摘要：目的利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索鱉甲煎丸對(duì)肝細(xì)胞癌增殖、遷移及有氧糖酵解的抑制作用，并探索其內(nèi)在機(jī)制。方法選取人肝癌細(xì)胞株（Huh7）作為研究對(duì)象，隨機(jī)將SD大鼠分為空白血清組、鱉甲煎丸高、中、低劑量組及抑制劑組，制備含藥大鼠血清，用以孵育Huh7細(xì)胞。CCK-8、劃痕實(shí)驗(yàn)探索鱉甲煎丸對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移的影響，糖酵解限速酶及代謝產(chǎn)物檢測(cè)探索鱉甲煎丸對(duì)肝癌細(xì)胞有氧糖酵解的影響，RT-qPCR、Western Blot實(shí)驗(yàn)探索鱉甲煎丸對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路的mRNA、相關(guān)蛋白及磷酸化的表達(dá)。多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t或Dunnettg T3檢驗(yàn)。結(jié)果與空白血清組相比，鱉甲煎丸組的OD值、不同時(shí)間段的遷移率、糖酵解限速酶（己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶）及糖酵解代謝產(chǎn)物（丙酮酸、乳酸、ATP）檢測(cè)均顯著降低（P值均lt;0.05）；RT-qPCR結(jié)果顯示，與空白血清組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組的mTOR mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，高、低劑量組的AKT mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P值均lt;0.05）；Western Blot結(jié)果顯示，與空白血清組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組的mTOR相關(guān)蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，高、中劑量組的AKT相關(guān)蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平均下調(diào)（P值均lt;0.05）。結(jié)論初步驗(yàn)證了鱉甲煎丸含藥血清可以抑制人肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞的有氧糖酵解，從而抑制其增殖、遷移，其機(jī)制可能與抑制AKT/mTOR信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：鱉甲煎丸；肝腫瘤，實(shí)驗(yàn)性；瓦爾堡效應(yīng)，腫瘤學(xué)

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金（2022GXNSFAA035460，2024GXNSFDA010005）；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YCSW2023395，YCSY2023021）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)引進(jìn)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2022BS026）

Effect of Biejia Decoction Pill on aerobic glycolysis in hepatocellular carcinoma by regulating the protein kinase B/mammalian target of rapamycin signaling pathway

TAN Qinwen1，HUANG Jingjing2，3，ZHONG Ruixi1，DU Yuanqin1，XU Jian1，NONG Jinli1，PENG Yujiao1

1.Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China；2.Department of Spleen，Stomach and Hepatology，The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China；3.Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-Incidence Infectious Diseases with Integrative Medicine，Nanning 530023，China

Corresponding author：HUANG Jingjing，55869563@qq.com（ORCID：0000-0002-4932-0838）

Abstract：Objective To investigate the inhibitory effect of Biejia Decoction Pill on the proliferation，migration，and aerobic glycolysis of hepatocellular carcinoma（HCC）using cell experiments，as well as related mechanisms.Methods Human liver cancer cell line Huh7 was selected，and Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank serum group，inhibitor group，and high-，middle-，and low-dose Biejia Decoction Pill groups.Rat serum containing the drug was prepared for the incubation of Huh7 cells.CCK8 assay and scratch assay were used to explore the effect of Biejia Decoction Pill on the proliferation and migration of"HCC cells；glycolytic rate-limiting enzymes and metabolites were measured to explore the effect of Biejia Decoction Pill on aerobic glycolysis of liver cancer cells；RT-qPCR and Western blot were used to explore the effect of Biejia Decoction Pill on the mRNA expression，related proteins，and phosphorylation of the protein kinase B（AKT）/mammalian target of rapamycin（mTOR）signaling pathway.A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups，and the least significant difference t-test or the Dunnett’s T3 test were used for further comparison between two groups.Results Compared with the blank serum group，the Biejia Decoction Pill groups had significant reductions in OD value，migration rate during different periods of time，glycolytic rate-limiting enzymes（hexokinase，phosphofructokinase，pyruvate kinase），and glycolytic metabolites（pyruvate，lactic acid，ATP）（all Plt;0.05）.RT-qPCR results showed that compared with the blank serum group，the high-，middle-，and low-dose Biejia Decoction Pill groups had a significant reduction in the mRNA expression level of mTOR，and the high-and low-dose Biejia Decoction Pill groups had a significant reduction in the mRNA expression level of AKT（all Plt;0.05）.Western blot results showed that compared with the blank serum group，the high-，middle-，and low-dose Biejia Decoction Pill groups had significant reductions in the expression levels of mTOR-related proteins and phosphorylated proteins，and the high-and middle-dose Biejia Decoction Pill groups had significant reductions in the expression levels of AKT-related proteins and phosphorylated proteins（all Plt;0.05）.Conclusion This study preliminarily verifies that the serum containing Bijia Decoction Pill can inhibit the aerobic glycolysis of human hepatoma Huh7 cells，thereby inhibiting their proliferation and migration，possibly by inhibiting the expression of the proteins related to the AKT/mTOR signaling pathway.

Key words：Bie Jia Jian Wan；Liver Neoplasms，Experimental；Warburg Effect，Oncologic

Research funding：Guangxi Natural Science Foundation（2022GXNSFAA035460，2024GXNSFDA010005）；Guangxi Graduate Education Innovation Program（YCSW2023395，YCSY2023021）；Guangxi University of Traditional Chinese Medicine Introduction of Doctoral Research Fund Project（2022BS026）

肝臟是人體代謝中心，是糖代謝重要的場(chǎng)所。正常細(xì)胞在有氧條件下，主要通過線粒體氧化磷酸化獲得能量；而無氧環(huán)境下，細(xì)胞會(huì)在己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的催化下，產(chǎn)生丙酮酸、乳酸、ATP等代謝產(chǎn)物，為細(xì)胞提供能量?！巴卟瘛毙?yīng)指出，癌細(xì)胞在有氧情況下也依賴糖酵解提供能量，有氧糖酵解是肝癌細(xì)胞代謝的主要方式之一。中醫(yī)認(rèn)為，肝癌具有寒熱錯(cuò)雜、虛實(shí)夾雜的特點(diǎn)，治療上以扶正固本、活血化瘀、解毒散結(jié)為原則。鱉甲煎丸是中醫(yī)經(jīng)典方劑，具有調(diào)節(jié)寒熱，補(bǔ)益氣血、活血散瘀、解毒散結(jié)的功效?，F(xiàn)代研究［1］也表明，鱉甲煎丸可抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展，且具有確切的臨床療效，是目前常用的抗癌方劑，但其抗癌內(nèi)在機(jī)制尚未有統(tǒng)一的說法。蛋白激酶B（AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路之一，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，具有調(diào)節(jié)癌細(xì)胞周期、增殖、凋亡、代謝、炎癥以及血管生存等作用［2-4］。基于此，本研究探討鱉甲煎丸是否通過調(diào)控AKT/mTOR通路，參與干預(yù)肝癌細(xì)胞有氧糖酵解，從而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移的作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)使用人肝癌細(xì)胞株（Huh7），購(gòu)買于武漢普諾賽生命科技有限公司，細(xì)胞貨號(hào)：CL-0120。

1.1.2實(shí)驗(yàn)用藥項(xiàng)目組采用鱉甲煎丸中成藥（武漢中聯(lián)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：Z42020772，產(chǎn)品批號(hào)：211970，3 g/袋），鱉甲煎丸：鱉甲、烏扇、黃芩、柴胡、鼠婦、干姜、大黃、芍藥、桂枝、葶藶、石葦、厚樸、牡丹、瞿麥、紫葳、半夏、人參、土鱉蟲、阿膠、蜂窠、赤硝、蜣螂、桃仁。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32只SD大鼠，體質(zhì)量為（180±20）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0001，使用許可證編號(hào)：SYXK桂2019-0001，在廣西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：22℃，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑及儀器

1.2.1主要試劑2-Deoxy-D-glucose（貨號(hào)：HY-13966，MCE）、Huh-7細(xì)胞專用培養(yǎng)基（貨號(hào)：CM-0120，普諾賽）、CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒（貨號(hào)：C6005M，UElandy）、HK試劑盒（貨號(hào)：A077-3，南京建成）、PFK活性測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：A129-1-1，南京建成）、PK活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC0540，Solarbio）、ATP含量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC0300，Solarbio）、高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液（貨號(hào)：ZJ102L，Solarbio）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：ZJ102，雅酶）、丙酮酸試劑盒（貨號(hào)：A081-1-1，南京建成）、乳酸測(cè)試盒（貨號(hào)：A019-2-1，南京建成）、細(xì)胞/動(dòng)物組織/植物組織RNA提取試劑盒（貨號(hào)：A077-3，Solarbio）、AKT抗體（兔多抗）（貨號(hào)：AA326，碧云天）、mTOR兔單抗（貨號(hào)：AF1648，碧云天）、p-AKT抗體（貨號(hào)：PAB43158-P，Bioswamp）、p-mTOR抗體（貨號(hào)：AF3308，Affinity）、MonAmp?SYBR?Green qPCR Mix（貨號(hào)：MQ10301S，UElandy）。

1.2.2主要儀器非接觸式超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（型號(hào)：SCIENTZ08-Ⅲ，寧波新芝生物科技股份有限公司）、紫外分光光度計(jì)（型號(hào)：UV-2600，島津儀器公司）、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（型號(hào)：Epoch，Biotek）、熒光定量PCR儀（型號(hào)：Roche，LightCycler?96）、生物分析儀（型號(hào)：Agilent 5400，Agilent Technologies Co Ltd）、PCR儀（型號(hào)：T100PCR，Bio-Rad）、凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：Tanon 5200，上海天能）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1含藥血清的制備將32只SD大鼠隨機(jī)分為空白血清組（對(duì)照）、鱉甲煎丸高、中、低劑量組，每組8只大鼠，鱉甲煎丸組根據(jù)成人（60 kg）的臨床劑量來換算，從而得到大鼠（250 g/只）的鱉甲煎丸用藥劑量為1.1 g/kg（此設(shè)為中劑量組），高、低劑量組分別為中劑量組的2、0.5倍，即分別為2.2、0.55 g/kg，空白血清組以生理鹽水代替藥物，各組灌胃2次/d，連續(xù)給藥3 d。第4天，禁食禁水12 h，給藥1次，并在給藥1h后予2%戊巴比妥鈉（0.01 mL/g）腹部麻醉，麻醉滿意后行腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置2h，3 000 r/min離心，56℃、30 min滅活，0.22μm濾膜過濾，得到含藥血清保存于?80℃冰箱中，用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3.2抑制劑的制備及使用抑制劑組使用5μmol/L的MK-2206直接加入細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行直接干預(yù)。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組Huh7細(xì)胞均采用Huh-7細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)密度達(dá)到80%～90%時(shí)，分別加入空白血清組血清（20%）、鱉甲煎丸低劑量組血清（20%）、鱉甲煎丸中劑量組血清（20%）、鱉甲煎丸高劑量組血清（20%）以及含有MK-2206的Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況各組以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到96個(gè)孔中，分別加入100μL含藥培養(yǎng)液，藥物干預(yù)24 h后，加入CCK-8試劑10μL，后將96孔板放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm吸光度時(shí)每孔的OD值。

1.3.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力按照密度8×105/孔接種于6孔板中，用10μL槍頭在直尺輔助下進(jìn)行劃痕。分別加入2 mL含藥培養(yǎng)液進(jìn)行藥物干預(yù)。顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，在0、24、48 h時(shí)進(jìn)行拍照記錄，隨后用Image J軟件進(jìn)行圖片處理計(jì)算劃痕面積。

1.3.6糖酵解激酶（HK、PFK、PK）活性測(cè)定藥物干預(yù)后，使用細(xì)胞刮刀將各組細(xì)胞收集到離心管中，并用超聲波進(jìn)行破碎（采用冰浴，功率為20%，超聲波持續(xù)3 s，間隔10 s，重復(fù)30次），根據(jù)每個(gè)試劑盒的說明書，對(duì)樣本進(jìn)行操作和計(jì)算，并對(duì)各組細(xì)胞蛋白（HK、PFK、PK）濃度進(jìn)行測(cè)定，隨后進(jìn)行歸一化處理。

1.3.7糖酵解代謝產(chǎn)物（丙酮酸、乳酸、ATP）水平測(cè)定藥物干預(yù)后，分別按照說明書要求收集各組細(xì)胞及上清液，利用酶標(biāo)儀及紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)說明書提示計(jì)算丙酮酸、乳酸含量及ATP水平，同時(shí)測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度進(jìn)行歸一化處理。

1.3.8 RT-qPCR檢測(cè)按照試劑盒說明書的方法，利用雙離心柱法提取RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RT-qPCR檢測(cè)，引物設(shè)計(jì)，AKT：正向引物5'-CCATCACACCACCTGACCAA-3'，反向引物5'-CGAGTAGGAGAACTGGGGGA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為83 bp。mTOR正向引物5'-CGCGCGAATATTAA AGGAAACT-3'，反向引物5'-CAGGACGCTCACATTGCTAG A-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為：113 bp。GAPDH：正向引物5'-GG AAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3'，反向引物5'-TGATGA CCCTTTTGGCTCCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為：168 bp。使用MonAmp?SYBR?Green qPCR Mix試劑盒對(duì)合成的基因進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)AKT、mTOR的基因表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照。以2?ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中基因的倍數(shù)關(guān)系。

1.3.9 Western Blot檢測(cè)使用高效RIPA細(xì)胞裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定。凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，室溫孵育二抗2 h，TBST洗膜，滴加ECL發(fā)光液，使用發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像并拍照，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 27.0軟件，并利用GraphPad Prism 8設(shè)計(jì)相應(yīng)的圖像。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較若方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，不齊則用Dunnettg T3檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1鱉甲煎丸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響與空白血清組相比，鱉甲煎丸高、中、低劑量組的OD值均降低（P值均lt;0.05）（表1），藥物濃度越大，OD值越低。

2.2鱉甲煎丸對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響藥物干預(yù)24、48 h后，鱉甲煎丸高、中、低劑量組遷移率均低于空白血清組（P值均lt;0.05）（圖1、表2），濃度越大，遷移率越低。

2.3鱉甲煎丸對(duì)肝癌細(xì)胞糖酵解限速酶活性的影響利用糖酵解激酶試劑盒對(duì)HK、PFK、PK這3個(gè)限速酶進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：與空白血清組相比，鱉甲煎丸高、中、低劑量組的3個(gè)限速酶活性均降低（P值均lt;0.05）（表3）。

2.4鱉甲煎丸對(duì)肝癌細(xì)胞糖酵解代謝產(chǎn)物的影響利用乳酸、丙酮酸、ATP試劑盒對(duì)藥物干預(yù)后的代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示：與空白血清組相比，鱉甲煎丸高、中、低劑量組的乳酸、丙酮酸、ATP含量均減少（P值均lt;0.05）（表4）。

2.5鱉甲煎丸含藥血清對(duì)AKT、mTOR的mRNA表達(dá)的影響如表5所示，鱉甲煎丸高、低劑量組AKT的mRNA表達(dá)均低于空白血清組（P值均lt;0.05），中劑量組與空白血清組比較沒有明顯差異（Pgt;0.05）。鱉甲煎丸高、中、低劑量組mTOR的mRNA表達(dá)均低于空白血清組（P值均lt;0.05）。

2.6鱉甲煎丸對(duì)含藥血清對(duì)AKT、mTOR蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)的影響如表6及圖2所示，鱉甲煎丸高、中劑量組AKT的蛋白表達(dá)均低于空白血清組（P值均lt;0.05），濃度越高，表達(dá)越低，但低劑量組與空白血清組比較沒有明顯差異（Pgt;0.05）。而鱉甲煎丸高、中、低劑量組mTOR的蛋白表達(dá)均低于空白血清組（P值均lt;0.05），濃度越高，表達(dá)越低。

3討論

癌細(xì)胞過度增殖與遷移是肝癌形成、生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的前提條件［5］。中醫(yī)認(rèn)為，正虛是肝癌發(fā)生的前提條件，正虛則內(nèi)外邪氣有侵襲人體的機(jī)會(huì)，引起機(jī)體臟腑功能失調(diào)，氣血津液失司，寒、熱、濕、毒、瘀、痰等邪氣結(jié)聚于脅下［6］，癌細(xì)胞不斷增殖，形成腫塊。然濕毒、痰毒等具有流竄之性，加之機(jī)體抗邪不利，陰陽失衡，固澀失司，使癌細(xì)胞不斷遷移、擴(kuò)散，從而發(fā)生肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移［7-8］。由此可見，寒熱錯(cuò)雜、虛實(shí)夾雜是肝癌的基本病機(jī)。鱉甲煎丸是由東漢醫(yī)家張仲景所提出的，治療癥瘕、瘧母的主方，全方由23味中藥組成。其中，人參、阿膠、芍藥、桂枝能補(bǔ)益氣血、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)；大黃、紫葳、土鱉蟲、蜣螂、鼠婦、牡丹皮、芍藥、桃仁、鱉甲、半夏、烏扇、赤硝具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)的功效；蜂房、黃芩、柴胡清熱解毒散結(jié)，這些藥物的功效與肝癌病機(jī)相契合，是目前常用的抗肝癌方劑之一。現(xiàn)代研究［9-11］也表明，鱉甲煎丸不僅抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝，調(diào)控血管生成，也能通過改善癌細(xì)胞代謝以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等途徑來抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

癌細(xì)胞在發(fā)生增殖、轉(zhuǎn)移時(shí)需要消耗大量的能量，當(dāng)微環(huán)境中能量缺乏時(shí)，癌細(xì)胞往往會(huì)調(diào)整代謝方式，以應(yīng)對(duì)自身的能量需求［12-13］。研究［14］發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞在侵襲和轉(zhuǎn)移時(shí)有氧糖酵解相關(guān)基因（PKM2、HK、LDHA、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1）的表達(dá)增強(qiáng)。AKT/mTOR信號(hào)通路在癌癥多個(gè)方面都起著重要的作用，包括影響癌細(xì)胞的周期性、增殖、凋亡、代謝、炎癥和血管生成等［15］。最近的研究［16-17］顯示，AKT能夠直接磷酸化PRAS40（40 kD的富含脯氨酸蛋白激酶B底物蛋白），導(dǎo)致其失去對(duì)mTORC1（雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1）的抑制作用，以此來激活mTORC1通路，而且這種激活可以促使p70核糖體蛋白S6激酶磷酸化，進(jìn)而激活核糖體蛋白S6，以此來促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，促使腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)也能通過調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄因子影響糖酵解相關(guān)代謝酶（HK2、PFK、PK）以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的表達(dá)水平，從而調(diào)控糖酵解。且許多研究［18-20］指出，在肺癌、膽管細(xì)胞癌等多種腫瘤中觀察到激活的AKT/mTOR信號(hào)通路可以調(diào)控癌細(xì)胞糖酵解抑制腫瘤細(xì)胞代謝。比如，淫羊藿素可以通過AKT/mTOR信號(hào)通路呈劑量依賴方式抑制人肝內(nèi)膽管癌HuCCT1細(xì)胞的增殖，同時(shí)抑制其葡萄糖消耗，抑制糖酵解限速酶HK1、HK2、PKM1、PKM2的活性，抑制肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的生長(zhǎng)及糖酵解［21］。

本研究以不同劑量鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)Huh7細(xì)胞，結(jié)果顯示，與空白血清相比，鱉甲煎丸含藥血清明能抑制Huh7細(xì)胞的增殖、遷移活動(dòng)，減少有氧糖酵解中相關(guān)激酶的活性及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。同時(shí)，鱉甲煎丸含藥血清還能使AKT/mTOR信號(hào)通路中的mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)。這提示鱉甲煎丸可以通過抑制肝癌細(xì)胞有氧糖酵解，從而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控AKT/mTOR信號(hào)通路的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果從側(cè)面驗(yàn)證了鱉甲煎丸能抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展，也為鱉甲煎丸干預(yù)癌細(xì)胞代謝提供了相關(guān)依據(jù)。與傳統(tǒng)、廣譜治療方式不同，針對(duì)信號(hào)通路、細(xì)胞因子及基因表達(dá)的治療是更為精準(zhǔn)的治療方式。AKT/mTOR信號(hào)通路在癌細(xì)胞能量代謝方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，開發(fā)更多靶向AKT/mTOR信號(hào)通路的藥物可能具有廣泛的研究前景，探索AKT/mTOR信號(hào)通路與肝癌發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系對(duì)于指南的制定可能具有重要意義。但實(shí)驗(yàn)也存在較多未能排除的干擾因素，如其他通路、因子等。本研究團(tuán)隊(duì)將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中不斷改進(jìn)及進(jìn)行更深入的探索。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2023年8月30日經(jīng)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：DW20230830-162，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：譚欽文、鐘瑞熙負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，起草論文；譚欽文、鐘瑞熙、杜沅沁、徐健負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作，研究過程的實(shí)施；譚欽文負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繪制圖表；杜沅沁、農(nóng)金麗、彭玉姣負(fù)責(zé)擬定寫作思路；黃晶晶指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-06-22；錄用日期：2024-09-24

本文編輯：王瑩