摘要：

水稻葉片是水稻光合作用的重要器官，90%以上的光合產(chǎn)物都來自于此。葉片的形狀、顏色和大小等變化都會(huì)對(duì)水稻的光合作用效果以及水稻籽粒的產(chǎn)量與品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。本文探究了突變體oswnl1的農(nóng)藝性狀及其表型形成的機(jī)理。結(jié)果表明，與野生型相比，突變體oswnl1株型較矮小，冠根數(shù)量少，葉片呈現(xiàn)出白化窄化的現(xiàn)象；突變體oswnl1的葉片葉綠素含量和分蘗數(shù)、穗長、千粒重、穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)及二次枝梗數(shù)等農(nóng)藝性狀同野生型相比均有所下降；突變體oswnl1目的基因定位于7號(hào)染色體上SH-5到SH-9之間。研究結(jié)果為了解水稻葉片變白變窄的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；基因定位；白化窄化；突變體

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)識(shí)別碼：A 文獻(xiàn)編號(hào)：1005-6114（2025）01-021-05

“民以食為天，食以稻為先”，水稻是糧食之首，是人們需求的重要糧食作物。隨著各地人口的不斷增長，耕地面積的不斷減少，糧食需求變得越來越迫切，習(xí)近平總書記曾多次在報(bào)告中強(qiáng)調(diào)要“確保國家糧食安全，把中國人的飯碗牢牢端在自己手中”。為了滿足人們對(duì)糧食的需要，緩解現(xiàn)實(shí)的生存壓力，水稻產(chǎn)業(yè)在不斷地優(yōu)化與發(fā)展，水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)對(duì)糧食安全及農(nóng)業(yè)發(fā)展發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。隨著農(nóng)業(yè)科技與社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，水稻的培育技術(shù)得到了大幅度地提升［1，2］。葉片是植株的重要組成部分，是光合作用合成有機(jī)物的場所，是主要的光合生產(chǎn)“源”［3］。其顏色、形狀和大小直接決定水稻的株型，通過影響水稻的光合作用效率進(jìn)而影響產(chǎn)量和品質(zhì)。研究水稻葉片發(fā)育機(jī)理從分子水平進(jìn)行株型改良具有重大意義。

水稻葉片的顏色、形狀和大小等因素變化亦受多種情況影響，如外界環(huán)境條件脅迫（干旱、高溫、嚴(yán)寒等）、植物激素（赤霉素、生長素、脫落酸等）和基因突變等［4］。研究發(fā)現(xiàn)水稻葉片顏色和形狀的突變是自然界中比較常見的突變形式［5］。水稻葉片顏色突變通常發(fā)生在苗期，表現(xiàn)為葉片顏色從正常的綠色到多樣性的變化異常表型（如黃色、淡綠色、斑點(diǎn)、條紋、淡黃色和白化病等）；水稻葉片形狀突變表現(xiàn)為狹窄、滾動(dòng)（卷曲）、針狀、線狀或根狀等現(xiàn)象［6］。

近年來，關(guān)于水稻葉片突變性狀分子機(jī)制研究的各類項(xiàng)目在不斷推進(jìn)，已經(jīng)有不少白葉、黃葉、卷葉等基因得到克?。?］。但學(xué)者們大多數(shù)是從水稻葉片單個(gè)突變性狀來展開的， 涉及到水稻葉片兩個(gè)或兩個(gè)以上突變性狀的研究相對(duì)較少。本文在利用甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate， EMS）誘變粳稻品種WYJ27獲得一個(gè)能夠穩(wěn)定遺傳白葉窄葉突變體的基礎(chǔ)上，探究了突變體的表型特征及其形成的機(jī)理，以期為水稻葉片研究提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本項(xiàng)研究所用的試驗(yàn)材料包括粳稻品種WYJ27、突變體oswnl1、秈稻品種IR36以及由突變體oswnl1與秈稻品種IR36進(jìn)行雜交構(gòu)建的F2定位群體。突變體oswnl1是由EMS誘變劑處理粳稻品種WYJ27后穩(wěn)定遺傳所獲得的。

1.2 田間種植

試驗(yàn)材料分別在江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū)揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院校外酒甸試驗(yàn)田和海南省三亞水稻基地種植與培育。實(shí)驗(yàn)材料株系在田間各種植3行，每行種植6株，種植密度為18 cm×18 cm。種植與培育期間的田間管理措施均實(shí)施正常的管理方法。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水稻種子EMS誘變

本研究選用粳稻品種WYJ27進(jìn)行EMS誘變處理。WYJ27具有穩(wěn)定的遺傳背景和較高的誘變敏感性，適合作為突變體研究的實(shí)驗(yàn)材料。把當(dāng)季收獲的干燥的粳稻品種WYJ27種子取適量裝入各個(gè)紙袋中，并封口做好相應(yīng)的標(biāo)記。將各紙袋浸沒在盛水容器中8 h后，取出并晾干其水分，再使晾干的各紙袋浸沒在含有1.5%EMS誘變劑的容器中8 h，等8 h浸沒完成后再把各紙袋用清水沖洗一次。最后將浸種催芽后的種子播入田間，等到成熟時(shí)把它們收獲并種出下一代，再從中挑選出能夠穩(wěn)定遺傳表型的植株。

1.3.2 F2定位群體構(gòu)建

2021年，以秈稻品種IR36為父本、白葉窄葉突變體oswnl1為母本配制F1代雜交組合，同年在江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū)揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院校外酒甸試驗(yàn)田種植F1代材料?？疾霧1代的表型，收獲F2代白葉窄葉的單株，記錄其中正常綠葉寬葉與突變白葉窄葉的單株比例，從而獲得可以用作基因定位的樣本材料。

1.3.3 野生型和突變體農(nóng)藝性狀考察

在分蘗期，對(duì)野生型WYJ27和突變體oswnl1的分蘗數(shù)進(jìn)行記錄。在齊穗期，對(duì)野生型WYJ27和突變體oswnl1的株高進(jìn)行測量。在成熟期，對(duì)野生型WYJ27和突變體oswnl1的粒長、粒寬、千粒重、穗長、穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)及二次枝梗數(shù)進(jìn)行考察［8］，各時(shí)期的每項(xiàng)農(nóng)藝性狀都需至少重復(fù)測量5次，具體的測量方法均根據(jù)水稻標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系進(jìn)行測量記錄（http：//www.knowledgebank.irri.org/ses/）。

1.3.4 不同溫度處理下野生型和突變體葉綠素含量測定

將三組野生型WYJ27單株與突變體oswnl1單株分別放在35℃、30℃和24℃三種溫度處理環(huán)境中培育。 選擇天氣晴朗的上午，分別取各溫度處理下二者開花期時(shí)的劍葉、倒二葉和倒三葉，將新鮮葉片擦干擦凈后去除葉脈。用分析天平稱取0.05 g葉片中部，并用剪刀將其剪碎，操作需重復(fù)3次。選取25 mL的離心管，將剪好的葉片放入其中，再用丙酮和乙醇的混合溶液定容至25 mL。在室溫下，將離心管靜置在黑暗中24 h，使得葉片和溶液充分接觸，靜置期間需要多次搖晃離心管。最后將葉綠體色素提取液倒入光徑1 cm的比色杯內(nèi)，以丙酮和乙醇的混合溶液為空白對(duì)照組，使用分光光度計(jì)測定各吸光度值（在波長663 nm、645 nm和470 nm下）。

葉綠素濃度計(jì)算方法：

Ca=12.21A663-2.81A645

Cb=20.13A645-5.03A663

Cc=（1000A470-3.27Ca-104Cb）/229

其中，Ca、Cb和Cc分別是葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的濃度。A663、A645、A470分別是波長663 nm、645 nm和470 nm下的吸光度值［9］。

1.3.5 DNA提取

水稻葉片DNA的提取是在Murray等（1980）發(fā)明的CTAB提取法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化改良而成的，詳細(xì)的操作步驟如下：

①取適量葉片放到液氮預(yù)冷后的研缽中磨成粉，轉(zhuǎn)移到2.0 mL離心管中［10］。

②向離心管中加750 mL DNA提取緩沖液并充分震蕩混勻。將其放在65℃水浴鍋中水浴40 min，過程中每15 min震蕩一次。

③水浴后加500 mL氯仿，劇烈震蕩混勻，靜置10 min后，10 000 rpm離心8 min［11］。

④吸取500 mL上清液至1.5 mL離心管中，加500 mL異丙醇，輕輕顛倒混勻后，置于-20℃，冰浴1 h。

⑤冰浴后，靜置5 min，10 000 rpm離心8 min。

⑥棄上清液，加70%酒精洗滌沉淀。

⑦將離心管倒置晾干后，加200 mL ddH2O，使其充分溶解后放入-20℃保存待用。

1.3.6 突變體oswnl1基因初定位

從突變體oswnl1與秈稻品種IR36構(gòu)建的F2分離群體中，選取25株左右?guī)в型蛔儽硇偷膯沃?，采用混池法提取DNA，用于基因的初定位。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室保存的覆蓋水稻整個(gè)基因組的156對(duì)SSR引物，對(duì)突變體oswnl1和秈稻品種IR36進(jìn)行多態(tài)性分析。選取親本間具有多態(tài)性的標(biāo)記對(duì)混池進(jìn)行連鎖分析。將可能連鎖的引物進(jìn)一步對(duì)25個(gè)F2突變單株進(jìn)行連鎖分析，最終確定連鎖區(qū)間。

PCR反應(yīng)總體系為25 μL，包括2.5 μL的10×PCR buffer，1.3 μL的25 mmol/L MgCl2，1.0 μL的2.5 mmol/L dNTPs，16.0 μL的dd H2O，2.0 μL的10 μmol/L引物，2.0 μL的模板DNA，0.2 μL的5 U/μL Taq酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)镾tep1：94℃ 2 min，Step2：94℃ 15 s，Step3：55℃ 15 s，Step4：72℃ 30 s，Step5：72℃ 5 min，Step6：10℃保持。其中，Step2至Step4需循環(huán)35次。

1.3.7 凝膠電泳

采用4%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。等到凝膠成像后，觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體表型鑒定

在水稻不同的生育期中，對(duì)突變體oswnl1與野生型WYJ27進(jìn)行各階段的拍照記錄觀察。從照片中的表型特征來看，突變體oswnl1的葉片顏色和葉片形狀發(fā)生了雙重的變化（圖1）。

同野生型WYJ27相比，突變體oswnl1整個(gè)生育期表現(xiàn)出植株矮化，葉片較窄且表面不規(guī)則白化（圖1）。在苗期時(shí)，突變體oswnl1株高平均為15.2 cm，比野生型WYJ27的20.5 cm矮25.8%；根生長異常（即冠根數(shù)量和總根長度顯著減少），冠根數(shù)量平均為4.1條，比野生型的6.8條少39.7%；總根長度平均為23.4 cm，比野生型的35.6 cm短34.3%；葉片形狀比野生型更窄，葉片顏色比野生型較白較淡（圖1-A）。在成熟期時(shí)，突變體oswnl1株高平均為61.7 cm，比野生型WYJ27的78.1 cm矮21.0%；葉片形狀變得更窄，且分蘗數(shù)、穗數(shù)相比也明顯較少，分蘗數(shù)平均為7.0個(gè)，比野生型的9.5個(gè)少26.3%；穗數(shù)平均為12.3個(gè)，比野生型的16.8個(gè)少26.8%（圖1-B）。突變體oswnl1節(jié)間長度平均為12.5 cm，比野生型WYJ27的15.8 cm短20.9%；穗型長度平均為14.3 cm，比野生型的16.9 cm短15.4%；每穗籽粒數(shù)平均為98.6粒，比野生型的180.0粒少45.2%（圖1-C、圖1-D）。

2.2 突變體農(nóng)藝性狀分析

突變體oswnl1的分蘗數(shù)比野生型WYJ27的分蘗數(shù)相對(duì)少一些，是野生型分蘗數(shù)的73%；在齊穗期時(shí)，突變體oswnl1的株高也比野生型WYJ27的較矮，是野生型株高的79%；在成熟期時(shí)，與野生型WYJ27相比，突變體oswnl1在籽粒粒長和粒寬方面沒有明顯的差異， 但突變體oswnl1的穗長、千粒重、穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)及二次枝梗數(shù)均顯著減少分別減少15%、14%、45%、34%和41%（表1）。

2.3 不同溫度處理下野生型和突變體葉綠素含量分析

在35℃處理下，突變體oswnl1的葉綠素a含量為5.97±0.31 mg/L，顯著低于野生型的10.49±0.25 mg/L（Plt;0.01）。在30℃和24℃環(huán)境下，突變體oswnl1的葉綠素a含量分別下降了43.7%和66.5%（Plt;0.01）。葉綠素b和類胡蘿卜素的變化趨勢與葉綠素a一致，且在低溫條件下下降幅度最大（圖2）。

2.4 不同溫度處理下野生型與突變體表型變化

在35℃、30℃和24℃等溫度處理中，突變體oswnl1的單株株型均比野生型WYJ27的株型要矮小、單株葉片形狀更窄、單株葉片顏色更白；溫度越低突變體oswnl1的單株株型矮化越明顯、葉片白化與窄化現(xiàn)象越突出（圖3）。

2.5 突變體oswnl1基因初定位結(jié)果

從突變體oswnl1與秈稻品種IR36構(gòu)建的F2分離群體中，使用混池法進(jìn)行水稻葉片DNA的提取，然后通過圖位克隆法，最終將突變體oswnl1的目的基因初步定位在7號(hào)染色體上SH-5和SH-9之間（圖4）。

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

（1）自然栽培條件下，水稻白葉窄葉突變體oswnl1的全生育期均表現(xiàn)出株型矮化［12］，根系較少，葉片變窄，葉片表面出現(xiàn)不規(guī)則的白化現(xiàn)象。突變體oswnl1的各節(jié)間長度也短于野生型WYJ27，在成熟期時(shí)收獲的水稻穗型偏小且籽粒偏少。白葉窄葉的基因突變對(duì)水稻植株在田間的正常生長與發(fā)育產(chǎn)生了影響。

（2）突變體oswnl1與野生型WYJ27二者在籽粒粒長和粒寬方面近乎沒有差異，在株高、分蘗數(shù)、穗長和千粒重方面差異較小，但在穗粒數(shù)與二次枝梗數(shù)方面差異極顯著。與野生型WYJ27相比，突變體oswnl1的穗粒數(shù)減少了45%，二次枝梗數(shù)減少了41%。表明突變體oswnl1在葉片發(fā)生白化窄化變化后，影響了水稻的主要農(nóng)藝性狀，阻礙了水稻植株的正常發(fā)育，影響了水稻籽粒的產(chǎn)量與質(zhì)量。

（3）oswnl1是一個(gè)低溫敏感型的水稻白葉窄葉突變體。當(dāng)處于同一溫度處理下時(shí)，與野生型WYJ27相比，突變體oswnl1相應(yīng)的葉綠素含量均在下降。當(dāng)處理溫度越低時(shí)，突變體oswnl1的葉綠素含量下降幅度越大。溫度越低時(shí)，水稻突變體oswnl1的葉片越窄，白化現(xiàn)象越嚴(yán)重。推測這可能是由于水稻葉色和葉寬的變化，使得葉片窄化，葉綠素合成受阻，影響了葉片的光合效率，進(jìn)而導(dǎo)致各葉綠素含量降低，水稻葉片出現(xiàn)不規(guī)則的白化現(xiàn)象。

（4）粳稻品種WYJ27經(jīng)過EMS誘變劑處理后，得到了穩(wěn)定遺傳突變體oswnl1，該突變體的葉片表現(xiàn)出了窄葉和表面白化兩種性狀，突變體oswnl1的目的基因初步定位在7號(hào)染色體上SH-5和SH-9之間［13］。

3.2 討論

突變體的獲得主要通過兩種途徑：自然突變和人工誘變。由于自然突變發(fā)生的概率非常小，花費(fèi)的時(shí)間長，難度大，因而常常是通過人工誘變的方式獲得的。目前，大多葉片研究的材料都來源于甲磺酸乙酯（EMS）誘變。本文正是使用了EMS誘變劑處理粳稻品種WYJ27，獲得了一個(gè)穩(wěn)定遺傳的突變體oswnl1，該突變體的葉片表現(xiàn)出了窄葉和表面白化兩種性狀。突變體oswnl1白葉窄葉表型的發(fā)現(xiàn)豐富了水稻葉片突變基因研究，為水稻種質(zhì)資源培育與改良打下了基礎(chǔ)。

突變體oswnl1除葉片變窄外，另一典型特征是葉片表面呈現(xiàn)不規(guī)則的白化現(xiàn)象。目前，已經(jīng)報(bào)道的窄葉突變體多是因?yàn)槿~脈數(shù)量的顯著變化而表現(xiàn)出了窄葉特征，例如nal7-2（t）是葉片中大維管束和小維管束的數(shù)量降低導(dǎo)致葉片變窄；nal12葉片變窄也是由于大脈和小脈數(shù)量減少造成的［14］。本研究在成功定位突變體oswnl1的基因后，后期也會(huì)進(jìn)一步去分析oswnl1葉片表現(xiàn)出窄葉性狀的具體原因。而關(guān)于水稻葉片白化特征的原因，在前人的研究發(fā)現(xiàn)中，葉片白化通常與葉綠素含量的下降有關(guān)，例如水稻白化突變體tsa1，它的白化葉片中葉綠素a和類胡蘿卜素含量與野生型相比顯著下降［15］；水稻白化突變體Osalb24葉片中葉綠素a和類胡蘿卜素的含量為痕量，幾乎測不出，葉綠素b的含量為0［16］。同時(shí)在本文突變體oswnl1中，其葉片葉綠體中的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量都低于野生型WYJ27。葉綠體是植物光合作用的關(guān)鍵細(xì)胞器，在高等植物中，葉綠體的分化與葉片的發(fā)育緊密耦合?？梢酝茰y，由于葉色的突變，oswnl1的葉綠體分化受阻，葉綠體中各葉綠素的含量下降，從而導(dǎo)致了水稻葉片的發(fā)育不良，表現(xiàn)出了不規(guī)則的白化現(xiàn)象，但具體影響機(jī)制還需更深入的研究與探索。

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