摘要：目的分析1，25（OH）2D3對非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠模型肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）水平以及肝巨噬細(xì)胞表型、肝臟炎癥的影響，初步探討1，25（OH）2D3改善NASH肝臟炎癥的相關(guān)機制。方法將24只SPF級Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為4組。正常組（n=6）：給予膽堿充足的氨基酸（CSAA）飲食；正常+1，25（OH）2D3組（n=6）：給予CSAA飲食+1，25（OH）2D3干預(yù)；模型組（n=6）：給予膽堿缺乏的氨基酸（CDAA）飲食；模型+1，25（OH）2D3組（n=6）：給予CDAA飲食+1，25（OH）2D3干預(yù)。1，25（OH）2D3劑量為5μg/kg，經(jīng)腹腔注射，每周2次，共12周。檢測每組大鼠血清AST、ALT水平；觀察肝組織病理學(xué)嚴(yán)重程度，評估SAF評分。檢測肝組織M1型、M2型肝巨噬細(xì)胞，分析肝巨噬細(xì)胞表型變化；并檢測肝組織TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平以及PPAR-γ的mRNA水平。組間比較采用雙因素方差分析，進一步比較采用LSD-t多重檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)法。結(jié)果與正常組比較，CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH模型AST和ALT水平均升高（P值分別為0.019、lt;0.001），肝組織病理學(xué)SAF評分（Plt;0.001）、M1型肝巨噬細(xì)胞表達水平（Plt;0.001）、M1/M2表型比值（P=0.001）、TNF-α表達水平顯著增加（Plt;0.001），IL-4表達水平降低（P=0.025）；1，25（OH）2D3顯著降低了CDAA飲食誘導(dǎo)NASH大鼠血清ALT水平（Plt;0.001）、肝組織病理學(xué)SAF評分（Plt;0.001）、M1型肝巨噬細(xì)胞水平（Plt;0.001）、M1/M2型比值（P=0.001）、IL-1β水平（Plt;0.001），增加了M2型肝巨噬細(xì)胞水平（P=0.017）、IL-10水平（P=0.039）、IL-4水平（Plt;0.001）、PPAR-γ水平（P=0.016）。CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH模型和1，25（OH）2D3在大鼠血清AST和ALT水平（P值分別為0.007、0.008）、肝組織病理學(xué)SAF評分（Plt;0.001）、M1型肝巨噬細(xì)胞水平（Plt;0.001）、M2型肝巨噬細(xì)胞水平（P=0.008）、M1/M2表型比值（P=0.005）、TNF-α水平（Plt;0.001）、IL-10水平（P=0.038）、IL-4水平（Plt;0.001）、PPAR-γ水平（P=0.009）中有顯著交互作用。相關(guān)性分析結(jié)果示：PPAR-γ與肝巨噬細(xì)胞M1/M2表型比值呈負(fù)相關(guān)（r=?0.415，P=0.044）；與M2型肝巨噬細(xì)胞、IL-10、IL-4均呈正相關(guān)（r值分別為0.435、0.433、0.532，P值分別為0.033、0.035、0.007）。結(jié)論1，25（OH）2D3激活PPAR-γ調(diào)控肝巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，改善NASH肝臟炎癥。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪性肝炎；骨化三醇；炎癥；PPARγ;大鼠，Wistar

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81860110）

Mechanism of 1，25（OH）2D3 improving liver inflammation in a rat model of nonalcoholic steatohepatitis induced by choline-deficient L-amino acid-defined diet

ZHU Haiyanga，CUI Jingshub，YANG Liua，ZHOU Mengtinga，TONG Jiana，HAN Hongmeia

a.Department of Gastroenterology，b.Department of Pathology，The Affiliated Hospital of Yanbian University，Yanji，Jilin 133001，China

Corresponding author：HAN Hongmei，hanhm79@126.com（ORCID：0000-0001-7147-4447）

Abstract：Objective To investigate the effect of 1，25（OH）2D3 on the level of peroxisome proliferator-activated receptor-γ（PPAR-γ）in the liver，the phenotype of hepatic macrophages，and liver inflammation in arat model of nonalcoholic steatohepatitis（NASH），as well as the mechanism of 1，25（OH）2D3 improving liver inflammation.Methods After 1 week of adaptive feeding，24 specific pathogen-free Wistar rats were randomly divided into normal group［choline-supplemented L-amino acid-defined（CSAA）diet］，normal+1，25（OH）2D3 group［CSAA diet+1，25（OH）2D3］，model group［choline-deficient L-amino acid-defined diet（CDAA）diet］，and model+1，25（OH）2D3 group［CDAA diet+1，25（OH）2D3］，with 6 rats in each group.The dose of 1，25（OH）2D3 was 5μg/kg for intraperitoneal injection twice a week for 12 weeks.The serum levels of aspartate aminotransferase（AST）and alanine aminotransferase（ALT）were measured，liver histopathology was observed，and SAF score was assessed.M1 hepatic macrophages and M2 hepatic macrophages were measured to analyze in the change in the phenotype of hepatic macrophages，and ELISA was used to measure the levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-1β（IL-1β），interleukin-4（IL-4），and interleukin-10（IL-10）in liver tissue，and qPCR was used to measure the mRNA level of PPAR-γ.The two-factor analysis of variance was use for comparison between groups，and the least significant difference t-test was used for further comparison；the Pearson method was used for correlation analysis.Results Compared with the normal group，the model rats with CDAA diet-induced NASH had significant increases in the serum levels of AST and ALT（P=0.019 and Plt;0.001），the SAF score of liver histopathology（Plt;0.001），the level of M1 hepatic macrophages（Plt;0.001），and the ratio of M1 and M2 hepatic macrophages（Plt;0.001），as well as a significant increase in the level of TNF-α（Plt;0.001）and a significant reduction in the level of IL-4 in liver tissue（P=0.025）.The 1，25（OH）2D3 group had significant reductions in the serum levels of ALT（Plt;0.001），the SAF score of liver histopathology（Plt;0.001），the level of M1 hepatic macrophages（Plt;0.001），and the ratio of M1 and M2 hepatic macrophages（P=0.001），the level of IL-1β（Plt;0.001）and a significant increase in the level of M2 hepatic macrophages（P=0.017），the level of IL-10（P=0.039），the level of IL-4（Plt;0.001），the level of PPAR-γ（P=0.016）.There were significant interactions between CDAA diet-induced NASH model and 1，25（OH）2D3 in serum the levels of AST and ALT（P=0.007 and P=0.008），the SAF scores of liver histopathology（Plt;0.001），the level of M1 hepatic macrophages（Plt;0.001），the level of M2 hepatic macrophages（P=0.008），the ratio of M1 and M2 of hepatic macrophages（P=0.005），the level of TNF-α（Plt;0.001），the level of IL-10（P=0.038），the level of IL-4（Plt;0.001）and the level of PPAR-γ（P=0.009）.The correlation analysis showed that PPAR-γwas negatively correlated with the ratio of M1 and M2 hepatic macrophages（r=?0.415，P=0.044）and was positively correlated with M2 hepatic macrophages（r=0.435，P=0.033），IL-10（r=0.433，P=0.035），and IL-4（r=0.532，P=0.007）.Conclusion This study shows that 1，25（OH）2D3 improves liver inflammation in NASH by activating PPAR-γto regulate the phenotypic transformation of hepatic macrophages.

Key words：Non-alcoholic Steatohepatitis；Calcitriol；Inflammation；PPAR gamma；Rats，Wistar

Research funding：National Natural Science Foundation of China（81860110）

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是非酒精性脂肪性肝病進展的關(guān)鍵階段［1］，近年發(fā)病率逐年增加，目前已達到約6%［2］，然而治療方法有限［3］。研究證明，膽堿缺乏的氨基酸（choline deficient amino acid-defined，CDAA）飲食可誘導(dǎo)類似人類NASH肝組織病理學(xué)的肝脂肪變性、炎癥等［4］。肝巨噬細(xì)胞作為肝臟中的重要免疫細(xì)胞，在NASH肝臟炎癥發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用［5］。肝巨噬細(xì)胞可根據(jù)不同微環(huán)境刺激信號作出應(yīng)答，極化為兩種亞型，包括M1型和M2型巨噬細(xì)胞［6］。M1型分泌TNF-α、IL-1β等促炎因子，具有促炎作用；而M2型分泌IL-4、IL-10等抗炎因子［7］，參與抗炎作用。一般情況下M1型和M2型肝巨噬細(xì)胞彼此互相制約，趨于動態(tài)平衡。在特定的刺激下，促進M1型肝巨噬細(xì)胞極化，導(dǎo)致NASH炎癥反應(yīng)［8］，或M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型，改善NASH進展［9］。因此，調(diào)節(jié)肝臟巨噬細(xì)胞M1和M2表型動態(tài)平衡可能是改善NASH的關(guān)鍵。

筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，1，25（OH）2D3可以呈劑量依賴性地改善CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH肝臟炎癥［10］，而且目前認(rèn)為其可能通過NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）是巨噬細(xì)胞極化的主要調(diào)節(jié)因子［11］。最近有體外實驗研究表明，1，25（OH）2D3通過提高PPAR-γ表達促進高葡萄糖誘導(dǎo)的體外巨噬細(xì)胞由M1型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型，給予PPAR-γ拮抗劑干預(yù)后，可拮抗1，25（OH）2D3對M1/M2表型的轉(zhuǎn)變［12］。然而，1，25（OH）2D3對NASH的抗炎作用，是否通過PPAR-γ調(diào)控巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變產(chǎn)生，目前尚不清楚。因此，基于前期研究和最近研究結(jié)果，本研究擬建立CDAA飲食誘導(dǎo)的大鼠NASH模型，觀察1，25（OH）2D3對NASH肝臟PPAR-γ水平的影響，以及對肝巨噬細(xì)胞表型、肝臟炎癥的影響，闡明1，25（OH）2D3改善NASH的抗炎機制，以期為開發(fā)新的治療策略提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗動物選取6周齡Wistar大鼠24只，體質(zhì)量180～200 g，清潔級，均購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（吉）-2020-0002，實驗動物使用許可證：SYXK（吉）-2020-0009。在溫度為（22±2）℃，空氣濕度40%～60%的清潔級動物實驗室飼養(yǎng)，并經(jīng)光照14h和黑暗10h循環(huán)，自由攝取食物和無菌消毒水，且在實驗之前進行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.2主要試劑及主要儀器CD163、ITGAX（CD11C）、CD68（武漢博士德生物工程有限公司）；TNF-α、IL-4 ELISA kit（江蘇酶免實業(yè)有限公司）；IL-1β、IL-10 ELISA kit（武漢博士德生物工程有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄酶Revert Aid Reverse Transcriptase（thermo scientific）；膽堿充足的氨基酸（choline sufficient amino acid-defined，CSAA）、CDAA（南通特洛菲飼料科技有限公司）；?4℃離心機（日本Hitachi公司）；脫水機、全自動切片機（德國Leica公司）；HE染色試劑和天狼星紅染色試劑（本院病理科）；病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀）；熒光定量PCR儀（Roche）；PCR儀（杭州博日科技）；顯微鏡BX51（日本奧林巴斯）。

1.3實驗設(shè)計、分組及標(biāo)本采集經(jīng)過1周適應(yīng)性普通飼料飼養(yǎng)后，24只Wistar大鼠隨機分為4組，每組6只。（1）正常組：給予CSAA飲食；（2）正常+1，25（OH）2D3組：給予CSAA飲食+1，25（OH）2D3干預(yù)；（3）模型組：給予CDAA飲食；（4）模型+1，25（OH）2D3組：給予CDAA飲食+1，25（OH）2D3干預(yù)。1，25（OH）2D3劑量根據(jù)筆者前期研究［10］確定，每周2次，5μg/kg腹腔注射，共12周。在實驗12周末，采用頸椎脫臼法處死大鼠，經(jīng)腹主動脈取血，4℃離心機分離血清（3 000 r/min，20 min）；選取肝右葉中部肝組織置于4%甲醛中固定，制備肝組織切片與肝組織勻漿液，余肝組織置于?80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4生化檢測大鼠血清AST、ALT使用羅氏cobasc702全自動生化分析儀檢測。

1.5肝組織病理學(xué)分析HE染色：用4%甲醛溶液固定肝組織樣本，石蠟包埋后切片（4～5μm），固定于Poly-Lysine防脫片。撈片后放置于60℃烤箱60 min，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色6 min，酒精分化，稀氨水反藍，伊紅染色8 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，用OLYMPUS顯微鏡觀察。

SAF評分是目前公認(rèn)的評估肝組織病理學(xué)嚴(yán)重程度的方法［13］，積分評估過程：由兩位病理專家以雙盲法隨機觀察5個視野區(qū)域，求得數(shù)據(jù)平均值，SAF≥3分則診斷為NASH。SAF評分標(biāo)準(zhǔn)如下［14］：（1）脂肪變性分為0分（lt;5%）、1分（5%～33%）、2分（34%～66%）、3分（gt;66%）。（2）活動度=氣球樣變+小葉炎癥，氣球樣變分為0分（正常肝細(xì)胞，呈長方體形狀，棱角分明，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色嗜酸性）、1分（存在細(xì)胞質(zhì)蒼白的圓形肝細(xì)胞簇，常呈網(wǎng)狀，形狀各異，但其大小與正常肝細(xì)胞類似）、2分（與1分氣球樣變的肝細(xì)胞簇內(nèi)的正常肝細(xì)胞相比較，至少為其2倍大?。?；小葉炎癥（在低倍鏡下計數(shù)炎癥壞死灶）分為0分（無病灶）、1分（每個小葉≤2個病灶）、2分（每個小葉gt;2個病灶）。（3）肝纖維化：0分，無纖維化；1分，竇周纖維化或門靜脈周圍纖維化；2分，竇周纖維化合并門靜脈周圍纖維化；3分，橋接纖維化；4分，肝硬化。

1.6 PPAR-γ檢測用實時定量PCR（realtime-PCR，qPCR）方法檢測肝組織勻漿液中PPAR-γ的mRNA表達水平，引物序列見表1，具體操作步驟如下：取20 mg肝組織樣本，加入1 mL的Trizol試劑，加三氯甲烷混勻，4℃12 000 r/min離心10min，再經(jīng)過異丙醇原液、75%乙醇、沉淀等步驟進行RNA提取，使用逆轉(zhuǎn)錄酶Revert Aid Reverse Transcriptase進行逆轉(zhuǎn)錄，再經(jīng)預(yù)變性、循環(huán)、末端延伸、溶解曲線等步驟進行PCR擴增，采用ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進行處理。

1.7肝組織中M1型（CD68+CD11c）和M2型（CD68+CD163）肝巨噬細(xì)胞雙陽性細(xì)胞檢測切片常規(guī)脫蠟至水。微波熱修復(fù)抗原，滴加山羊血清封閉液（原液用PBS按1∶9稀釋），37℃孵育30 min。實驗片滴加一抗①（1∶100），4℃過夜，37℃復(fù)溫30 min，PBS（pH：7.2～7.6）清洗5 min×3次。滴加DyLight 488熒光素標(biāo)記羊抗兔37℃孵育45 min。PBS（pH：7.2～7.6）清洗。實驗片滴加一抗②（1∶200），操作過程同一抗①。滴加DyLight 594熒光素標(biāo)記羊抗兔37℃孵育45 min，滴加DAPI染色液，室溫孵育3 min。PBS（pH：7.2～7.6）清洗?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄?。通過熒光顯微鏡觀察、拍照或掃描儀做全景掃描，高倍鏡（400倍）選取3個視野。采用ImageJ軟件計數(shù)M1型和M2型雙陽性細(xì)胞數(shù)，求取平均值。

1.8肝組織炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-4檢測嚴(yán)格按照ELISA檢測試劑盒說明書對肝組織勻漿液中的IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-4水平進行檢測。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法使用IBM SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用±s表示，多組間比較采用雙因素方差分析，進一步比較采用LSD-t多重檢驗；采用Pearson相關(guān)法進行相關(guān)性分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 1，25（OH）2D3對NASH大鼠血清生化指標(biāo)的影響

2.1.1大鼠AST水平的雙因素方差分析結(jié)果CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH模型顯著增加其水平（F=6.518，P=0.019），1，25（OH）2D3未顯著影響其水平（F=2.930，Pgt;0.05），在1，25（OH）2D3和飲食誘導(dǎo)NASH大鼠模型之間具有交互作用（F=8.962，P=0.007）。與正常組相比，模型組AST水平顯著升高（P=0.001）；與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組AST水平顯著降低（P=0.003）。結(jié)果表明，CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠血清AST水平升高，而補充1，25（OH）2D3后逆轉(zhuǎn)了這一趨勢（圖1）。

2.1.2大鼠ALT水平的雙因素方差分析結(jié)果CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH模型顯著增加其水平（F=311.657，Plt;0.001），1，25（OH）2D3顯著降低其水平（F=39.569，Plt;0.001），在1，25（OH）2D3和飲食誘導(dǎo)NASH大鼠之間具有交互作用（F=8.683，P=0.008）。與正常組相比，模型組ALT水平顯著升高（Plt;0.001），正常+1，25（OH）2D3組ALT水平降低（P=0.028）；與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組ALT顯著降低（Plt;0.001）。結(jié)果表明，CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠血清ALT水平升高，而補充1，25（OH）2D3后顯著降低了血清ALT水平（圖1）。

2.2 1，25（OH）2D3對NASH大鼠肝組織病理學(xué)的影響正常組、正常+1，25（OH）2D3組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，可見呈放射狀排列的肝細(xì)胞，并且以中央靜脈為中心分布，無脂滴形成，無炎細(xì)胞浸潤，無肝細(xì)胞壞死。與正常組相比，模型組大鼠肝細(xì)胞可見顯著增多的脂肪變性，且以大泡為主要分布，灶狀壞死病灶和炎細(xì)胞顯著增多；與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組大鼠肝組織脂肪變性、氣球樣變以及點狀壞死病灶顯著減少（圖2）。

實驗中大鼠均未出現(xiàn)肝纖維化表現(xiàn)，故SAF評分采用脂肪變性+活動度評估。大鼠肝組織病理學(xué)SAF評分的雙因素方差分析結(jié)果表明：CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH模型SAF評分顯著增加（gt;3分）（F=344.007，Plt;0.001）；1，25（OH）2D3干預(yù)后其顯著降低（lt;3分）（F=84.866，Plt;0.001），在1，25（OH）2D3和飲食誘導(dǎo)NASH大鼠之間存在顯著交互作用（F=84.870，Plt;0.001）。與正常組相比，模型組SAF評分顯著增加（Plt;0.001）；與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組SAF評分顯著降低（Plt;0.001）。結(jié)果表明，CDAA飲食誘導(dǎo)的大鼠屬于NASH階段，補充1，25（OH）2D3后大鼠逆轉(zhuǎn)為脂肪肝階段（表2）。

2.3 1，25（OH）2D3對NASH大鼠肝巨噬細(xì)胞及炎癥因子的影響

2.3.1 1，25（OH）2D3對NASH大鼠肝組織巨噬細(xì)胞的影響（1）大鼠肝組織M1型巨噬細(xì)胞的雙因素方差分析表明：CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型M1型巨噬細(xì)胞顯著增加（F=178.334，Plt;0.001），1，25（OH）2D3干預(yù)后顯著減少（F=119.392，Plt;0.001），在1，25（OH）2D3和飲食誘導(dǎo)NASH大鼠模型之間具有顯著的交互作用（F=63.061，Plt;0.001）。與正常組相比，模型組M1型巨噬細(xì)胞顯著增加（Plt;0.001）；與正常+1，25（OH）2D3組相比，模型+1，25（OH）2D3組M1型巨噬細(xì)胞顯著增加（P=0.001）；與正常組相比，正常+1，25（OH）2D3組M1型巨噬細(xì)胞減少（P=0.048）；與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組M1型巨噬細(xì)胞顯著減少（Plt;0.001）。結(jié)果表明，CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠肝組織M1型巨噬細(xì)胞顯著增加，補充1，25（OH）2D3后顯著降低了肝組織M1型巨噬細(xì)胞水平（圖3a、c）。

（2）大鼠肝組織M2型巨噬細(xì)胞的雙因素方差分析表明：CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型M2型巨噬細(xì)胞無顯著變化（F=0.206，Pgt;0.05），1，25（OH）2D3顯著增加其表達（F=6.805，P=0.017），在1，25（OH）2D3和飲食誘導(dǎo)NASH大鼠之間具有交互作用（F=8.598，P=0.008）。與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組M2型巨噬細(xì)胞顯著增加（P=0.001）。結(jié)果表明，補充1，25（OH）2D3后顯著增加了CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠肝組織M2型巨噬細(xì)胞水平（圖3b、c）。

（3）大鼠肝組織巨噬細(xì)胞M1/M2表型比值雙因素方差分析表明：CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH模型M1/M2表型比值顯著增加（F=13.672，P=0.001），1，25（OH）2D3干預(yù)后其比值降低（F=13.802，P=0.001），在1，25（OH）2D3和飲食誘導(dǎo)NASH大鼠之間具有交互作用（F=10.055，P=0.005）。與正常組相比，模型組M1/M2表型比值顯著增加（Plt;0.001）；與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組M1/M2表型比值顯著降低（Plt;0.001）。結(jié)果表明，CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠巨噬細(xì)胞以M1表型為主，補充1，25（OH）2D3后顯著降低了CDAA飲食誘導(dǎo)的大鼠肝組織巨噬細(xì)胞M1/M2型比值，巨噬細(xì)胞以M2表型為主（圖3c）。

2.3.2 1，25（OH）2D3對NASH大鼠肝組織促炎因子水平的影響（1）大鼠肝組織TNF-α水平的雙因素方差分析結(jié)果表明：CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型其水平顯著升高（F=118.11，Plt;0.001），1，25（OH）2D3未顯著影響其水平（F=2.362，Pgt;0.05），在1，25（OH）2D3和飲食誘導(dǎo)NASH大鼠之間具有交互作用（F=40.183，Plt;0.001）。與正常組相比，模型組大鼠TNF-α顯著升高（Plt;0.001）；與正常+1，25（OH）2D3組相比，模型+1，25（OH）2D3組大鼠TNF-α顯著升高（P=0.004）；與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組大鼠TNF-α顯著降低（P=0.003）。結(jié)果表明，1，25（OH）2D3對TNF-α水平無顯著影響，而CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠肝組織TNF-α水平顯著升高，補充1，25（OH）2D3后可以逆轉(zhuǎn)（圖4）。

（2）大鼠肝組織IL-1β水平的雙因素方差分析結(jié)果表明：CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型IL-1β水平無顯著變化（F=0.530，Pgt;0.05），1，25（OH）2D3和飲食誘導(dǎo)NASH大鼠之間也無顯著交互作用（F=0.640，Pgt;0.05），而1，25（OH）2D3可降低其水平（F=31.250，Plt;0.001）。與正常組相比，正常+1，25（OH）2D3組IL-1β顯著降低（P=0.003）；與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組IL-1β顯著降低（Plt;0.001）。結(jié)果表明，1，25（OH）2D3可顯著降低IL-1β水平，但IL-1β在CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型中無顯著變化（圖4）。

2.3.3 1，25（OH）2D3對NASH大鼠肝組織抗炎因子水平的影響（1）大鼠肝組織IL-10水平的雙因素方差分析結(jié)果表明：CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型其水平無顯著變化（F=4.279，Pgt;0.05），1，25（OH）2D3可提高其水平（F=4.866，P=0.039），在1，25（OH）2D3和飲食誘導(dǎo)NASH大鼠之間具有交互作用（F=4.946，P=0.038）。與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組IL-10顯著升高（P=0.005）；與正常+1，25（OH）2D3組相比，模型+1，25（OH）2D3組IL-10升高（P=0.007）。結(jié)果表明，1，25（OH）2D3可提高肝組織IL-10水平，補充1，25（OH）2D3后可顯著提高CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠肝組織IL-10水平，然而CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型IL-10水平無顯著變化（圖5）。

（2）大鼠肝組織IL-4水平的雙因素方差分析結(jié)果表明：CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型其水平明顯降低（F=5.881，P=0.025），1，25（OH）2D3可提高其水平（F=240.514，Plt;0.001），在1，25（OH）2D3和飲食誘導(dǎo)NASH大鼠之間具有交互作用（F=75.914，Plt;0.001）。與正常組相比，模型組IL-4水平顯著降低（Plt;0.001），正常+1，25（OH）2D3組IL-4水平升高（Plt;0.001）；與正常+1，25（OH）2D3組相比，模型+1，25（OH）2D3組IL-4水平升高（Plt;0.001）；與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組IL-4水平顯著升高（Plt;0.001）。結(jié)果表明，CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠肝組織IL-4表達降低，補充1，25（OH）2D3后顯著升高了CDAA飲食誘導(dǎo)的大鼠肝組織IL-4水平（圖5）。

2.4 1，25（OH）2D3對NASH大鼠PPAR-γ水平的影響大鼠肝組織PPAR-γ水平的雙因素方差分析結(jié)果表明：CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型其水平無顯著變化（F=0.231，Pgt;0.05），1，25（OH）2D3可提高其水平（F=6.967，P=0.016），在1，25（OH）2D3和飲食誘導(dǎo)NASH大鼠之間具有交互作用（F=8.342，P=0.009）。與正常組相比，模型組PPAR-γ水平顯著下降（P=0.027）；與模型組相比，模型+1，25（OH）2D3組PPAR-γ水平顯著升高（P=0.001）。結(jié)果表明，1，25（OH）2D3干預(yù)后顯著升高了CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠PPAR-γ水平，然而CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型PPAR-γ水平無顯著變化（圖6）。

2.5肝組織PPAR-γ水平與巨噬細(xì)胞以及M1/M2表型比值、炎癥因子的相關(guān)性分析PPAR-γ與肝巨噬細(xì)胞M1/M2表型比值、IL-1β呈負(fù)相關(guān)（r值分別為?0.415、?0.471，P值分別為0.044、0.020）；與M2型肝巨噬細(xì)胞、IL-10、IL-4呈正相關(guān)（r值分別為0.435、0.433、0.532，P值分別為0.033、0.035、0.007）。

3討論

既往研究報道，CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH模型血清轉(zhuǎn)氨酶顯著升高［15-16］，肝組織病理學(xué)表現(xiàn)出以大泡為主的混合型肝脂肪變性，引起不同程度的炎癥［17-18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠血清ALT、AST顯著升高，肝組織病理學(xué)SAF評分明顯提高，肝組織抗炎因子IL-4分泌顯著減少。這表明，CDAA飲食可引起類似人類NASH的肝組織損傷和炎癥。

肝巨噬細(xì)胞表型變化在NASH的發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色［19］。既往研究報道，NASH患者與正常人相比肝臟巨噬細(xì)胞M1/M2表型比值增加［20］，在本研究中也觀察到相似的結(jié)果。本研究中CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH模型M1型肝巨噬細(xì)胞表達顯著增加，肝巨噬細(xì)胞M1/M2表型比值顯著升高，表明CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型肝臟以M1型肝巨噬細(xì)胞為主。此外，既往研究表明，CDAA飲食誘導(dǎo)NASH模型中促炎因子TNF-α顯著增加［16-17］，本研究結(jié)果與其一致，證實該模型成功誘導(dǎo)了NASH炎癥反應(yīng)。

既往研究已證明1，25（OH）2D3具有抗炎作用［10，21］。而且1，25（OH）2D3缺乏與NASH患者肝組織病理學(xué)的惡化如小葉炎癥的加劇相關(guān)［22］。研究顯示，1，25（OH）2D3可以顯著降低嚙齒類動物血清AST、ALT水平［23-24］，顯著改善肝組織病理學(xué)［25-26］。筆者在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，1，25（OH）2D3可以呈劑量依賴性的降低CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型的血清AST、ALT水平及肝臟組織病理學(xué)評分，從而改善肝臟炎癥，然而尚不清楚這種作用是否為特異性［10］。因此，本研究通過雙因素方差分析方法觀察補充1，25（OH）2D3對CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠肝損傷及肝組織病理學(xué)的影響。研究結(jié)果證實，補充1，25（OH）2D3可拮抗CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型肝損傷和肝組織病理學(xué)的加重，改善肝臟炎癥。

研究表明，1，25（OH）2D3可抑制鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的M1型巨噬細(xì)胞表達，提高M2表型巨噬細(xì)胞表達，促進M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變［27］。1，25（OH）2D3可顯著降低蛋氨酸膽堿缺乏飲食（methionine choline deficiency diet，MCD）誘導(dǎo)的NASH模型肝組織IL-1β水平表達［28］。此外，補充1，25（OH）2D3可顯著升高糖尿病患者血清IL-10和IL-4水平［29-30］。本研究結(jié)果顯示，1，25（OH）2D3顯著增加了肝組織M2型巨噬細(xì)胞表達，降低了肝組織M1型巨噬細(xì)胞和M1/M2表型比值；1，25（OH）2D3干預(yù)后促炎因子IL-1β水平顯著降低，抗炎因子IL-10和IL-4水平顯著升高，與以往研究報道結(jié)果一致。進一步研究還顯示，1，25（OH）2D3與NASH模型在M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、M1/M2表型比值、TNF-α、IL-10及IL-4中存在顯著交互作用。這表明1，25（OH）2D3可促進肝巨噬細(xì)胞表型由M1型向M2型轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變可能是1，25（OH）2D3抗炎作用的一個關(guān)鍵機制。上述發(fā)現(xiàn)均證實1，25（OH）2D3在抗炎過程中的潛在作用。

PPAR-γ是巨噬細(xì)胞M2型極化的主要調(diào)節(jié)因子。在國外一項以高葡萄糖誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞的體外研究中發(fā)現(xiàn)，1，25（OH）2D3促進PPAR-γ表達，促進M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變，并且PPAR-γ拮抗劑干預(yù)后，1，25（OH）2D3誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞極化被消除［12］。上述結(jié)果提示PPAR-γ受維生素D3調(diào)控，但目前尚無報道1，25（OH）2D3是否通過調(diào)控PPAR-γ對NASH肝臟起保護作用。本研究初步探討發(fā)現(xiàn)，給予1，25（OH）2D3干預(yù)后肝組織PPAR-γ顯著升高，進一步研究發(fā)現(xiàn)1，25（OH）2D3與NASH模型在肝組織PPAR-γ中存在顯著交互作用，且PPAR-γ與肝巨噬細(xì)胞M1/M2表型比值、肝組織IL-1β水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與肝組織M2型巨噬細(xì)胞、IL-4、IL-10水平呈顯著正相關(guān)。然而，NASH肝組織PPAR-γ水平與TNF-α水平無相關(guān)性，推測TNF-α水平的改變主要受其上游NF-κB水平的影響。綜上，1，25（OH）2D3可能通過提高PPAR-γ表達，逆轉(zhuǎn)CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型肝組織M2型巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)變，提高抗炎因子水平，起到抗炎作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠肝組織巨噬細(xì)胞以M1型為主，以TNF-α為主的炎癥因子含量增加，促進NASH肝臟炎癥反應(yīng)；1，25（OH）2D3促進CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠肝組織PPAR-γ表達，促使肝巨噬細(xì)胞M1型轉(zhuǎn)換為M2型，增加肝組織IL-10、IL-4水平，減少了促炎因子IL-1β的表達，從而改善NASH肝臟炎癥，延緩疾病進展。后續(xù)將進一步通過給予PPAR-γ拮抗劑觀察1，25（OH）2D3對CDAA飲食誘導(dǎo)的NASH肝臟M1/M2表型轉(zhuǎn)變以及肝臟炎癥的影響，明確1，25（OH）2D3通過PPAR-γ調(diào)控巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的作用機制，以期為維生素D3防治NASH患者的炎癥提供理論依據(jù)，為臨床防治NASH提供新的思路和方法。

倫理學(xué)聲明：動物的實驗流程嚴(yán)格遵循中國實驗動物管理協(xié)會的倫理原則，并于2023年9月11日經(jīng)由延邊大學(xué)實驗動物福利倫理委員會審批，批號：YD202309110024。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：朱海洋負(fù)責(zé)分析數(shù)據(jù)、撰寫論文和參與課題設(shè)計；崔京淑負(fù)責(zé)病理實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計；楊柳、周夢婷、童戩參與實驗操作、數(shù)據(jù)統(tǒng)計，修改論文；韓紅梅負(fù)責(zé)課題設(shè)計、擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

參考文獻：

[1]MA KF，CHEN YH，LIANG XG，et al.Inhibition of 5-lipoxygenase in?hibitor zileuton in high-fat diet-induced nonalcoholic fatty liver dis?ease progression model[J].Iran J Basic Med Sci，2017，20（11）：1207-1212.DOI：10.22038/IJBMS.2017.9482.

[2]YOUNOSSI ZM，KOENIG AB，ABDELATIF D，et al.Global epidemiol?ogy of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence，incidence，and outcomes[J].Hepatology，2016，64（1）：73-84.DOI：10.1002/hep.28431.

[3]TAKEGOSHI K，HONDA M，OKADA H，et al.Branched-chain amino acids prevent hepatic fibrosis and development of hepatocellular carcinoma in a non-alcoholic steatohepatitis mouse model[J].Onco?target，2017，8（11）：18191-18205.DOI：10.18632/oncotarget.15304.

[4]MIURA K，ISHIOKA M，IIJIMA K.The roles of the gut microbiota and toll-like receptors in obesity and nonalcoholic fatty liver disease[J].J Obes Metab Syndr，2017，26（2）：86-96.DOI：10.7570/jomes.2017.26.2.86.

[5]REMMERIE A，MARTENS L，SCOTT CL.Macrophage subsets in obesity，aligning the liver and adipose tissue[J].Front Endocrinol（Lausanne），2020，11：259.DOI：10.3389/fendo.2020.00259.

[6]DUARTE N，COELHO IC，PATARR?O RS，et al.How inflammation impinges on NAFLD：A role for kupffer cells[J].Biomed Res Int，2015，2015：984578.DOI：10.1155/2015/984578.

[7]RANNOU E，F(xiàn)RAN?OIS A，TOULLEC A，et al.In vivo evidence foran endothelium-dependent mechanism in radiation-induced normal tissue injury[J].Sci Rep，2015，5：15738.DOI：10.1038/srep15738.

[8]TANG DS，CAO F，YAN CS，et al.Extracellular vesicle/macrophage axis：Potential targets for inflammatory disease intervention[J].Front Immunol，2022，13：705472.DOI：10.3389/fimmu.2022.705472.

[9]NI YH，NAGASHIMADA M，ZHAN LL，et al.Prevention and reversal of lipotoxicity-induced hepatic insulin resistance and steatohepatitis in mice by an antioxidant carotenoid，β-cryptoxanthin[J].Endocri?nology，2015，156（3）：987-999.DOI：10.1210/en.2014-1776.

[10]HAN H，CUI M，YOU X，et al.A role of 1，25（OH）2D3 supplementa?tion in rats with nonalcoholic steatohepatitis induced by choline-defi?cient diet[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2015，25（6）：556-561.DOI：10.1016/j.numecd.2015.02.011.

[11]LUO WJ，XU QY，WANG Q，et al.Effect of modulation of PPAR-γac?tivity on Kupffer cells M1/M2 polarization in the development of non-alcoholic fatty liver disease[J].Sci Rep，2017，7：44612.DOI：10.1038/srep44612.

[12]ZHANG XL，ZHOU M，GUO YF，et al.1，25-dihydroxyvitamin D?pro?motes high glucose-induced M1 macrophage switching to M2 via the VDR-PPARγsignaling pathway[J].Biomed Res Int，2015，2015：157834.DOI：10.1155/2015/157834.

[13]European Association for the Study of the Liver，European Associa?tion for the Study of Diabetes，European Association for the Study of Obesity.EASL-EASD-EASO clinical practice guidelines for the man?agement of non-alcoholic fatty liver disease[J].J Hepatol，2016，64（6）：1388-1402.DOI：10.1016/j.jhep.2015.11.004.

[14]BEDOSSA P，PATHOLOGY CONSORTIUM FLIP.Utility and appro?priateness of the fatty liver inhibition of progression（FLIP）algo?rithm and steatosis，activity，and fibrosis（SAF）score in the evalua?tion of biopsies of nonalcoholic fatty liver disease[J].Hepatology，2014，60（2）：565-575.DOI：10.1002/hep.27173.

[15]YANG YM，WANG ZJ，MATSUDA M，et al.Inhibition of hyaluronan synthesis by 4-methylumbelliferone ameliorates non-alcoholic ste?atohepatitis in choline-deficient L-amino acid-defined diet-induced murine model[J].Arch Pharm Res，2021，44（2）：230-240.DOI：10.1007/s12272-021-01309-7.

[16]NAKANISHI K，KAJI K，KITADE M，et al.Exogenous administration of low-dose lipopolysaccharide potentiates liver fibrosis in a choline-defi?cient l-amino-acid-defined diet-induced murine steatohepatitis model[J].Int J Mol Sci，2019，20（11）：2724.DOI：10.3390/ijms20112724.

[17]KUCSERA D，TóTH VE，GERG。D，et al.Characterization of the CDAA diet-induced non-alcoholic steatohepatitis model：Sex-specific differences in inflammation，fibrosis，and cholesterol metabolism in middle-aged mice[J].Front Physiol，2021，12：609465.DOI：10.3389/fphys.2021.609465.

[18]POVERO D，EGUCHI A，LI HY，et al.Circulating extracellular vesicles with specific proteome and liver microRNAs are potential biomarkers for liver injury in experimental fatty liver disease[J].PLoS One，2014，9（12）：e113651.DOI：10.1371/journal.pone.0113651.

[19]XU L，KITADE H，NI YH，et al.Roles of chemokines and chemokine receptors in obesity-associated insulin resistance and nonalcoholic fatty liver disease[J].Biomolecules，2015，5（3）：1563-1579.DOI：10.3390/biom5031563.

[20]VONGHIA L，MAGRONE T，VERRIJKEN A，et al.Peripheral and he?patic vein cytokine levels in correlation with non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）-related metabolic，histological，and haemodynamic features[J].PLoS One，2015，10（11）：e0143380.DOI：10.1371/jour?nal.pone.0143380.

[21]CIMINI FA，BARCHETTA I，CAROTTI S，et al.Relationship between adipose tissue dysfunction，vitamin D deficiency and the pathogen?esis of non-alcoholic fatty liver disease[J].World J Gastroenterol，2017，23（19）：3407-3417.DOI：10.3748/wjg.v23.i19.3407.

[22]NELSON JE，ROTH CL，WILSON LA，et al.Vitamin D deficiency is associated with increased risk of non-alcoholic steatohepatitis in adults with non-alcoholic fatty liver disease：Possible role for MAPK and NF-κB？[J].Am J Gastroenterol，2016，111（6）：852-863.DOI：10.1038/ajg.2016.51.

[23]ZHANG HW，LIU YM，F(xiàn)ANG X，et al.Vitamin D3 protects mice from diquat-induced oxidative stress through the NF-κB/Nrf2/HO-1 signal?ing pathway[J].Oxid Med Cell Longev，2021，2021：6776956.DOI：10.1155/2021/6776956.

[24]KHEDER R，HOBKIRK J，SAEED Z，et al.Vitamin D3 supplementa?tion of a high fat high sugar diet ameliorates prediabetic phenotype in female LDLR?/?and LDLR+/+mice[J].Immun Inflamm Dis，2017，5（2）：151-162.DOI：10.1002/iid3.154.

[25]REDA D，ELSHOPAKEY GE，ALBUKHARI TA，et al.Vitamin D3 allevi?ates nonalcoholic fatty liver disease in rats by inhibiting hepatic oxida?tive stress and inflammation via the SREBP-1-c/PPARα-NF-κB/IR-S2 signaling pathway[J].Front Pharmacol，2023，14：1164512.DOI：10.3389/fphar.2023.1164512.

[26]YIN Y，YU ZW，XIA M，et al.Vitamin D attenuates high fat diet-in?duced hepatic steatosis in rats by modulating lipid metabolism[J].Eur J Clin Invest，2012，42（11）：1189-1196.DOI：10.1111/j.1365-2362.2012.02706.x.

[27]ZHANG XL，GUO YF，SONG ZX，et al.Vitamin D prevents podocyte injury via regulation of macrophage M1/M2 phenotype in diabetic nephropathy rats[J].Endocrinology，2014，155（12）：4939-4950.DOI：10.1210/en.2014-1020.

[28]MU YM，LI JT，KANG JH，et al.A lipid-based nanocarrier containingactive vitamin D ameliorates NASH in mice via direct and intestine-mediated effects on liver inflammation[J].Biol Pharm Bull，2020，43（9）：1413-1420.DOI：10.1248/bpb.b20-00432.

[29]SHAB-BIDAR S，NEYESTANI TR，DJAZAYERY A，et al.Improvement of vitamin D status resulted in amelioration of biomarkers of sys?temic inflammation in the subjects with type 2 diabetes[J].Diabe?tes Metab Res Rev，2012，28（5）：424-430.DOI：10.1002/dmrr.2290.

[30]KOMISARENKO YI，BOBRYK MI.Vitamin D deficiency and immune disorders in combined endocrine pathology[J].Front Endocrinol（Lausanne），2018，9：600.DOI：10.3389/fendo.2018.00600.

收稿日期：2024-07-01；錄用日期：2024-09-30

本文編輯：劉曉紅