reaction time of 20 minutes， and CRISPR/Cas12a system reaction time of 20 minutes. The one-tube rapid detection method for maize dwarf mosaic virus based on RT-RAA and CRISPR/Cas12a constructed in this study has strong specificity， high sensitivity， and the experimental materials used are convenient for carrying and transportation， making it suitable for on-site detection.

Key words： maize dwarf mosaic virus； reverse transcription-recombinase aided amplification （RT-RAA） technology；CRISPR/Cas12a；lateral flow dipstick

玉米是全球重要糧食作物，種植面積廣泛，被用于食品、醫(yī)療、化工等多個(gè)領(lǐng)域。美國(guó)是全球最大的玉米生產(chǎn)國(guó)，中國(guó)位居第2^[1]。近年來(lái)，玉米產(chǎn)業(yè)在產(chǎn)量、質(zhì)量和種植面積等方面均有顯著提升。玉米常年遭受病毒的侵染，嚴(yán)重威脅其安全生產(chǎn)。玉米矮花葉病是玉米常見(jiàn)的病害之一，會(huì)導(dǎo)致玉米產(chǎn)量和質(zhì)量下降，引起該病的主要病毒包括甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）、玉米矮花葉病毒（Maize dwarf mosaic virus，MDMV），這兩種病毒引起的癥狀相似，難以區(qū)分^[2]。目前有關(guān)檢測(cè)MDMV的研究相對(duì)較少，因此，建立一種簡(jiǎn)捷、高效、快速的MDMV檢測(cè)技術(shù)尤為重要。

玉米矮花葉病毒屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），是一種重要的檢疫性病毒。MDMV是一種正義單鏈RNA病毒^[3]，僅寄生于禾本科植物，可侵染玉米、甘蔗等十余種農(nóng)作物及草本植物，其中約翰遜草受害最嚴(yán)重^[4-5]，石茅是MDMV田間的長(zhǎng)期毒源^[6]。MDMV傳播方式多樣，包括汁液傳播和種子傳播等。MDMV主要通過(guò)蚜蟲(chóng)在田間進(jìn)行非持久性傳播^[7]。MDMV傳播速度快，侵染玉米后在植株內(nèi)迅速移動(dòng)，導(dǎo)致植株在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)矮化、葉片褪綠和生長(zhǎng)受阻等癥狀，最終造成玉米減產(chǎn)20%以上，甚至絕產(chǎn)^[8-10]。MDMV主要分布在在美國(guó)、加拿大、匈牙利、西班牙、約旦、捷克和波蘭等國(guó)家^[11-15]，中國(guó)南方海關(guān)曾多次在阿根廷運(yùn)輸?shù)街袊?guó)的玉米中檢測(cè)到MDMV。該病毒最早于美國(guó)俄亥俄州被發(fā)現(xiàn)，2021年4月9日被新增列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中^[16]。研究結(jié)果表明，MDMV最初被分為A、B兩個(gè)主要株系。在中國(guó)，玉米矮花葉病的主要致病病毒是MDMV的B株系，通過(guò)分子生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其特性與甘蔗花葉病毒（SCMV）的一個(gè)株系相似，因此將其歸為SCMV，并命名為SCMV-MDB^[17]。

目前有關(guān)MDMV的檢測(cè)方法包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription-poly-merase chain reaction，RT-PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)（Quantitative real-time PCR，qPCR）等，這些方法雖能準(zhǔn)確檢測(cè)到MDMV，但耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，需要專業(yè)的技術(shù)人員和精密儀器，具有較多局限性。反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Reverse transcription-recombinase aided amplification，RT-RAA）是一種不需要熱穩(wěn)定酶和精密儀器的檢測(cè)技術(shù)，在36～44 ℃條件下反應(yīng)20～40 min即可完成目的基因的指數(shù)擴(kuò)增，具有反應(yīng)速度快，操作簡(jiǎn)單、溫度要求低，靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。這種檢測(cè)技術(shù)可以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求^[18]，已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域^[19-20]。在植物病毒的檢測(cè)領(lǐng)域，RT-RAA已被應(yīng)用于櫻桃病毒A、菜豆莢斑駁病毒、番茄黃化曲葉病毒等30余種植物病毒的檢測(cè)^[21-23]。CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein）是一種基于CRISPR RNA（crRNA）引導(dǎo)的靶向基因識(shí)別與切割技術(shù)。CRISPR/Cas12a屬于第2類Ⅴ型系統(tǒng)，可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到低濃度的目的基因，目前已被廣泛應(yīng)用 ^[24] 。本研究擬基于RT-RAA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，將MDMV檢測(cè)試劑集中在同一個(gè)試管中進(jìn)行反應(yīng)，并利用側(cè)向免疫層析技術(shù)快速檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，以期為現(xiàn)場(chǎng)簡(jiǎn)便、高效、直觀快速檢測(cè)玉米矮花葉病毒提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MDMV陽(yáng)性質(zhì)粒^[6]、SCMV陽(yáng)性質(zhì)粒、水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）、玉米褪綠斑駁病毒（Maize chlorotic mottle virus，MCMV）、小麥線條花葉病毒（Wheat streak mosaic virus，WSMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）由本實(shí)驗(yàn)室保存；感染MDMV的玉米病株由廣州海關(guān)和福州海關(guān)提供。

1.2 方法

1.2.1 RAA引物、crRNA及報(bào)告分子FQ、FB設(shè)計(jì) 參考RAA引物設(shè)計(jì)的相關(guān)文獻(xiàn)，登錄NCBI網(wǎng)站，獲取已報(bào)道的MDMV外殼蛋白（Coat protein， CP）基因序列。

利用多重序列比對(duì)工具對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì)，分析保守區(qū)域。在保守區(qū)域內(nèi)，設(shè)計(jì)2對(duì)RAA引物。使用設(shè)計(jì)工具CRISPR，根據(jù)MDMV外殼蛋白基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性crRNA序列。MDMV-crRNA：5′-UAAUUUCUACUAA￣G￣U￣G￣U￣A￣G￣A￣U￣A￣U￣A￣G￣G￣U￣G￣G￣U￣A￣U￣GAAGCAGUACAG-3′；FQ報(bào)告分子：6-羧基熒光素-CCGGAAAAAAAAAAAACCGG-熒光猝滅劑；FB報(bào)告分子：6-羧基熒光素-CCG￣G￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣C￣C￣G￣G-生物素。引物具體信息如表1所示。crRNA及FQ、FB報(bào)告分子序列由擎科有限公司（北京，中國(guó)）合成，引物由諾賽有限公司（北京，中國(guó)）合成。

1.2.2 RT-RAA恒溫?cái)U(kuò)增 按照RT-RAA恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒（型號(hào)WLRB8207KIT，安普未來(lái)生物科技有限公司產(chǎn)品）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-RAA等溫?cái)U(kuò)增，具體操作步驟如下：向每個(gè)凍干酶粉管中加入29.4 μL A buffer、2.0 μL正向引物（10 μmol/L）和2.0 μL反向引物（10 μmol/L），12.1 μL ddH2O，上下吸打混勻，使凍干酶粉充分溶解，隨后加入2.0 μL模板（MDMV陽(yáng)性質(zhì)粒）、2.5 μL B buffer，總體系共50.0 μL。充分混勻后，將反應(yīng)管放入恒溫反應(yīng)器中，42 ℃條件下恒溫反應(yīng)30 min。擴(kuò)增完成后，向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50.0 μL DNA提取液，12 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行后續(xù)凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法 RT-RAA體系包括25.0 μL A buffer、2.4 μL正向引物（10 μmol/L）和2.4 μL反向引物（10 μmol/L）、4.0 μL FQ報(bào)告分子（10 μmol/L）、6.0 μL ddH2O，將混合溶液倒入凍干酶粉管中，充分溶解后加入2.5 μL B buffer，上下吸打混合均勻后，從中抽取9.0 μL RT-RAA體系溶液至PCR管底部。CRISPR/Cas12a體系包括7.5 μL 10×NEBuffer 3.1、2.5 μL RNase inhibitor（40 U/μL）、2.5 μL DTT（0.1 mmol/L）、2.5 μL LbCas12a（5 μmol/L）、5.0 μL MDMV-crRNA（10 μmol/L），充分振蕩混勻后，從中抽取4.0 μL CRISPR/Cas12a體系溶液于管蓋內(nèi)。抽取1 μL待測(cè)病毒RNA至管底部，上下移液混合均勻，輕輕閉合PCR管蓋，PCR管置于42 ℃的恒溫反應(yīng)儀中反應(yīng)20 min。隨后振蕩并離心，使4 μL CRISPR/Cas12a體系溶液、9 μL RT-RAA體系溶液及1 μL病毒RNA混合均勻。PCR管內(nèi)混合溶液總體積為14 μL，將PCR管放入實(shí)時(shí)熒光儀中，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。

當(dāng)使用FB報(bào)告分子結(jié)合側(cè)向流動(dòng)試紙條檢測(cè)病毒RNA時(shí)，將4 μL FQ報(bào)告分子替換為4 μL FB報(bào)告分子，其他反應(yīng)條件相同，反應(yīng)結(jié)束后，加入86 μL去離子水，混合均勻后將試紙條插入PCR管中，靜置5 min，觀察條帶。

1.2.4 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法的特異性分析 按照TIANGENRNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取玉米上常見(jiàn)病毒RBSDV、CMV、SCMV、MCMV、WSMV的RNA，驗(yàn)證方法1.2.3的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法的特異性。

1.2.5 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法的靈敏度分析 使用ddH2O將MDMV陽(yáng)性質(zhì)粒梯度稀釋為每1 μL 1×10⁷拷貝、1×10⁶拷貝、1×10⁵拷貝、1×10⁴拷貝、1×10³拷貝、1×10²拷貝、1×101拷貝、1×100拷貝8個(gè)梯度，以健康玉米R(shí)NA為陰性對(duì)照，分別利用方法1.2.3的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法、RT-RAA結(jié)合凝膠電泳方法和RT-PCR結(jié)合凝膠電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，分析不同方法的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒檢測(cè)方法的優(yōu)化

2.1.1 RT-RAA體系引物篩選 以FQ作為熒光信號(hào)分子，分別使用2對(duì)RT-RAA引物，通過(guò)基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法檢測(cè)MDMV陽(yáng)性質(zhì)粒，同時(shí)以健康玉米R(shí)NA作為陰性對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果顯示如圖1所示，2對(duì)RAA引物均能擴(kuò)增出目的片段，其中引物組合MDMV-RAA-1F/MDMV-RAA-1R的熒光信號(hào)值更穩(wěn)定，因此引物選用MDMV-RAA-1F/MDMV-RAA-1R。

2.1.2 RT-RAA體系引物添加量篩選 將RT-RAA體系引物MDMV-RAA-1F/MDMV-RAA-1R（10 μmol/L）添加量分別設(shè)置2.0 μL、2.2 μL、2.4 μL、2.6 μL、2.8 μL、3.0 μL，進(jìn)行篩選。以FQ作為熒光信號(hào)分子，通過(guò)基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法檢測(cè)MDMV陽(yáng)性質(zhì)粒，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，當(dāng)引物添加量為2.0～3.0 μL，均可檢測(cè)到熒光信號(hào)。當(dāng)引物添加量達(dá)到2.8 μL時(shí)，熒光信號(hào)最強(qiáng)，當(dāng)引物添加量為3.0 μL時(shí)，熒光信號(hào)減弱，因此確定引物MDMV-RAA-1F/MDMV-RAA-1R（10 μmol/L）最佳添加量為2.8 μL。

2.1.3 報(bào)告分子FB濃度篩選 在CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中，報(bào)告分子的濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。報(bào)告分子濃度過(guò)低可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。為了避免假陽(yáng)性現(xiàn)象，用試紙條分別檢測(cè)0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、500 nmol/L和1 000 nmol/L濃度的FB報(bào)告分子。如圖3所示，當(dāng)FB濃度低于100 nmol/L時(shí)，檢測(cè)線均會(huì)出現(xiàn)微弱的假陽(yáng)性信號(hào)。因此選擇100 nmol/L濃度的FB報(bào)告分子。

2.1.4 RT-RAA體系反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 分別設(shè)置RT-RAA體系反應(yīng)時(shí)間為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，以FB作為信號(hào)分子，通過(guò)基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法檢測(cè)MDMV陽(yáng)性質(zhì)粒。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，RT-RAA反應(yīng)5 min即可在檢測(cè)線（T線）上產(chǎn)生條帶，隨著RT-RAA體系反應(yīng)時(shí)間的增加，檢測(cè)線上的條帶顏色逐漸加深。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)20 min，檢測(cè)線上的條帶深度不再隨著時(shí)間增加而變化，因此選擇20 min作為RT-RAA體系最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.1.5 CRISPR/Cas12a體系反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 分別設(shè)置CRISPR/Cas12a體系反應(yīng)時(shí)間為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，以FB作為信號(hào)分子，通過(guò)基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法檢測(cè)MDMV陽(yáng)性質(zhì)粒。結(jié)果如圖5所示，反應(yīng)10 min，試紙條檢測(cè)線上產(chǎn)生條帶，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，檢測(cè)線上的條帶顏色逐漸加深。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)20 min，檢測(cè)線上的條帶深度不再隨著時(shí)間增加而變化，因此選擇20 min作為CRISPR/Cas12a體系最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.2 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法的特異性

為評(píng)估基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法的特異性，使用試紙條對(duì)多種病毒進(jìn)行了檢測(cè)，包括玉米矮花葉病毒（MDMV）、水稻黑條矮縮病毒（RBSDV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、甘蔗花葉病毒（SCMV）、玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）和小麥條紋花葉病毒（WSMV），并以健康玉米R(shí)NA作為陰性對(duì)照。如圖6所示，只有檢測(cè)MDMV的試紙條檢測(cè)線（T線）上出現(xiàn)紅色條帶，檢測(cè)其他病毒和陰性對(duì)照的試紙條只在質(zhì)量控制線（C線）上出現(xiàn)條帶，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶。本研究的RT-RAA/Cas12a一管法在檢測(cè)MDMV時(shí)表現(xiàn)出高特異性，未與其他常見(jiàn)病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.3 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法的靈敏度

為評(píng)估不同檢測(cè)方法的靈敏度，分別用基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法、RT-PCR結(jié)合凝膠電泳方法、RT-RAA結(jié)合凝膠電泳方法檢測(cè)MDMV陽(yáng)性質(zhì)粒。如圖7所示，RT-PCR結(jié)合凝膠電泳方法能檢測(cè)到的病毒最低含量為每1 μL 1×10⁵拷貝（圖7a），RT-RAA結(jié)合凝膠電泳方法能檢測(cè)到的病毒最低含量為每1 μL 1×10⁴拷貝，基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法能檢測(cè)到的病毒最低含量為每1 μL 1×10²拷貝（圖7c）?？梢?jiàn)，基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法靈敏度是RT-RAA結(jié)合凝膠電泳方法的100倍，是RT-PCR結(jié)合凝膠電泳方法的1 000倍。

2.4 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法實(shí)際場(chǎng)景應(yīng)用

為驗(yàn)證基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和可靠性，對(duì)廣州海關(guān)和福州海關(guān)提供的4份感染玉米矮花葉病毒的玉米植株進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以健康玉米R(shí)NA作為陰性對(duì)照。如圖8所示，檢測(cè)供試4份感染玉米矮花葉病毒玉米植株的試紙條檢測(cè)線上均出現(xiàn)明顯條帶，表明本研究的方法穩(wěn)定可靠。

3 討論

玉米是中國(guó)重要的作物之一，長(zhǎng)期受到作物學(xué)研究者的關(guān)注^[25]。被MDMV侵染的玉米常出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，MDMV在全球范圍內(nèi)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，加強(qiáng)對(duì)進(jìn)口玉米、高粱等作物的病毒檢疫尤為重要，需要建立快速有效的MDMV檢測(cè)方法，以降低病毒傳入和流行的風(fēng)險(xiǎn)。

RT-RAA方法通過(guò)DNA聚合酶、重組酶的多種酶的協(xié)同作用完成鏈置換，實(shí)現(xiàn)目的基因的快速擴(kuò)增^[26]。與傳統(tǒng)PCR和熒光定量PCR相比，該方法無(wú)需電泳儀和熒光定量PCR儀，僅需恒溫金屬浴即可完成檢測(cè)，大幅縮短操作時(shí)間，真正實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場(chǎng)化檢測(cè)^[27]。此外，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有反應(yīng)條件簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，能夠在恒溫下完成擴(kuò)增反應(yīng)。該技術(shù)還可結(jié)合實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)、藍(lán)光可視化及側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l等方法，使檢測(cè)結(jié)果更加直觀。

玉米矮花葉病是玉米上最嚴(yán)重的病害之一。據(jù)報(bào)道，已有6種病毒可引起玉米矮花葉病，它們均可導(dǎo)致玉米花葉、矮縮等癥狀，相似的發(fā)病癥狀給病原的準(zhǔn)確識(shí)別帶來(lái)挑戰(zhàn)^[28]。MDMV是玉米矮花葉病的主要病原之一。本研究基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a構(gòu)建一種檢測(cè)MDMV的方法，將所有檢測(cè)試劑集中于一個(gè)試管中進(jìn)行反應(yīng)，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，引物MDMA-RAA-1F/MDMA-RAA-1R穩(wěn)定性強(qiáng);最佳試驗(yàn)條件為，引物添加量2.8 μL、FB報(bào)告分子濃度100 nmol/L、RT-RAA系統(tǒng)反應(yīng)時(shí)間20 min、CRISPR/Cas12a系統(tǒng)反應(yīng)時(shí)間20 min。本研究構(gòu)建的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，靈敏度是RT-RAA結(jié)合凝膠電泳方法的100倍，是RT-PCR結(jié)合凝膠電泳方法的1 000倍。該方法所用試劑可進(jìn)行凍干處理，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，同時(shí)結(jié)合側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l，使該檢測(cè)方法更加適用于田間檢測(cè)^[29]和植物病毒病的現(xiàn)場(chǎng)診斷^[30]，具有廣泛應(yīng)用前景。

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