摘 要:為挖掘西南手參醇提物的應用潛力,該研究采用高效液相色譜法、生化分析技術和MTT法,對西南手參醇提物的體外抗氧化活性和體外抗腫瘤活性進行了分析。結果表明:(1)供試西南手參醇提物中含有天麻素(質(zhì)量分數(shù)為2.5 mg·g-1,濃度為0.25%)。(2)西南手參醇提物對羥基自由基、ABTS+自由基以及DPPH自由基具有顯著的清除能力,并隨著濃度的升高,作用更加明顯,具有濃度依賴性,醇提物的濃度為2.0 mg·mL-1時最為顯著,2.0 mg·mL-1的醇提取物對羥基自由基、ABTS+自由基和DPPH自由基的清除率分別為81.68%、19.94%和48.16%;而天麻素僅對羥基自由基具有清除能力,對ABTS+自由基和DPPH自由基沒有清除能力。(3)2.0 mg·mL-1的西南手參醇提物對人肝癌SMMC-7721細胞和HepG-2細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為5.170 mg·mL-1和4.551 mg·mL-1,對人胃癌BGC-823細胞和MKN-45細胞的IC50分別為1.759 mg·mL-1和1.564 mg·mL-1,對人乳腺癌MDA-MB-231細胞IC50為2.665 mg·mL-1,對人膠質(zhì)瘤U251細胞的IC50為4.401 mg·mL-1,說明西南手參醇提物對人肝癌SMMC-7721細胞和HepG-2細胞、人胃癌BGC-823細胞和MKN-45細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞以及人膠質(zhì)瘤U251細胞活性均有顯著的抑制作用,其中對人胃癌BGC-823細胞和MKN-45細胞的抑制效果最為顯著,表明西南手參的抗腫瘤作用具有廣譜性。綜上認為,西南手參醇提物具有抗氧化活性,并且比其抗氧化活性物質(zhì)天麻素具有更廣譜的活性氧清除能力,依據(jù)活性氧與腫瘤發(fā)生之間的關系將其用于抗腫瘤的研究,發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的抗腫瘤特性和天然植物通過多種成分協(xié)同作用的特性,可抑制多種腫瘤細胞尤其是人胃癌細胞的增殖。
關鍵詞:西南手參,天麻素,醇提取物,抗氧化,抗腫瘤
中圖分類號:Q946
文獻標識碼:A
文章編號:1000-3142(2025)02-0337-10
基金項目:第四次全國中藥資源普查項目(2019PC006);九龍縣中藏藥資源調(diào)查及研究項目(HX20220274);四川省自然科學基金面上項目(23NSFSC0993)。
第一作者:范晶鈺(1999—),碩士,主要從事細胞學研究,(E-mail)1748914715@qq.com。
*通信作者:馬丹煒,博士,教授,主要從事植物科學研究,(E-mail)danwei10ma@126.com。
Evaluation of in vitro antioxidant and antitumor activity of alcohol extract from Gymnadenia orchidis
FAN Jingyu1,REN Yumin1,TANG Xian1,LI Jiuyi1,MA Danwei1,2*,NIE Shenming3
(1. College of Life Sciences,Sichuan Normal University,Chengdu 610101,China; 2. Key Laboratory of Land Resources Evaluation and Monitoring in Southwest China,Ministry of Education (Sichuan Normal University),Chengdu 610066,China; 3. Jiulong County Runde Chinese Herbal Medicine Technology Co.,Ltd.,Jiulong 626200,Sichuan,China)
Abstract:To investigate the potential applications of the alcohol extract from Gymnadenia orchidis,an in vitro study was conducted to evaluate its antioxidant activity and antitumor activity using high-performance liquid chromatography (HPLC),biochemical analysis technology,and the MTT method. The results were as follows:(1) Gastrodin was discovered in the alcohol extract from G. orchidis,with a mass fraction of 2.5 mg·g-1. The concentration of gastrodin in the alcohol extract was 0.25%. (2) The alcohol extract from G. orchidis demonstrated a significant scavenging capacity towards hydroxyl radicals,ABTS+ radicals,and DPPH radicals. The efficacy of the alcohol extract from G. orchidis becomed more pronounced with an increase in concentration,exhibiting a concentration-dependent response. The alcohol extract from G. orchidis demonstrated the most substantial scavenging capacity at a concentration of 2.0 mg·mL-1,the scavenging rates for hydroxyl radical,ABTS+ radical,and DPPH radical were 81.68%,19.94%,and 48.16%,respectively. In contrast,gastrodin solely exhibited scavenging activity towards hydroxyl radicals and lacked such activity towards ABTS+ and DPPH radicals. (3) The IC50 of the 2.0 mg·mL-1 alcohol extract from G. orchidis on SMMC-7721 and HepG-2 were 5.170 mg·mL-1 and 4.551 mg·mL-1,respectively. Similarly,the IC50 of BGC-823 and MKN-45 were 1.759 mg·mL-1 and 1.564 mg·mL-1,respectively,while the IC50 of MDA-MB-231 was 2.665 mg·mL-1. Furthermore,the IC50 of U251 was 4.401 mg·mL-1. The alcohol extract from G. orchidis demonstrated significant inhibitory effects on SMMC-7721,HepG-2,BGC-823,MKN-45,MDA-MB-231,and U251 cells. Notably,the inhibitory effects on BGC-823 and MKN-45 were the most pronounced,suggesting that the antitumor activity of the alcohol extract from G. orchidis exhibited a wide range of efficacy. The above findings of this research demonstrate that the alcohol extract from G. orchidis possesses antioxidant capabilities,and its ability to scavenge reactive oxygen species is more extensive than that of its antioxidant active component,gastrodin. Given the correlation between reactive oxygen species and tumorigenesis,the alcohol extract from G. orchidis was discovered to possess significant characteristics of antitumor and contributing to the synergistic effects of natural plants through its multiple components. The alcohol extract from G. orchidis can effectively inhibit the proliferation of various tumor cells,particularly those of human gastric cancer.
Key words:Gymnadenia orchidis,gastrodin,alcohol extracts,antioxidant,antitumor
據(jù)統(tǒng)計,人類有1/6的死亡是由癌癥引起的,最常見的癌癥有肝癌、胃癌、乳腺癌(Sung et al.,2021)。目前,在癌癥治療方面大多采用手術、放療、化療等手段,中醫(yī)藥作為補充和替代醫(yī)學發(fā)揮著重要的作用,中藥治療涉及多個靶點、多個通路,可以緩解化療藥物的副作用、實現(xiàn)協(xié)同治療的效果,在癌癥治療方面具有獨特的優(yōu)勢(陳鷹娜等,2023)。
手參屬(Gymnadenia)為蘭科(Orchidaceae)的草本植物,主要分布于俄羅斯、英國、中國、日本和朝鮮等國家海拔2 800~4 700 m的范圍內(nèi)(Shang et al.,2017)。手參屬的塊莖狀如手掌,又稱為手掌參。手參塊莖味甘、澀,具有補益氣血、生津止渴、增強體質(zhì)的功效,可用于治療神經(jīng)衰弱、失血、虧精、肺虛咳喘等疾?。ㄔ勒齽偟?,2010),是蒙醫(yī)和藏醫(yī)常用藥材。手參的藥用價值最早記載于《四部醫(yī)典》,在蒙醫(yī)和藏醫(yī)古籍如《晶珠本草》《本草圖鑒》《藍琉璃》等均有記載(岳正剛等,2010)。近年來,手參作為珍貴的傳統(tǒng)藥材逐漸受到關注,經(jīng)研究其化學成分包括二氫芪類、菲類、苷類、苯丙素類、異戊二烯類、脂肪酸衍生物等多種類型,藥理活性包括抗氧化、抗過敏、促進祖細胞增殖(李敏等,2006)。鄭振興等(2020)研究發(fā)現(xiàn),手參屬的西南手參(Gymnadenia orchidis)醇提物中含有天麻素。Qin等(2021)研究發(fā)現(xiàn),天麻素通過Fractalkine(CX3CL1)及其受體CX3CR1抑制脊髓小膠質(zhì)細胞的活化,從而緩解周圍神經(jīng)病變(CIPN),進而抑制P38/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路,降低炎癥因子TNF-α和白細胞介素-1β(IL-1β)的表達,從而抑制腫瘤的增殖。已有研究表明,天麻素可抑制肝癌(張恒,2023)、胃癌(季蒙蒙等,2015)、乳腺癌(李余星等,2017)以及膠質(zhì)瘤(伏計能等,2022)。腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移與氧化應激有關(Jiao et al.,2016)。手參醇提物(何侃亮等,2017)及其成分天麻素(Ahmad et al.,2019)均具有良好的抗氧化能力,但是否能夠通過其抗氧化功能抑制腫瘤細胞增殖還有待進一步考證。
藥用植物的活性成分受生長環(huán)境影響較大,不同產(chǎn)地的植物成分和藥效均具有較大的差異(Yang et al.,2018)。四川省甘孜藏族自治州九龍縣位于四川省西南部的橫斷山區(qū),植物資源十分豐富(余有德等,1989),過去由于地理位置偏僻,加上交通十分不便,其植物資源尤其是藥用植物資源的研究基礎較為薄弱。本課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn),九龍縣高寒草甸和灌叢西南手參分布廣泛,當?shù)鼐用癯3⑵鋲K莖用于滋補藥材。然而,目前尚不清楚九龍產(chǎn)西南手參塊莖天然產(chǎn)物中是否含有天麻素,是否具有抗氧化活性物質(zhì)和抗腫瘤活性物質(zhì)?;诖?,本研究以九龍縣產(chǎn)西南手參塊莖為研究對象,在測定其塊莖醇提物中天麻素含量的基礎上,評估西南手參醇提物和天麻素的抗氧化活性,并進一步采用MTT法研究西南手參醇提物對人肝癌細胞、人胃癌細胞、人乳腺癌細胞和人膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制效應,以期篩選出對西南手參醇提物敏感的腫瘤細胞,為西南手參醇提物抗腫瘤活性物質(zhì)的分離、抗腫瘤機制的深入研究奠定基礎,進而為九龍縣產(chǎn)西南手參資源的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
供試西南手參塊莖購自四川省甘孜藏族自治州九龍縣中藥材市場,經(jīng)四川師范大學馬丹煒教授鑒定為西南手參(Gymnadenia ordnidis)。
人肝癌SMMC-7721細胞和HepG-2細胞、人胃癌BGC-823細胞和MKN-45細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞均來自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。人膠質(zhì)瘤U251細胞購自中國科學院昆明細胞庫。
1.2 方法
1.2.1 西南手參醇提取物的制備
先將干燥的西南手參塊莖粉碎過篩后,按120(V/V)料液比加入75%乙醇溶液,30 ℃振蕩2 h,再熱回流提取2 h后,過濾得到濾液,重復2次以上操作。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,經(jīng)冷凍干燥得到西南手參醇提物干燥粉末,存放于4 ℃下備用(何侃亮等,2017)。
1.2.2 西南手參醇提取物中天麻素含量的測定
精密稱取西南手掌參醇提取物粉末1 g,加入50%的甲醇定容至10 mL,過0.45 μm濾膜,即得樣品溶液,采用液相色譜測定天麻素含量。
1.2.2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動相:甲醇0.1%磷酸水溶液(595);流速:0.8 mL·min-1;檢測波長:220 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL(吳燕等,2017;鄭振興等,2020)。
1.2.2.2 線性關系考察 精密量取天麻素標品,用甲醇準確配置成濃度為0.030、0.070、0.140、0.210、0.280、0.350、0.420 mg·mL-1的系列標品溶液,取各標品溶液進樣10 μL,記錄峰面積。以進樣量(μg)為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),得天麻素的回歸方程。
1.2.3 西南手參醇提取物體外抗氧化活性測定
1.2.3.1 羥基自由基清除能力的測定 精確配制濃度為0.5、1、2 mg·mL-1的西南手參醇提物溶液,將9 mmol·L-1 FeSO4溶液、9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液、10 mmol·L-1 H2O2溶液各2 mL與各組待測西南手參醇提物溶液混合,在37 ℃下水浴30 min,運用MD/SpectraMaxM2多功能細胞分析儀在510 nm處分別測其吸光度。以維生素C作為陽性對照。每個處理重復3次。羥基自由基清除率計算公式(Husain et al.,1987):
羥基自由基清除率(%)= [1-(A樣品-A對照)/A空白]×100(1)
式中:A樣品為實驗組吸光度;A對照為用蒸餾水代替水楊酸的吸光度,按上述方法測定的吸光度;A空白為用蒸餾水代替待測樣品溶液,按上述方法測定的吸光度。
1.2.3.2 DPPH自由基清除能力的測定 分別取2 mL濃度為0.5、1、2 mg·mL-1的西南手參醇提物溶液,加入0.05 mg·mL-1 DPPH乙醇溶液2 mL,充分混勻后,室溫避光靜置30 min,于517 nm處分別測吸光度。以維生素C作為陽性對照。每個處理重復3次。DPPH自由基清除率計算公式(Villao et al.,2007):
DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100(2)
式中:A樣品為實驗組吸光度;A對照為用蒸餾水代替DPPH溶液的吸光度,按上述方法測定的吸光度;A空白為用無水乙醇代替多糖溶液,按上述方法測定的吸光度。
1.2.3.3 ABTS自由基清除能力的測定 配制7 mmol·L-1 ABTS水溶液和4.9 mmol·L-1過硫酸鉀溶液各10 mL,將其等體積混合,于室溫條件下暗處反應16 h。用磷酸鹽緩沖液稀釋至A734 nm在0.7左右。分別取0.1 mL濃度為0.5、1、2 mg·mL-1的西南手參醇提物溶液,加入3.9 mL制得的ABTS稀釋溶液,混勻,靜置6 min,運用MD/SpectraMaxM2多功能細胞分析儀分別在510 nm和734 nm處測吸光度。以維生素C作為陽性對照。每個處理重復3次。ABTS自由基清除率計公式(Tang amp; Liu,2007):
ABTS自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100(3)
式中:A1為實驗組吸光度;A0為用蒸餾水代替西南手參醇提物溶液,按上述方法測定的吸光度。
1.2.4 細胞的培養(yǎng)及增殖抑制率檢測
1.2.4.1 細胞的培養(yǎng) 人肝癌SMMC-7721細胞(Han et al.,2019)和HepG-2細胞(Yang et al.,2019)、人乳腺癌MDA-MB-231細胞(Caner et al.,2021)以及人膠質(zhì)瘤U251細胞(Wang et al.,2020)在添加10% FBS、100 U·mL-1青霉素和0.1 mg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。人胃癌BGC-823細胞(Hu et al.,2016)和MKN-45細胞(Naghashpour et al.,2023)在添加10% FBS、100 U·mL-1青霉素和0.1 mg·mL-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2和5%飽和濕度。
1.2.4.2 細胞活率檢測 將細胞按照每孔1×105個細胞的密度接種至96孔板,孵育過夜。將含終濃度為0、1、2、3、4、5 mg·mL-1的西南手參醇提物培養(yǎng)基放入96孔板中,每個濃度4次重復,置于5%的CO2培養(yǎng)箱,37 ℃培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入10 μL MTT試劑,37 ℃靜置4 h,吸去上清液,每孔加入150 μL DMSO溶液,于490 nm處測吸光度。每個處理重復4次。計算細胞存活率,計算公式(Hu et al.,2016 ; Wang et al.,2020; Naghashpour et al.,2023):
細胞存活率(%)=(A樣品-A空白)/(A陰性-A空白)×100
式中:A空白是無細胞組的吸光度;A陰性是未加藥處理組的吸光度。
1.3 數(shù)據(jù)分析
采用Microsoft Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)分析。運用Graphpad Prism 8軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(LSD)。采用Graphpad Prism 8和Microsoft PowerPoint 2016軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖。
2 結果與分析
2.1 西南手參醇提物中天麻素的含量
如圖1:A所示,在色譜條件下天麻素的色譜峰分離度良好,按1.2.2方法測得天麻素的回歸方程為Y=3×107X+21 085,r=0.999 8。進樣量在0.3~4.2 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系。如圖1:B所示,天麻素在西南手參中含量,其質(zhì)量分數(shù)為2.5 mg·g-1,西南手參醇提物中所含天麻素為0.25%。
2.2 西南手參醇提取物的體外抗氧化活性
西南手參醇提取物具有較強的體外抗氧化能力,對羥基自由基(圖2:A)、ABTS+自由基(圖2:B)和DPPH自由基(圖2:C)的清除率隨著濃度的增加呈上升趨勢,2.0 mg·mL-1的西南手參醇提取物對羥基自由基、ABTS+自由基和DPPH自由基的清除率分別為81.68%、19.94%和48.16%,表明西南手參醇提取物對羥基自由基的清除具有顯著作用。
天麻素具有很強的清除羥基自由基的能力(圖2:D),在濃度分別為1.25、2.5、5.0 μg·mL-1時對DPPH自由基和ABTS+自由基均無清除能力。
2.3 西南手參醇提取物對人肝癌細胞活率的影響
如圖3所示,西南手參醇提物對人肝癌SMMC-7721細胞和HepG-2細胞具有抑制作用,并表現(xiàn)為濃度-時間依賴效應。在同一時間處理下,兩種人肝癌細胞活率隨著西南手參醇提取物濃度升高,呈現(xiàn)出下降趨勢。在相同濃度下,隨著處理時間的延長,細胞的存活率也呈現(xiàn)出下降趨勢。西南手參醇提物濃度高于3 mg·mL-1時,與對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。
2.4 西南手參醇提取物對人胃癌細胞活率的影響
西南手參醇提物對人胃癌BGC-823細胞和MKN-45細胞具有明顯的抑制作用,并具有濃度-時間依賴效應(圖4)。在同一時間處理下,細胞活率隨著西南手參醇提取物濃度的升高,而呈現(xiàn)出下降趨勢。在同一處理濃度下,隨著處理時間的延長,細胞的存活率也呈現(xiàn)出下降趨勢。西南手參醇提物濃度高于1 mg·mL-1時,與對照組相比均有顯著性差異(P<0.000 1)。
2.5 西南手參醇提取物對乳腺癌細胞活率的影響
西南手參醇提物對人乳腺癌MDA-MB-231細胞的抑制作用,如圖5所示。在相同時間處理下,細胞活率隨著西南手參醇提取物濃度的升高,而呈現(xiàn)出下降趨勢。在相同濃度下,隨著處理時間的延長,細胞的存活率也呈現(xiàn)出下降趨勢,表明西南手參醇提物抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞生長具有時間-濃度依賴效應。當西南手參醇提物濃度高于2 mg·mL-1時與對照組相比均有顯著性差異(P<0.001)。
2.6 西南手參醇提取物對人膠質(zhì)瘤細胞活率的影響
西南手參醇提物對人膠質(zhì)瘤U251細胞具有抑制作用(圖6)。在相同時間處理下,細胞活率隨著西南手參醇提取物濃度的升高而呈現(xiàn)出下降趨勢。在相同濃度下,隨著處理時間的延長,細胞的存活率也呈現(xiàn)出下降趨勢。這說明西南手參醇提物抑制人膠質(zhì)瘤U251細胞生長具有時間-濃度依賴效應。西南手參醇提物濃度高于3 mg·mL-1時,與對照組相比均具有顯著性差異(P<0.000 1)。
2.7 西南手參醇提取物對細胞半數(shù)抑制濃度的影響
西南手參醇提物對6種細胞作用24 h時的半數(shù)抑制濃度(IC50)如圖7所示,在相同時間處理下,人肝癌SMMC-7721細胞和HepG-2細胞的IC50分別為5.170 mg·mL-1和4.551 mg·mL-1,人胃癌BGC-823細胞和MKN-45細胞的IC50分別為1.759 mg·mL-1和1.564 mg·mL-1,人乳腺癌MDA-MB-231細胞的IC50為2.665 mg·mL-1,人膠質(zhì)瘤U251細胞的IC50為4.401 mg·mL-1。結果表明,西南手參醇提物對6種細胞有不同程度的抑制作用,其中對人胃癌BGC-823細胞和MKN-45細胞的抑制效果最為顯著。
3 討論
活性氧在組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,從調(diào)節(jié)信號到促進細胞損傷和死亡,它的水平受到細胞抗氧化防御系統(tǒng)的嚴格調(diào)節(jié)(Harris amp; DeNicola,2020)。腫瘤細胞線粒體電子傳遞鏈(ETC)和NADPH氧化酶產(chǎn)生超氧化物的速度很快,超氧化物經(jīng)超氧化物歧化酶1(SOD1)或超氧化物歧化酶2(SOD2)快速轉(zhuǎn)化為H2O2,H2O2可以通過氧化還原信號促進癌細胞增殖、存活和侵襲(Martínez-Reyes amp; Chandel,2021)。已有研究表明,通過抑制活性氧的產(chǎn)生,有效抑制肝癌(Zhan et al.,2023)、胃癌(Tao et al.,2020)、乳腺癌(Das et al.,2023)和膠質(zhì)瘤(Huang et al.,2021)等癌細胞的增殖。因此,抗氧化已然作為抗腫瘤的一種手段。從植物來源的天然產(chǎn)物(如多糖、酚類、萜類化合物、醌類和生物堿類)中發(fā)現(xiàn)潛在治療癌癥的手段越來越受到關注。一些天然產(chǎn)物可以通過促進胞內(nèi)ROS增加,誘導腫瘤細胞通過ROS介導的線粒體依賴性途徑凋亡(Qian et al.,2019)。與傳統(tǒng)的藥物相比,天然產(chǎn)物具有多靶點、低副作用和低成本的突出優(yōu)勢(Yang et al.,2021)。本研究結果表明,西南手參醇提物比天麻素具有更加廣泛的抗氧化作用,對人肝癌SMMC-772細胞和HepG-2細胞、人胃癌BGC-823細胞和MKN-45細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞以及人膠質(zhì)瘤U251細胞有不同程度的抑制作用,其中對胃癌細胞的抑制效應最大。有研究發(fā)現(xiàn),靈芝提取物不僅通過調(diào)控p53蛋白表達,促進細胞凋亡達到抑制結直腸腺癌細胞Caco-2細胞的效果(Elkhateeb et al.,2018),而且還通過調(diào)節(jié)NFκB、IKKα、IKKβ、p-NFκB-65(Ser 536)和p-IKKα/β(Ser 176/180)蛋白使宮頸癌細胞HeLa細胞死亡(Kiddane et al.,2022)。這是由于天然產(chǎn)物存在復雜的成分對不同細胞均具有抑制作用,因此對西南手參進行進一步的深入研究非常有必要。總之,西南手參可作為一種抗腫瘤的潛在藥物,為多種癌癥的治療提供新的解決方案,胃癌細胞可作為今后的試驗靶標重點關注。
4 結論
西南手參醇提物及其成分天麻素具有顯著體外清除羥基自由基的能力,西南手參醇提物對肝癌、胃癌、乳腺癌和人膠質(zhì)瘤等滯留細胞的增殖具有抑制效應,尤其是對胃癌細胞增殖的抑制效果最佳。
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(責任編輯 蔣巧媛 王登惠)