摘 要：

本研究從牛腸病毒（BEV）陽(yáng)性糞便中通過接種BHK細(xì)胞進(jìn)行蝕斑純化分離得到一株F型腸道病毒，經(jīng)過RT-PCR鑒定正確后送生物公司進(jìn)行全基因測(cè)序以及進(jìn)行TCID50的測(cè)定，以MEGA11.0等生物信息學(xué)軟件對(duì)BEV全基因進(jìn)行分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。以原核表達(dá)方式得到含BEV分離株VP3基因的重組蛋白，作為包被抗原，建立檢測(cè)抗體的間接ELISA方法，并對(duì)建立的ELISA方法的特異性、靈敏性、重復(fù)性進(jìn)行測(cè)定與用于臨床樣品的檢測(cè)。結(jié)果顯示，BEV分離株的TCID50為10-6.26·mL-1，病毒分離株全長(zhǎng)為7 439 nt，ORF大小為6 504 bp，編碼2 168個(gè)氨基酸，與F型腸道病毒BEV4遺傳關(guān)系最近且核苷酸相似性最高，故分離到的病毒為F型腸道病毒，暫命名為BEV-QD，與其他F型毒株相比，BEV-QD株存在氨基酸的突變以及缺失并且大多集中在P2、P3區(qū)。本次建立的抗體檢測(cè)間接ELISA方法重復(fù)性良好；陽(yáng)性血清稀釋1 600倍后結(jié)果仍呈現(xiàn)陽(yáng)性，靈敏性良好；與BVDV等陽(yáng)性血清不發(fā)生特異性結(jié)合，特異性良好；檢測(cè)40份臨床樣品中，13份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為32.5%。本研究分離到一株F型牛腸病毒突變株，建立了一種抗體間接ELISA方法。為牛腸病毒的檢測(cè)和防控提供了基礎(chǔ)手段。

關(guān)鍵詞：

牛腸道病毒；分離鑒定；TCID50；全基因組分析；ELISA

中圖分類號(hào)：

S855.3 """"文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)： 0366-6964（2025）02-0814-12

收稿日期：2024-04-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFD0501403）

作者簡(jiǎn)介：劉 健（1999-），男，漢族，山東鄒平人，碩士生，主要從事畜禽疫病的防治研究，E-mail：815846879@qq.com；于澤海（1998-），男，漢族，山東萊陽(yáng)人，碩士生，主要從事畜禽疫病的防治研究，E-mail：1062100624@qq.com。劉健與于澤海是同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：徐守振，主要從事畜禽疫病的防治研究，E-mail： xsz2738@sina.com.cn，Tel：0532-86080734

Full-genome Analysis of a Bovine Enterovirus Type F and the Establishment of an Indirect ELISA Method for Antibody Detection

LIU" Jian， YU" Zehai， ZHANG" Meiyu， LI" Dan， WANG" Jun， LIU" Fangqin， ZHANG" Qun， XU" Shouzhen*

（College of Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China）

Abstract：

In this study， a strain of F-type enterovirus was isolated from bovine enterovirus（BEV） positive feces through plaque purification by inoculating BHK cells. After being correctly identified by RT-PCR， it was sent to a biological company for whole-genome sequencing and TCID50 determination. The whole genome of BEV was analyzed and a genetic evolution tree was constructed using bioinformatics software such as MEGA11.0. The recombinant protein containing the VP3 gene of the BEV isolate was obtained through prokaryotic expression and used as a coating antigen to establish an indirect ELISA method for detecting antibodies. The specificity， sensitivity， and repeatability of the established ELISA method were measured and used for the detection of clinical samples. The results showed that the TCID50 of the BEV isolate was 10-6.26·mL-1， and the full length of the virus isolate was 7 439 nt， with an ORF size of 6 504 bp， encoding 2 168 amino acids. It had the closest genetic relationship and the highest nucleotide homology with F-type enterovirus BEV4. Therefore， the isolated virus was an F-type enterovirus， temporarily named BEV-QD. Compared with other F-type strains， the BEV-QD strain had amino acid mutations and deletions， mostly concentrated in the P2 and P3 regions. The indirect ELISA method for antibody detection established in this study had good repeatability; the results remained positive after the positive serum was diluted 1 600 times， indicating good sensitivity; it did not specifically bind to positive sera such as BVDV， indicating good specificity; among the 40 clinical samples tested， 13 were positive， with a positive rate of 32.5%. This study isolated an F-type bovine enterovirus mutant strain and established an indirect ELISA method for antibody detection， providing a basic means for the detection and prevention of bovine enterovirus.

Key words：

bovine enterovirus; isolation and identification; TCID50; whole-genome analysis; ELISA

*Corresponding author：" XU Shouzhen，E-mail：xsz2738@sina.com.cn

腸道病毒屬腸道病毒（enteroviruses，EV）分為 15 個(gè)種，即腸道病毒A～L 以及鼻病毒A～C。牛腸病毒（bovine enteroviruses，BEV）是一種單股正鏈 RNA 病毒，屬于微RNA病毒科腸病毒屬［1-4］，主要分為E型與F型，是引起牛呼吸道和胃腸道疾病相關(guān)的主要病原體［5］。自1959年Moll和Davis首次分離出BEV以來，腸道病毒的感染在世界范圍內(nèi)得到廣泛關(guān)注［6-9］。臨床牛感染腸道病毒后，由于前期癥狀較輕，容易被忽視，在牛免疫力低下或者與其它病原體混合感染的作用下，后期會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉、不孕癥等危害［10］。腸道病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，全長(zhǎng)7 000 bp 左右，只存在一個(gè)開放閱讀框（ORF），編碼P1區(qū)四種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）以及非結(jié)構(gòu)蛋白P2區(qū)（2A、2B、2C）、P3（3A、3B、3C、3D）區(qū)。在病毒表面是結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3，這三種結(jié)構(gòu)蛋白存在中和抗體的抗原表位，VP4與7種非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒內(nèi)部，與病毒的增殖以及代謝有關(guān)。季程遠(yuǎn)等［11］利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)BEV-VP2蛋白，成功構(gòu)建檢測(cè)BEV抗體的間接ELISA方法，但VP3作為BEV外殼蛋白之一，針對(duì)其免疫原性的研究在國(guó)外、國(guó)內(nèi)均報(bào)道較少，其在BEV感染、免疫及疫苗研究中的重要地位不容忽視［12］。本研究從BEV陽(yáng)性樣品中分離得到一株F型腸道病毒并對(duì)其進(jìn)行分析，氨基酸blast結(jié)果顯示VP3基因與E型、F型EV的相似性比VP2基因高，所以在此基礎(chǔ)上利用VP3基因又建立了一種抗體間接ELISA方法，為診斷試劑的開發(fā)和BEV疫苗的研制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞和樣品

幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK細(xì)胞）、BEV陽(yáng)性樣品、BEV陰性和陽(yáng)性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、100×青霉素雙抗、購(gòu)自HyClone公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自金康源公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自艾科瑞生物公司；PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自TaKaRa生物公司；BeyoECL Plus超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天公司；His-Tagged Protein Purification Kit（Soluble Protein）購(gòu)自康為試劑公司。

1.2 病毒分離培養(yǎng)

BHK細(xì)胞生長(zhǎng)至單層細(xì)胞后，棄生長(zhǎng)液，PBS 洗兩次后，取100 μL用0.2 μm濾器過濾好的用RT-PCR方法初步確定疑似含有BEV的樣品液與900 μL DMEM混合后加入細(xì)胞瓶，培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄液，PBS洗兩次，加入維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，加入1 mL DMEM。培養(yǎng)1～2 d 進(jìn)行收毒，放入-80℃。反復(fù)凍融 3 次，再繼續(xù)盲傳3代，觀察細(xì)胞病變（CPE）情況，同時(shí)收集病毒液進(jìn)行蝕斑克隆純化病毒后測(cè)定病毒TCID50。

1.3 RT-PCR及測(cè)序鑒定

將純化得到的病毒液用RNA提取試劑盒提取RNA，應(yīng)用艾科瑞反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄后，用引物BEV-F：5′-GGGGAGTAGTCCGACTCCGC-3′，BEV-R：5′-CAGAGCTACCACTGGGGTTGTGG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?5℃，5 min；（95℃，30 s；62℃，30 s；72℃，30 s）35個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.4 全基因組測(cè)序及分析

將純化后的病毒液送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行全基因測(cè)序。在GenBank上選取了不同來源、不同時(shí)期、不同地區(qū)的19株EV，19株EV詳細(xì)信息見表1。應(yīng)用MEGA11.0與MegAlign等生物信息分析軟件分析BEV分離株同其他BEV參考毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系和核苷酸同源比對(duì)情況以及BEV分離株發(fā)生的氨基酸突變現(xiàn)象，并采用Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹。構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹與核苷酸比較的區(qū)域片段分別為基因組全長(zhǎng)、ORF、 5′UTR、VP1、VP2、VP3。

1.5 VP3重組蛋白的原核表達(dá)

根據(jù)BEV分離株的VP3基因設(shè)計(jì)表達(dá)引物，引物序列如下，VP3-F：5′-CGCGGATCCGGCCTTCCGACCATGTAT-3′；VP3-R：5′-CCGGAATTCTTGGAGCGCAGCAGT-3′。利用BEV cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后純化得到的目的片段與pCold-TF載體利用BamHⅠ、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)，挑取單菌落利用pCold-TF通用引物進(jìn)行鑒定并送生工公司進(jìn)行測(cè)序。將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞，搖菌至培養(yǎng)菌OD值為0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析，確定表達(dá)后用康為蛋白純化試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，并使用BEV陽(yáng)性血清作為一抗、兔抗牛HRP標(biāo)記IgG作為二抗對(duì)純化后的目的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。

1.6 抗體間接ELISA方法的建立

1.6.1 最佳抗原包被濃度選擇

將純化后的VP3重組蛋白測(cè)定濃度后進(jìn)行稀釋，稀釋濃度分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 μg·mL-1，37℃恒溫放置2 h后，4℃包被過夜，測(cè)定OD450 nm值后計(jì)算變異系數(shù)（CV）及P/N值（陽(yáng)性抗體OD450 nm值/陰性抗體OD450 nm值）。

1.6.2 最佳封閉液及封閉時(shí)間的選擇

分別用5%脫脂奶粉、1%BSA、5%PEG 8 000、10%馬血清、20%馬血清作為封閉液，封閉1.0、1.5、2.0 h，計(jì)算變異系數(shù)及P/N值，從中選取最佳封閉條件。

1.6.3 待檢血清與酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的選擇

將待檢血清用9.89 g·L-1 PBS 緩沖液（pH=8.5）按1∶5、1：10、1：20、1：50、1∶100、1∶200進(jìn)行稀釋；以1∶5 000、1∶8 000、1∶1 0000對(duì)兔抗牛HRP標(biāo)記抗體進(jìn)行稀釋。計(jì)算變異系數(shù)及P/N值，確定待檢血清與HRP標(biāo)記抗體最佳稀釋倍數(shù)。

1.6.4 血清陰陽(yáng)臨界值的確定

用建立優(yōu)化好的方法測(cè)定40份陰性血清，每份血清做三個(gè)平行重復(fù)，根據(jù)結(jié)果算出平均值x及標(biāo)準(zhǔn)偏差s，按照判定規(guī)則：x+3s確定該方法的陰陽(yáng)性臨界值。

1.6.5 特異性試驗(yàn)

取BVDV陽(yáng)性血清、IBRV陽(yáng)性血清、Map陽(yáng)性血清、MB陽(yáng)性血清以及陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估本方法的特異性。

1.6.6 敏感性試驗(yàn)

將陽(yáng)性血清以1∶10、1∶40、1∶80、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200進(jìn)行稀釋，每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行重復(fù)，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，評(píng)價(jià)其敏感性。

1.6.7 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)取5份樣品，用確定的條件對(duì)5份樣品用3塊ELISA板進(jìn)行板間重復(fù)試驗(yàn)的測(cè)定。

1.7 臨床樣品檢測(cè)

隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)室2023年6月—2024年2月保存的來自山東省的40份牛血清進(jìn)行抗體檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 病毒蝕斑純化及TCID50測(cè)定

蝕斑純化結(jié)果見圖1，可以在10-6稀釋梯度看到明顯的空斑，接種DMEM培養(yǎng)基的陰性對(duì)照沒有看到空斑。

用Reed-Muench兩氏法測(cè)定BEV-QD株的TCID50為10-6.26·mL-1。

2.2 病毒PCR鑒定

PCR鑒定結(jié)果見圖2，得到一條與預(yù)期片段大小一致的特異條帶，片段大小為260 bp。

2.3 BEV分離株全基因序列的基因組結(jié)構(gòu)特征

病毒液送生工進(jìn)行全基因測(cè)序后將序列通過Sequencher軟件進(jìn)行拼接后利用MEGA11.0等軟件進(jìn)行分析。對(duì)病毒的全基因組序列進(jìn)行分析可知，病毒基因組序列全長(zhǎng)7 439 bp，用EditSeq中的ORF 查詢工具查找到ORF的長(zhǎng)度為6 504 bp，主要編碼大小為2 168個(gè)氨基酸，G+C%的含量為50.42%。5′UTR長(zhǎng)822 bp，3′UTR長(zhǎng)113 bp，BEV分離株與其他牛腸病毒株序列比對(duì)一致性最高為 88.43%。BEV基因組非編碼區(qū)及編碼區(qū)核苷酸數(shù)目及位置如表2所示。

2.4 BEV分離株遺傳進(jìn)化分析

進(jìn)化樹關(guān)系圖見圖3，從進(jìn)化樹可以看出BEV分離株全基因組與F群的腸道病毒位于同一個(gè)大分支，與F型毒株BEV4（GenBank accession No. ON986117.1）在進(jìn)化樹上處于一個(gè)小分支，遺傳關(guān)系最相近，而與其他F型毒株（HeN-YR91、BEV-261、PS89F2、PS87F3、HeN-B62、F4）、E型、G型、B型毒株在進(jìn)化樹上處于不同分支，關(guān)系較遠(yuǎn)。BEV分離株的 ORF、VP1、VP2、VP3基因的遺傳進(jìn)化結(jié)果與全長(zhǎng)序列的遺傳進(jìn)化結(jié)果相同。BEV分離株的 5′UTR 基因與F型毒株HeN-YR91（GenBank accession No. MN598018. 1）在進(jìn)化樹上處于同一分支，與其他F型毒株（BEV4、BEV-261、PS89F2、PS87F3、HeN-B62、F4）、E型、G型、B型毒株在進(jìn)化樹上處于不同分支。終上所述，BEV分離株和 F型親緣關(guān)系最近，和E型親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，跟B型、G型關(guān)系最遠(yuǎn)。全基因組、VP1、ORF 、VP2、VP3序列進(jìn)化樹分析結(jié)果相同，所以可以斷定BEV分離株屬于F型腸道病毒，暫命名為BEV-QD，而且BEV-QD株同F(xiàn)型毒株BEV4（GenBank accession No. ON986117.1）遺傳關(guān)系最相近。

2.5 BEV分離株核苷酸同源性分析

核苷酸比對(duì)結(jié)果見表3，結(jié)果顯示：BEV-QD株全基因序列、ORF、VP1、VP2、VP3基因均與F型中國(guó)株 BEV4（GenBank accession No. ON986117.1）的相似性較最高，堿基相似性為87.5%～89.0%，與其他F型毒株的相似性在 60.2%～81.0% ，與E型毒株相似性較低，為53.0%～74.5%，與其他物種EV全基因序列相比，相似性為20.1%～65.3%；BEV-QD株5′ UTR基因則與F型毒株YeN-YR91（GenBank accession No. MN598018.1）的相似性較最高，為95.6%，與 F型其他毒株跟E型毒株相似性分別為 76.7%～94.7% 和75.4%～80.6%，與其他物種EV 5′UTR序列相比，堿基相似性為 44.0%～78.0%。

綜上所述，BEV-QD株與F型毒株的相似性最高，且除5′UTR基因都與F型毒株BEV4的相似性較最高，再次表明BEV分離株在分型上屬于F型，并且牛腸病毒基因組成在流行過程中發(fā)生了變異。

2.6 BEV分離株氨基酸序列位點(diǎn)變異情況

應(yīng)用MEGA11.0生物信息學(xué)軟件分析BEV-QD株與選取19條EV中的F型毒株之間發(fā)生的氨基酸突變現(xiàn)象。ORF區(qū)存在18個(gè)氨基酸發(fā)生了突變，具體信息見表4。7個(gè)氨基酸缺失：2C基因存在3個(gè)氨基酸缺失；3A基因存在2個(gè)氨基酸缺失；3C基因存在2個(gè)氨基酸缺失。4個(gè)氨基酸增多：3C基因存在1個(gè)氨基酸增多；3D基因存在3個(gè)氨基酸增多。在第582、618、664、843、892、918、920位置氨基酸類型與F2型代表毒株相同，與其他F型不同。

2.7 VP3-Pcold-TF重組蛋白的表達(dá)鑒定

SDS-PAGE分析結(jié)果見圖4（A）?？梢悦黠@看到誘導(dǎo)后未超聲對(duì)照及超聲離心后的上清在79 ku處出現(xiàn)蛋白條帶，這與預(yù)期結(jié)果相符，說明VP3重組蛋白以可溶形式在BL21感受態(tài)中成功表達(dá)。將純化后的VP3重組蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果如圖4（B），可以看到在79 ku 左右出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符合。Western blot結(jié)果表明VP3重組蛋白正確表達(dá)。

2.8 重組VP3蛋白間接ELISA方法各條件優(yōu)化

重組VP3蛋白間接ELISA方法各條件優(yōu)化結(jié)果顯示，抗原包被濃度為1 μg·mL-1時(shí)，CV低于15%，有較好的重復(fù)性，P/N值相比其他組最大，為2.594；當(dāng)用10%馬血清作為封閉液時(shí)，CV低于15%，有較好重復(fù)性，P/N值相比其他組最大，為3.313；以1∶100對(duì)一抗進(jìn)行稀釋時(shí)，CV低于15%，有較好重復(fù)性，P/N值相比其他組最大，為3.832；當(dāng)將二抗按1∶8 000稀釋時(shí)，CV低于15%，有較好重復(fù)性，P/N值相比其他組最大，為3.832，比值最大。

所以經(jīng)過優(yōu)化后確定的最終條件以1 μg·mL-1為抗原包被濃度；以10%馬血清作為封閉液，以1 h作為封閉時(shí)間；以1∶100稀釋一抗；以1∶8 000稀釋二抗。

2.9 陰陽(yáng)性臨界值的確定

使用確定好的最佳條件，測(cè)定40份BEV抗體陰性血清，結(jié)果見OSID資料（開放科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容，可掃首頁(yè)OSID碼獲?。Y(jié)果顯示：陰性血清OD450平均值x-為0.402，標(biāo)準(zhǔn)差s為0.067，按照判定規(guī)則x-+3s，得到ELISA方法的陰陽(yáng)性臨界值為0.603，即樣品OD450 nm值≥0.603時(shí)結(jié)果為陽(yáng)性，反之判定為陰性。

2.10 特異性試驗(yàn)

應(yīng)用確定好的最佳條件，對(duì)Map抗體陽(yáng)性血清、BVDV抗體陽(yáng)性血清、IBRV 抗體陽(yáng)性血清以及MB抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表5，結(jié)果顯示：除BEV陽(yáng)性血清檢測(cè)OD450 nm值大于0.603，其他均是陰性，變異系數(shù)低于15%，說明建立的ELISA方法具有良好的特異性。

2.11 敏感性試驗(yàn)

敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表6，結(jié)果顯示：以1 600稀釋陽(yáng)性血清時(shí)，OD450 nm值大于0.603，且變異系數(shù)低于15%，說明本ELISA方法具有良好的敏感性。

2.12 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)抽取5份樣品進(jìn)行板間重復(fù)試驗(yàn)見表7，結(jié)果顯示：變異系數(shù)在2.415%～13.169%之間，均小于15%，重復(fù)性良好。

2.13 臨床樣品檢測(cè)

臨床樣品檢測(cè)中，檢測(cè)的40份樣品中存在13份陽(yáng)性樣品，27份陰性樣品，陽(yáng)性率為32.5%。

3 討 論

牛腸病毒（BEV）屬于微RNA病毒科，腸道病毒屬成員，分為E型（E1-E4）與F型（F1-F6）。BEV結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，全長(zhǎng)序列只有7 000 bp左右，只存在一個(gè)6 500 bp左右的開放閱讀框，主要編碼P1區(qū)、P2區(qū)以及P3區(qū)，P1區(qū)分為四種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為VP1、VP2、VP3及VP4，結(jié)構(gòu)蛋白VP4在病毒內(nèi)部，與病毒脫殼有關(guān)，結(jié)構(gòu)蛋白VP1-3分布在病毒表面，存在抗原表位，是病毒發(fā)揮感染功能的“主力軍”。P2區(qū)與P3區(qū)編碼七種非結(jié)構(gòu)蛋白，分別為2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。七種非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制以及代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。

從陽(yáng)性樣品中分離到一株BEV，并通過RT-PCR方法及測(cè)序鑒定正確。病毒滴度測(cè)定結(jié)果顯示得到BEV分離株在BHK細(xì)胞上的TCID50為10-6.26·mL-1，張海麗等［13］測(cè)定BEV分離株HLJ-3531在BKH細(xì)胞上的TCID50 為 10-8.87·0.1 mL-1，HLJ-4149分離株在BKH細(xì)胞上的TCID50為10-9.80·0.1 mL-1；張珊等［14］測(cè)定的分離株 BEV BJ101的滴度為10-6.42 TCID50·mL-1；相比之下，本試驗(yàn)所分離到的毒株病毒滴度比HLJ-3531、HLJ-4149分離株較低，與BEV BJ101分離株相差不大，這說明不同地區(qū)感染的BEV類型跟毒力存在差異，這可能是由于不同地區(qū)環(huán)境、動(dòng)物個(gè)體差異、樣品來源不同或者病毒變異造成的。

通過對(duì)全基因組分析，得到該BEV 分離株全長(zhǎng)7 439 bp，ORF的長(zhǎng)度為6 504 bp，主要編碼大小為2168個(gè)氨基酸的蛋白，G+C%的含量為50.42%。5′UTR長(zhǎng)822 bp，3′ UTR長(zhǎng)113 bp。這與王剛［15］分離的F型BEV的結(jié)構(gòu)特征差異不大；通過MEGA11.0生物信息學(xué)軟件分析該分離株與其他19條EV的全長(zhǎng)、ORF、VP1、VP2、VP3進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析得到BEV 分離株與F群的代表毒株在進(jìn)化樹上處于同一個(gè)大分支上，且與BEV4（GenBank accession No. ON986117.1）遺傳關(guān)系最相近，而與其他E型、G型、B型毒株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，說明本BEV分離株為F型腸道病毒并命名為BEV-QD。5′UTR分析顯示與F型毒株YeN-YR91的遺傳關(guān)系最近，可能是由于病毒進(jìn)化過程中5′UTR基因發(fā)生變異導(dǎo)致的。核苷酸同源性分析得到BEV-QD株除5′UTR基因外，都與BEV4 分離株相似性最高，各個(gè)基因與BEV4堿基相似度都為85%以上。BEV-QD株總體都與其他型相似性很低，這與遺傳進(jìn)化分析的結(jié)果相同，更加證實(shí)了BEV-QD株屬于F型腸道病毒；氨基酸分析顯示BEV分離株存在氨基酸的突變、缺失以及增多，大多數(shù)突變集中在非結(jié)構(gòu)區(qū)（P2、P3區(qū)），且大部分氨基酸與F2型代表毒株相同，說明該分離株很有可能屬于F2型腸道病毒，氨基酸的變異說明病毒在流行過程中在外部條件或者內(nèi)部功能問題發(fā)生了變異，P2、P3區(qū)與蛋白的代謝與復(fù)制有關(guān)，這些氨基酸的改變可能是導(dǎo)致BEV-QD株毒力改變的根本原因。

目前檢測(cè)BEV抗體的方法很少，血清中和試驗(yàn)對(duì)人員的操作技能以及專業(yè)知識(shí)的儲(chǔ)備能力要求較高，且不適合針對(duì)樣品量大的檢測(cè)。ELISA試驗(yàn)成本低、靈敏性高、操作簡(jiǎn)單，不需要特殊儀器，并且一次性可以檢測(cè)大量樣品，可以滿足對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)大規(guī)模的摸排工作。本研究通過測(cè)序得到的BEV-QD全基因序列中截取VP3序列，并成功連接到pCold-TF載體，利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功獲得重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析以及Western blot鑒定正確后純化，進(jìn)行ELISA方法的建立。對(duì)ELISA試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了封閉時(shí)間等條件的最佳結(jié)果，并對(duì)建立的ELISA方法進(jìn)行靈敏性、重復(fù)性、特異性的檢驗(yàn)，最終結(jié)果顯示該方法重復(fù)性良好，變異系數(shù)均小于15%；靈敏性較高，以1 600稀釋陽(yáng)性血清時(shí)結(jié)果仍顯示陽(yáng)性；與BVDV等陽(yáng)性血清不存在特異性結(jié)合。隨后取來自山東省的40份血清進(jìn)行臨床樣品的檢測(cè)，檢測(cè)到存在13份陽(yáng)性血清，陽(yáng)性率為32.5%。季程遠(yuǎn)等［11］用VP2重組蛋白建立了檢測(cè)抗體的ELISA方法，其方法在陽(yáng)性血清1∶800后就顯示為陰性，與之相比，本方法靈敏性更高，也不排除陽(yáng)性血清不同或重組蛋白抗原性差異造成的。郭金玉等［16］利用F型牛腸病毒VP1蛋白建立了抗體間接ELISA方法；與之相比，本試驗(yàn)確定的陰陽(yáng)性臨界值偏高，可能是陰性血清來源以及地區(qū)不同造成的。

一直以來，山東省在奶牛養(yǎng)殖領(lǐng)域都占據(jù)著舉足輕重的地位，近年來高發(fā)以腹瀉為主要癥狀的疾病，雖然BVDV是主要感染的病原體，但BEV的感染也相繼多發(fā)，本試驗(yàn)通過對(duì)BEV的分離鑒定和全基因組分析以及用VP3重組蛋白作為抗原進(jìn)行ELISA方法的建立為我國(guó)腸道病毒基因庫(kù)提供了新數(shù)據(jù)，對(duì)了解腸道病毒的流行病學(xué)和斬?cái)嗉夹g(shù)的研究提供了新依據(jù)，可為山東省進(jìn)行牛群BEV凈化排除提供技術(shù)支持，保護(hù)奶牛健康，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。

4 結(jié) 論

本研究應(yīng)用細(xì)胞接毒以及蝕斑純化技術(shù)分離得到一株牛腸病毒，經(jīng)RT-PCR鑒定正確。測(cè)定了分離株的病毒滴定。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)全基因組測(cè)序得到的BEV分離株的基本結(jié)構(gòu)、遺傳進(jìn)化關(guān)系、同源性、氨基酸進(jìn)行分析，最后得到該分離株的全長(zhǎng)序列以及各個(gè)蛋白區(qū)的具體位置和序列；確定該分離株屬于F型腸道病毒，并且與F型分離株BEV4的遺傳進(jìn)化關(guān)系以及同源性關(guān)系相近；與F型毒株相比BEV分離株氨基酸存在突變情況。

本研究利用原核表達(dá)成功得到VP3重組蛋白并進(jìn)行Western blot鑒定；用重組蛋白作為抗原建立了一種檢測(cè)BEV抗體的間接ELISA方法。結(jié)果顯示，本次建立的ELISA方法重復(fù)性好、靈敏性高且無特異性結(jié)合情況。

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（編輯 白永平）