摘要：為了解黃連提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌機理，通過生長曲線、氧化損傷試驗、細(xì)胞壁膜分析、蛋白質(zhì)分析和DNA分析，探討黃連提取物對金黃色葡萄球菌的作用機制。結(jié)果表明，黃連提取物對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制效果，最小抑菌濃度為2.60 mg·mL?1。黃連提取物可引起金黃色葡萄球菌胞內(nèi)活性氧水平增加506.90%，胞外β-半乳糖苷酶活性和核酸含量分別增加258.28%和23.82%，碘化丙啶熒光染色也明顯多于對照；總蛋白合成量、細(xì)胞代謝活力以及琥珀脫氫酶活性分別降低30.83%、30.89%、54.05%?；蚪MDNA的紫外吸收光譜和競爭性熒光光譜顯示，黃連提取物可以與金黃色葡萄球菌DNA進(jìn)行小溝結(jié)合或靜電結(jié)合。以上結(jié)果表明，黃連提取物主要通過增加胞內(nèi)活性氧水平，破壞細(xì)胞壁膜完整性及通透性來達(dá)到抑菌效果。研究結(jié)果為黃連的綜合開發(fā)利用及其在飼料添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用提供借鑒。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；黃連提取物；抑菌機理

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0132

中圖分類號：S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2025）03014310

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的人畜共患細(xì)菌，危害全球人類和牲畜的健康[1]。雖然人類似乎是金黃色葡萄球菌的主要儲存庫，但畜牧業(yè)的持續(xù)擴(kuò)張和全球化以及抗生素的普遍使用增加了病理適應(yīng)性金黃色葡萄球菌在這一環(huán)境中的傳播[2]。金黃色葡萄球菌的病理適應(yīng)性克隆菌系已經(jīng)出現(xiàn)，并給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？刮⑸锼幬锏哪退幮砸殉蔀槿蚪】得媾R的最大威脅之一。在尋找抗生素替代品或增強劑的過程中，植物來源的天然化合物引起了人們的興趣，一些植物提取物和天然化合物可以誘導(dǎo)細(xì)菌對抗生素的耐藥性，有望成為替代選擇品[3]。此外，天然植物提取物具有多種功能活性成分，不同提取物之間或與其他類型的替抗物質(zhì)往往能產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)一步發(fā)揮抗菌功效。因此，天然植物提取物作為新型飼料添加劑的開發(fā)已經(jīng)成為研究熱點。

黃連（Coptis chinensis）是一種傳統(tǒng)中藥，具有抗炎[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]等多種藥理活性。黃連提取物（rhizoma coptidis extract，RCE）中含有多種生物活性成分[8]，如生物堿、黃酮類、木脂素類等，其中主要的抑菌成分為生物堿類，小檗堿是黃連中含量最高和抑菌性最強的一種活性成分[9]，已被證明對許多微生物有效，包括葡萄球菌屬。Lin等[10]發(fā)現(xiàn)，黃連的干燥根莖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有100%的體外抑制作用。黃連解毒湯對革蘭氏陽性菌的抑菌效果較好，抑菌效果由高到低依次為溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、糞腸球菌[11]。黃連及其活性成分的抗菌機制作用于多個靶點，對不同微生物的抑菌機制不完全相同。研究發(fā)現(xiàn)，黃連總生物堿和小檗堿對嗜水氣單胞菌的抑菌作用可能與細(xì)胞膜損傷有關(guān)，通過改變膜脂流動性和膜蛋白構(gòu)象使菌體膜通透性增加從而抑制細(xì)菌生長；同時降低了細(xì)菌毒力因子的分泌，使菌體的致病性降低[12]?？褂拈T螺桿菌機制可能與其中的黃連堿可抑制脲酶活性有關(guān)，黃連堿通過抑制原型脲酶輔助蛋白UreG的活性和UreG二聚體的形成以及通過促進(jìn)鎳從UreG二聚體中解離來干擾脲酶成熟[5]。但目前黃連對金黃色葡萄球菌的抑菌機理還不十分清楚，限制了它的進(jìn)一步應(yīng)用，本研究探討RCE對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性和抑菌機制，以期為RCE作為新型飼料添加劑的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金黃色葡萄球菌，本實驗室保存；黃連，北京同仁堂；總ATPase試劑盒、SDH試劑盒，中國南京建成生物工程研究所；營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂，青島海博生物有限公司；二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)胞培養(yǎng)96孔板，康寧Corning。

高壓滅菌鍋，YXQ-LS-50S11，上海博訊實業(yè)有限公司；搖床震蕩培養(yǎng)箱，KYC-100C，上海?，敼?；生化培養(yǎng)箱，SHP-150，上海森信實驗儀器公司；酶標(biāo)儀，4K1d，美國賽默飛世爾科技公司；超速冷凍離心機，4K1S Sigma；水浴鍋，HHS，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療；超聲波細(xì)胞破碎機，F(xiàn)K-150N，山東方科儀器有限公司；超微量分光光度計，NanoDrop One，美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RCE的提取 將黃連干燥后粉碎，過30目篩，用去離子水浸泡30 min后沸水浴提取60 min，其中料液比為1∶10，過濾、濃縮為原體積的30%后存放在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌的活化和培養(yǎng) 將?80 ℃凍存的金黃色葡萄球菌接種于適量的肉湯中，并置于37 ℃、120 r·min?1搖床中培養(yǎng)12 h。將活化后的菌液劃線在TSA平板，于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行分離培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接種于適量營養(yǎng)肉湯進(jìn)行過夜培養(yǎng)，至對數(shù)生長期后存于冰箱4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RCE 對金黃色葡萄球菌抑菌活性的測定 采用液體倍半稀釋法測定提取液對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。將處于對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌（細(xì)菌含量為1×106 CFU·mL?1）接種到營養(yǎng)肉湯中，將RCE添加到營養(yǎng)肉湯中，最終含量為原液的50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.56%，以不含RCE的營養(yǎng)肉湯為對照。

1.2.4 REC 對金黃色葡萄球菌生長的影響 細(xì)菌生長曲線試驗參照Araya-contreras 等[13]方法。將金黃色葡萄球菌菌懸液（1×108 CFU·mL?1）按照體積分?jǐn)?shù)1%的比例接種于營養(yǎng)肉湯中，再加入適量RCE，使其最終含量為1 MIC，同時設(shè)置1 mL生理鹽水作為對照，之后放入37 ℃、120 r·min?1的搖床培養(yǎng)，每隔2 h 取出樣品用酶標(biāo)儀測定625 nm的吸光度值，根據(jù)吸光度值繪制該菌的生長曲線。

1.2.5 金黃色葡萄球菌胞內(nèi)活性氧水平測定 細(xì)菌胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）檢測參照 Goel 等[14]的方法。菌種活化及含量步驟同1.2.2。取10 mL無菌EP管加入2，7-二氯熒光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorofluorescin diacetate， DCFHDA，終含量為2×10?5 mol·L?1）與10 mL菌懸液（終含量為1×108 CFU·mL?1），在37 ℃水浴鍋中孵育1 h。然后，在冷凍離心機中8 000 r·min?1 離心5 min收集菌體，去除細(xì)胞外多余的DCFH-DA后，加入適量抑菌劑（抑菌劑終含量為1 MIC，菌終含量為1×106 CFU·mL?1），在37 ℃水浴鍋中孵育12 h，以生理鹽水為對照，用酶標(biāo)儀測定熒光強度。

1.2.6 金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整性和通透性試驗 ①熒光染料碘化丙啶（propidium iodide，PI）標(biāo)記試驗。菌種活化及定含量步驟同1.2.2。將對數(shù)生長期的細(xì)菌重懸至OD625 nm 0.3后添加菌懸液1%體積的抑菌劑（終含量為1 MIC），置于（37±1） ℃、200 r·min?1搖床中6 h后，加入PI染液（終含量為1.5 mmol·L?1）常溫避光染色30 min，同時設(shè)置無菌水代替抑菌劑做對照。分別取10 μL菌液制片，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)菌染色情況。

②細(xì)菌胞外β-半乳糖苷酶含量測定。參照1.2.2中方法制備菌懸液及抑菌劑反應(yīng)體系，菌懸液終濃度OD625 nm 0.3，加入1%體積抑菌劑（終含量為2 MIC），用1%生理鹽水作對照。將反應(yīng)體系混合均勻后置于37 ℃水浴鍋3 h后4 ℃、12 000 r·min?1離心10 min。然后，取1 mL上清液與0.1 mL的ONPG（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside solution，終含量為0.075 mol·L?1）溶液混合均勻，置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)3 h后測定420 nm處的吸光度值。

③細(xì)菌胞外核酸泄露量測定。參照Xiang等[15]方法并略加改進(jìn)。菌懸液終含量OD625 nm 0.5，抑菌劑終水平1 MIC，用1%生理鹽水做對照，之后在37 ℃、120 r·min?1搖床中振蕩培養(yǎng)，每2 h取1 mL菌懸液，4 ℃、10 000 r·min?1離心5 min后用超微量分光光度計測定上清液核酸含量。

1.2.7 金黃色葡萄球菌總蛋白合成量的測定 參照Liu等[16]試驗方法并稍加改進(jìn)。取適量活化好的菌懸液5 000 r·min?1離心4 min后溶于1 mL生理鹽水，并接種于100 mL無菌營養(yǎng)肉湯中，然后加入終含量為1 MIC的各種抑菌劑（體積不超過總體積1%），1%生理鹽水做對照。將各反應(yīng)體系在37 ℃、120 r·min?1搖床中振蕩培養(yǎng)12 h后，5 000 r·min?1離心4 min后重懸至OD625 nm 0.3。用超聲波細(xì)胞破碎機破碎后采用考馬斯亮藍(lán)法[17]測定破碎液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.8 金黃色葡萄球菌細(xì)胞代謝活力測定 菌種活化及重懸參照1.2.2，得到OD625 nm 0.5菌懸液，加入1% 體積的RCE 使其終含量為1 MIC，置于37 ℃、150 r·min?1 搖床中振蕩培養(yǎng)2 h，然后用8 000 r·min?1的冷凍離心機離心5 min，收集菌體再次重懸至OD625 nm 0.5，設(shè)置質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%生理鹽水為對照。取適量菌懸液加入氯化碘硝基四唑紫溶液（終含量為1 mmol·L?1），然后置于37 ℃水浴鍋孵育30 min，用酶標(biāo)儀在630 nm處測量吸光度值。

1.2.9 金黃色葡萄球菌能量代謝酶活力測定 菌體菌懸液制備同1.2.2，得到OD625 nm 0.3的菌懸液，將菌懸液分裝在滅菌EP管并加入適量RCE（終含量為1 MIC），以1% 的生理鹽水為對照，并設(shè)置10 mg·mL?1的溶菌酶為陽性對照，將各反應(yīng)體系置于37 ℃、120 r·min?1搖床中振蕩培養(yǎng)6 h。然后利用總ATPase 試劑盒、琥珀酸脫氫酶（succinatedehydrogenase，SDH）試劑盒進(jìn)行酶活性測定。

1.2.10 金黃色葡萄球菌DNA結(jié)合測定 ①細(xì)菌DNA 的提取。菌種活化及重懸參照1.2.2，得到1×108 CFU·mL?1 的菌懸液后，采用CTAB 法提取DNA。最后，用適量TE 緩沖液溶解DNA，檢測OD260 nm和OD280 nm，確定DNA含量和純度，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②RCE 與DNA 作用的紫外吸收光譜試驗。參照Wu 等[18]方法并稍加改動。取100 μL含量為1 MIC的RCE，然后加入100 μL的0.5 mg·mL?1的金黃色葡萄球菌基因組DNA，于37 ℃水浴鍋溫育3 h，用酶標(biāo)儀進(jìn)行紫外掃描，紫外光掃描范圍230～450 nm。

③溴化乙錠（ethidium bromide，EB）競爭性熒光光譜試驗。參照Hegde 等[19] 方法，將含0.2 μg·mL?1 EB 的DNA 溶液（1 mg·mL?1）中加入等體積不同含量的RCE（終含量分別為1/2 MIC、1 MIC），均勻混合各反應(yīng)體系后置于37 ℃水浴鍋溫育3 h，用酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光掃描。RCE的激發(fā)波長為440 nm，掃描波長為480～700 nm。

④4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）競爭性熒光光譜試驗。參照Lyu 等[20]方法并稍加改進(jìn)，在含0.2 μg·mL?1 DAPI的DNA溶液（1 mg·mL?1）中加入等體積不同含量的RCE（終含量分別為1/2 MIC、1 MIC），均勻混合各反應(yīng)體系后置于37 ℃水浴鍋溫育3 h，用酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光掃描。RCE的激發(fā)波長為300 nm；掃描波長為380～700 nm。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad Prism 9軟件對試驗所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，2 組間采用獨立樣本t 檢驗；多組間比較采用單因素分析中事后多重比較（Duncan）。

2 結(jié)果與分析

2.1 RCE 對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度及對菌體生長的影響

經(jīng)水提得到的RCE原液含量為333 mg·mL?1，通過倍半稀釋法測定的MIC結(jié)果顯示，RCE對金黃色葡萄球菌在體外的MIC為2.60 mg·mL?1，表明在較低含量下RCE可以抑制金黃色葡萄球菌的生長，具有較好的抑菌效果。

金黃色葡萄球菌在RCE 溶液中的生長曲線如圖1所示，金黃色葡萄球菌的生長期可分為遲滯期（0～6 h）、對數(shù)生長期（6～16 h）和穩(wěn)定期（16～24 h），RCE 處理后金黃色葡萄球菌的生長被抑制，1 MIC的RCE在生長遲滯期時幾乎完全抑制了金黃色葡萄球菌的生長。

2.2 RCE 對金黃色葡萄球菌胞內(nèi)活性氧的影響

ROS 是超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基的總稱，當(dāng)ROS 大量釋放至超過機體可抵御含量時，細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷。熒光探針2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）穿過細(xì)胞膜后，在細(xì)胞內(nèi)酯酶作用下水解為二氯熒光素（dichlorodihydrofluorescein， DCFH），細(xì)胞內(nèi)積累的ROS氧化無熒光狀態(tài)DCFH為綠色熒光，因此通過檢測綠色熒光強度可反映細(xì)胞內(nèi)ROS生成量[21]，不正常的ROS水平使細(xì)胞氧化應(yīng)力發(fā)生變化導(dǎo)致系列機能障礙[22]。由圖2可知，與對照相比，RCE 處理細(xì)胞DCFH 熒光強度增加，達(dá)到13 279 AU，較對照增加506.90%，有顯著性差異（Plt;0.000 1）。以上結(jié)果表明，RCE 可以明顯刺激胞內(nèi)ROS 的過度產(chǎn)生，因此推測RCE 促使金黃色葡萄球菌胞內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，進(jìn)而可能影響細(xì)菌膜、蛋白質(zhì)和DNA 產(chǎn)生不可逆損傷致使細(xì)菌死亡。

2.3 RCE 對金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁膜完整性和通透性的影響

2.3.1 熒光染料PI 標(biāo)記結(jié)果 碘化丙啶（PI）不能穿過完整的活細(xì)胞膜，即正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞在不固定的情況下對PI拒染，當(dāng)膜的完整性被破壞時，PI 可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA 結(jié)合。根據(jù)此特點，使用PI 染色可鑒別細(xì)胞膜的完整性[23]。本研究中，RCE 作用于金黃色葡萄球菌后的PI 染色結(jié)果如圖3 所示，對照組的細(xì)菌沒有被PI 染色，1 MIC 的RCE 明顯使細(xì)菌DNA 被染色，發(fā)出較強的紅色熒光。以上結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性受到破壞，PI 染色后可以穿過細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。細(xì)胞膜完整性被破壞，一方面會使細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)發(fā)生泄漏，影響細(xì)胞的正常代謝；另一方面使得細(xì)胞外的抑菌物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步作用于細(xì)胞內(nèi)的其他成分。

2.3.2 胞外β-半乳糖苷酶含量變化分析 RCE對金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁膜通透性的影響可以通過膜內(nèi)物質(zhì)的釋放來確定。β-半乳糖苷酶是細(xì)胞膜內(nèi)部的一種酶，當(dāng)細(xì)胞膜受損不能將內(nèi)外部環(huán)境良好隔離時，胞內(nèi)酶便會泄漏到細(xì)胞外部，因此通過測定胞外β-半乳糖苷酶含量來檢測抑菌劑是否改變壁膜通透性。從圖4可以看出，RCE作用后菌懸液中β-半乳糖苷酶比對照顯著增加258.28%（Plt;0.01）。以上結(jié)果表明，RCE對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜造成了很大的損傷導(dǎo)致其通透性增大，引起細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶泄露。

2.3.3 胞外核酸泄漏量結(jié)果 核酸是細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞膜受損不能將內(nèi)外部環(huán)境良好隔離時，核酸便會泄漏到細(xì)胞外部。因此，通過檢測其細(xì)胞外部的泄漏量推斷抑菌劑對壁膜的破壞作用[24]。由圖5可知，陰性對照組的菌懸液中核酸含量隨時間延長呈緩慢增加后相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài)；RCE處理組的菌懸液胞外核酸含量在0～10 h內(nèi)逐漸增長，且在10 h時泄漏量最大，為22.0 ng·μL?1，較對照增加23.82%，差異顯著（Plt;0.01）。上述結(jié)果表明，RCE可以破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的完整性，致使其通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)核酸泄露。

2.4 RCE 對金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)合成和代謝能力的影響

2.4.1 對總蛋白合成的影響分析 蛋白質(zhì)是抑菌劑的又一重要作用靶點，其含量、組成、活力等發(fā)生變化均可能影響細(xì)菌的生長代謝甚至死亡[25]。RCE 作用于金黃色葡萄球菌后的總蛋白合成量變化如圖6 所示，對照組總蛋白合成量為2.53 mg·mL?1，RCE 處理組總蛋白合成量為1.75 mg·mL?1，較對照顯著降低30.83%（Plt;0.001）。RCE 處理的金黃色葡萄球菌細(xì)胞中總蛋白減少的原因可能是影響了菌體某些結(jié)構(gòu)或功能蛋白的合成，但具體的蛋白質(zhì)種類需進(jìn)一步研究。此外，蛋白質(zhì)的合成需要生命體提供大量的能量，在細(xì)胞和生物體內(nèi)各種生物化學(xué)反應(yīng)中起催化作用的酶主要也是蛋白質(zhì)，RCE是否可以干擾金黃色葡萄球菌能量代謝中相關(guān)酶的活性從而造成其胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻，還需進(jìn)一步探究。

2.4.2 對細(xì)胞代謝活力及2 種代謝酶活力的影響 微生物細(xì)胞壁膜被破壞后，依賴于膜完整性的代謝系統(tǒng)可能會受到影響。ATP酶在線粒體膜內(nèi)外離子平衡和能量代謝的調(diào)節(jié)中起重要作用。SDH 是細(xì)胞膜中唯一參與氧化磷酸化的多亞基酶[26]，是TCA 循環(huán)中電子傳遞的樞紐之一，其在ATP生物合成中起重要作用[27]。由圖7A可知，對照組細(xì)胞相對代謝活力為1.91，RCE處理后細(xì)胞相對代謝活力為1.32，菌體新陳代謝活力顯著下降30.89%（Plt;0.05）?？侫TPase和SDH 這2種能量代謝中的關(guān)鍵酶活性也發(fā)生了改變，陽性對照（溶菌酶處理）與對照組總ATPase 活力分別為0.04、0.81 U·mL?1，RCE 處理后總ATPase 活力為0.81 U·mL?1。經(jīng)RCE處理后總ATPase活力下降0.37%，但差異不顯著（圖7B）；SDH活力方面，陽性對照與對照組SDH 活力分別為4、37 U·mL?1，RCE 處理后SDH 活力為17 U·mL?1，顯著下降54.05%（Plt;0.05，圖7C）。因此，RCE 金黃色葡萄球菌細(xì)胞的總體代謝活力和SDH能量代謝酶有較強的影響，對總ATPase酶活性影響較小。SDH活力的顯著下降結(jié)果與上文胞內(nèi)總蛋白含量下降結(jié)果相互驗證。

2.5 RCE 與金黃色葡萄球菌基因組DNA 的作用方式

2.5.1 與金黃色葡萄球菌基因組DNA結(jié)合紫外光譜分析 DNA可以調(diào)節(jié)大分子合成和代謝過程，它們在生長、發(fā)育和繁殖等主要生理現(xiàn)象中起主導(dǎo)作用。抑菌劑破壞壁膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后可能會與其進(jìn)一步作用，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)、功能的變化進(jìn)而影響功能，例如誘變細(xì)胞死亡、基因轉(zhuǎn)達(dá)和轉(zhuǎn)化等導(dǎo)致細(xì)菌的損傷及死亡等，因此與DNA的結(jié)合作用也是抑菌劑作用靶點之一[28]。小分子化合物與DNA 之間的非共價相互作用可分為2 種主要模式，一種是π-π疊加和偶極?偶極相互作用導(dǎo)致的分子嵌插結(jié)合模式，一般表現(xiàn)為平面分子插入DNA堿基對之間；另一種是溝槽結(jié)合模式，具有穩(wěn)定的分子間相互作用，包括靜電、疏水和氫鍵相互作用[29]。

紫外吸收光譜是區(qū)分2種相互作用模式的最有效方法之一。當(dāng)紫外吸收光譜顯示增色效應(yīng)，或者很小的紅移與不明顯減色效應(yīng)，表明小分子物質(zhì)與DNA發(fā)生以非共價鍵結(jié)合為主要特征的靜電結(jié)合和溝槽結(jié)合；當(dāng)光譜發(fā)生明顯減色效應(yīng)與紅移，表明抑菌劑與DNA發(fā)生了嵌插結(jié)合。紫外掃描得到了金黃色葡萄球菌基因組DNA與抑菌劑作用下的吸收光譜圖（圖8），添加0.5 mg·mL?1細(xì)菌基因組DNA后RCE的紫外吸收強度產(chǎn)生較不明顯的減色效應(yīng)，至原來的95.53%，紅移不明顯，可能與DNA間存在多種結(jié)合方式或者沒有結(jié)合作用。

2.5.2 與金黃色葡萄球菌基因組DNA競爭性熒光光譜分析 為進(jìn)一步研究RCE與金黃色葡萄球菌DNA的結(jié)合模式，用DAPI和EB熒光探針進(jìn)行了爭性結(jié)合試驗。DAPI是一種典型的與DNA雙螺旋的小溝處相互作用的熒光劑，若小分子物質(zhì)競爭DAPI 在DNA 小溝處作用的結(jié)合位點，那么DAPI-DNA復(fù)合物的熒光強度將會發(fā)生明顯降低。由圖9A 可知，用0.5 mg·mL?1 的金黃色葡萄球菌DNA處理導(dǎo)致最初的DAPI-DNA復(fù)合物熒光強度降低，在440 nm處有明顯吸收峰，且隨著RCE含量增加熒光強度分別降低為93.17%、78.41%，說明RCE對DAPI-DNA體系熒光有猝滅作用，推測RCE與金黃色葡萄球菌基因組DNA發(fā)生小溝結(jié)合。

EB是一種典型的嵌入性DNA熒光探針，其自身熒光性較弱，而嵌入DNA后形成EB-DNA體系后的熒光強度變強。但與DNA結(jié)合的EB可以被某些可嵌入DNA結(jié)構(gòu)的藥物小分子置換出來，導(dǎo)致EB-DNA體系熒光強度降低。圖9B顯示，EB-DNA復(fù)合物特征性熒光吸收峰在440 nm處，最強熒光強度為3 866 AU；添加RCE后在570 nm處有明顯吸收峰，且隨RCE 含量增加熒光強度分別增加為689.60%、1 216.13%。復(fù)合物發(fā)射峰特征性光譜位置發(fā)生明顯紅移，說明RCE添加后對EB-DNA體系微環(huán)境造成一定影響，但并未競爭性將EB從基因組DNA堿基平面替換下來。由此可說明，RCE與金黃色葡萄球菌基因組DNA部分發(fā)生了靜電結(jié)合，并未發(fā)生嵌插結(jié)合。熒光競爭性分析結(jié)果表明，RCE與金黃色葡萄球菌基因組DNA存在相互作用，其可能通過靜電或者小溝結(jié)合的方式發(fā)生作用。

上述結(jié)果表明，RCE可以通過多種途徑與金黃色葡萄球菌作用，從而導(dǎo)致菌體死亡。對菌體整體抑菌機制探究發(fā)現(xiàn)，RCE處理后胞內(nèi)ROS水平顯著上升506.90%。從RCE對細(xì)菌壁膜結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果來看，經(jīng)RCE 處理后的細(xì)菌的β-半乳糖苷酶活性、核酸泄漏量均顯著高于對照組，分別增加258.28% 和23.82%。PI 染料染色后，RCE處理組的紅色熒光明顯多于對照組，說明RCE可以破壞細(xì)菌的壁膜結(jié)構(gòu)，使壁膜的通透性發(fā)生改變。從蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果來看，RCE處理組蛋白質(zhì)含量顯著降低30.83%，整體代謝活力顯著下降30.89%，SDH 酶活力顯著下降了54.05%，說明RCE可以影響金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)合成和代謝活力。與DNA結(jié)合方式研究中發(fā)現(xiàn)，RCE可以進(jìn)一步與DNA進(jìn)行小溝結(jié)合或靜電結(jié)合，從而改變菌體功能和結(jié)構(gòu)。對比所有結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RCE處理對金黃色葡萄球菌胞內(nèi)ROS以及β半乳糖苷酶活性影響較大。因此，推測RCE對金黃色葡萄球菌的抑菌機制集中于ROS增加和細(xì)胞膜的損傷，并且可能通過膜介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑結(jié)合細(xì)胞膜通透性和完整性的測試結(jié)果導(dǎo)致金黃色葡萄球菌細(xì)胞凋亡。

3 討論

金黃色葡萄球菌作為人畜共患病中常見的致病菌，大多借助抗菌藥物進(jìn)行防治，但也促使了各類耐藥菌株的出現(xiàn)[30]。中藥提取物具有不易產(chǎn)生耐藥性、不良反應(yīng)低的特點，并可與抗生素聯(lián)用逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性，已逐漸成為解決細(xì)菌耐藥的新途徑[31]。黃連作為一種傳統(tǒng)中藥，具有抗炎、抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性，經(jīng)常在臨床上被用于抗腸道細(xì)菌感染[32]。因此，本研究采用黃連提取物對金黃色葡萄球菌進(jìn)行體外抑菌，結(jié)果表明，RCE 能夠良好抑制金黃色葡萄球菌的生長，其MIC為2.60 mg·mL?1，因而進(jìn)一步對其抑菌機制進(jìn)行研究。

在探究RCE 對金黃色葡萄球菌抑菌機制過程中發(fā)現(xiàn)，RCE作用金黃色葡萄球菌后胞內(nèi)ROS水平大幅上升，與陰性對照相比，RCE處理組細(xì)胞DCFH 熒光強度顯著增加506.90%，達(dá)到13 279 AU。ROS的大量積累會對膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA造成不可逆的氧化損傷[33]。因此，按照細(xì)胞結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)探究RCE 對細(xì)胞壁膜、蛋白質(zhì)（總蛋白、能量代謝酶等）以及DNA的影響。熒光染料PI標(biāo)記、β-半乳糖苷酶泄漏量和核酸泄漏量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RCE處理后金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁膜的完整性和通透性遭到較大破壞。其中，β-半乳糖苷酶是由蛋白質(zhì)亞基組成的四聚體酶，存在于細(xì)胞內(nèi)部，正常情況下，它不會從細(xì)胞中泄漏出來[34]。本研究結(jié)果顯示，RCE 處理后細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶外流量增加258.28%，表明細(xì)胞膜通透性的損傷使β-半乳糖苷酶釋放到周圍介質(zhì)中。同時，膜損傷也使包括RCE在內(nèi)的各種細(xì)胞外化合物的流入成為可能，細(xì)胞屏障和穩(wěn)態(tài)被破壞。經(jīng)RCE處理后，總蛋白合成量、整體代謝活力以及SDH酶活力均顯著降低，這可能導(dǎo)致菌體能量代謝受阻，能量供應(yīng)不足，新陳代謝速度變慢[28]；紫外光譜以及DAPI和EB競爭性結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)，RCE與金黃色葡萄球菌DNA發(fā)生小溝結(jié)合或靜電結(jié)合可能導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)、功能的變化。由以上結(jié)果可知，RCE對細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、細(xì)胞壁膜、細(xì)胞蛋白質(zhì)及核酸均有影響，但是其對胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞壁膜的影響最大。

RCE 含有生物堿、黃酮、木脂素類等多種生物活性成分，其中的小檗堿是一種PI3K激活劑，可以通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt-Nrf2途徑（PI3K/Akt/Nrf2是氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子）來調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激；其中的黃連堿可以激活Nrf2及其上游靶標(biāo)，從而調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞中ROS 的表達(dá)[35]。Dhamgaye 等[36]發(fā)現(xiàn)，小檗堿也可以通過ROS的產(chǎn)生、靶向細(xì)胞膜的完整性途徑以及影響熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSF1 的能力來顯示其抗白色念珠菌的潛力。楊維琴等[37]發(fā)現(xiàn)，RCE能夠通過增加副溶血弧菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性以及破壞細(xì)胞膜的完整性，抑制副溶血弧菌的生長。黃連中的黃連堿也可以通過抑制細(xì)胞代謝，包括氨基酸合成和呼吸代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和細(xì)胞壁通透性增加來抑制多殺巴斯德桿菌的生長[38]。這些結(jié)果與本研究結(jié)果中RCE對金黃色葡萄球菌胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞壁膜的影響最大相一致，因而推測RCE主要通過大量增加金黃色葡萄球菌胞內(nèi)ROS和破壞其細(xì)胞壁膜完整性、通透性達(dá)到抑菌效果；同時，RCE還作用于細(xì)菌核酸與蛋白質(zhì)協(xié)助抑菌。

綜上所述，RCE對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果，其抑菌機制主要體現(xiàn)在菌體細(xì)胞膜的破壞和胞內(nèi)ROS含量的大幅增加。RCE含有多種活性成分，與成分單一的抗生素相比，不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，并且RCE 作為天然植物提取物，具有良好的營養(yǎng)價值，是開發(fā)天然飼料添加劑的良好原料，值得進(jìn)一步深入研究。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ FITZGERALD J R. Livestock-associated Staphylococcus

aureus： origin， evolution and public health threat [J]. Trends

Microbiol.， 2012，20（4）：192-198.

［2］ PARK S，RONHOLM J. Staphylococcus aureus in agriculture：

lessons in evolution from a multispecies pathogen [J/OL]. Clin.

Microbiol. Rev.， 2021， 34（2）： e00182-20 [2024-01-26]. https：//

doi.org/10.1128/CMR.00182-20.

［3］ BEYER P， PAULIN S. Priority pathogens and the antibiotic

pipeline：an update [J/OL]. Bull.World Health Rrgan.， 2020，98（3）：

151 [2024-01-26]. https：//doi.org/10.2471/BLT.20.251751.

［4］ WU J，LUO Y， DENG D， et al .. Coptisine from Coptis chinensis

exerts diverse beneficial properties：a concise review [J]. J. Cell

Mol. Med.， 2019，23（12）：7946-7960.

［5］ LI C， SRIDHARA M B， RAKESH K P， et al .. Multi-targeted

dihydrazones as potent biotherapeutics [J]. Bioorg. Chem.，

2018，81：389-395.

［6］ XU Z， FENG W， SHEN Q， et al .. Rhizoma coptidis and

berberine as a natural drug to combat aging and aging-related

diseases via anti-oxidation and AMPK activation [J]. Aging

Dis.， 2017，8（6）：760-777.

［7］ WANG Y， DU P， JIANG D. Berberine functions as a negative

regulator in lipopolysaccharide-induced sepsis by suppressing

NF- κB and IL-6 mediated STAT3 activation [J/OL]. Pathog.

Dis.， 2020，78（7）：ftaa047 [2024-01-26].https：//doi.org/10.1093/

femspd/ftaa047.

［8］ 王茹，關(guān)亮俊，陳兩綿， 等. 黃連等6味中藥中生物堿苷類成

分的發(fā)現(xiàn)、分離和結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 中國中藥雜志， 2023， 48

（17）： 4598-4609.

WANG R， GUAN L J， CHEN L M， et al .. Discovery， isolation

and structural identification of alkaloid glycosides in six

traditional Chinese medicine such as Coptis chinensis [J].

China J. Chin. Mater. Med.， 2023，48（17）：4598-4609.

［9］ 周瑞，項昌培，張晶晶，等.黃連化學(xué)成分及小檗堿藥理作用

研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2020，45（19）：4561-4573.

ZHOU R， XIANG C P， ZHANG J J， et al.. Research progress on

chemical compositions of Coptidis Rhizoma and pharmacological

effects of berberine [J]. China J.Chin.Mater. Med.， 2020，45（19）：

4561-4573.

［10］ LIN S J， CHEN C S， LIN S S， et al.. In vitro anti-microbial and in

vivo cytokine modulating effects of different prepared Chinese

herbal medicines [J]. Food Chem. Toxicol.， 2006，44（12）：2078-2085.

［11］ 周芳芳，楊溫儀，王蕾.黃連解毒湯對100株臨床多重耐藥菌

的體外抑菌效果研究[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2018，39（24）：

3061-3065.

ZHOU F F， YANG W Y， WANG L. In vitro antibacterial effect

of coptidis decoction on 100 isolates of multi-drug resistant

bacteria [J]. Int. J. Lab. Med.， 2018，39（24）：3061-3065.

［12］ XUE D F， ZOU Z Y， CHEN B， et al .. Study on membrane

injury mechanism of total alkaloids and berberine from

Coptidis Rhizoma on Aeromonas hydrophila [J]. China J. Chin.

Mater. Med.， 2015，40（9）：1787-1792.

［13］ ARAYA-CONTRERAS T， VEAS R， ESCOBAR C A， et al ..

Antibacterial effect of Luma apiculata （DC.） burret extracts in

clinically important bacteria [J/OL]. Int. J. Microbiol.， 2019，2019：

7803726 [2024-01-26]. https：//doi.org/10.1155/2019/7803726.

［14］ GOEL S， MISHRA P. Thymoquinone inhibits biofilm formation

and has selective antibacterial activity due to ROS generation [J].

Appl. Microbiol. Biotechnol.， 2018，102（4）：1955-1967.

［15］ XIANG Q S， KANG C D， NIU L Y， et al.. Antibacterial activity and

a membrane damage mechanism of plasma-activated water against

Pseudomonas deceptionensis CM2 [J]. LWT Food Sci. Technol.，

2018， 96： 395-401.

［16］ LIU G R， SONG Z Q， YANG X L， et al .. Antibacterial

mechanism of bifidocin A，a novel broad-spectrum bacteriocin

produced by Bifidobacterium animalis BB04 [J]. Food Contr.，

2016，62：309-316.

［17］ KIELKOPF C L， BAUER W， URBATSCH I L. Bradford

assay for determining protein concentration [J/OL]. Cold

Spring Har. Protoc.， 2020（4）：102269 [2024-01-26]. https：//doi.

org/10.1101/pdb.prot102269.

［18］ WU Y P， BAI J R， ZHONG K， et al .. A dual antibacterial

mechanism involved in membrane disruption and DNA binding of

2R， 3R-dihydromyricetin from pine needles of Cedrus deodara

against Staphylococcus aureus [J]. Food Chem.， 2017，218：463-470.

［19］ HEGDE A H， PRASHANTH S N， SEETHARAMAPPA J.

Interaction of antioxidant flavonoids with calf Thymus DNA

analyzed by spectroscopic and electrochemical methods [J]. J.

Pharm. Biomed. Anal.， 2012，63：40-46.

［20］ LYU M X， WANG M W， LU K， et al .. DNA/Lysozyme-binding

affinity study of novel peptides from TAT （47-57） and BRCA1

（782-786） in vitro by spectroscopic analysis [J]. Spectrochim.

Acta Part A Mol. Biomol. Spectrosc.， 2019，209：109-117.

［21］ 王歡， 王敏， 劉竹青， 等. 藍(lán)莓黑醋栗枸杞?jīng)Q明子復(fù)合物對

眼部細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用[J]. 現(xiàn)代食品科技，2024，

40（1）：47-53.

WANG H， WANG M， LIU Z Q， et al .. Protective effect of a

complex of blueberry， blackcurrant， medlar and Cassia

obtusifolia against oxidative stress injury in retinal epithelial

cells [J]. Mod. Food Sci. Technol.， 2024， 40（1）： 47-53.

［22］ LEE B， LEE D G. Depletion of reactive oxygen species

induced by chlorogenic acid triggers apoptosis-like death in

Escherichia coli [J]. Free. Radic. Res.， 2018，52（5）：605-615.

［23］ LIU F， LIU Y， SUN Z， et al.. Preparation and antibacterial properties

of epsilon-polylysine-containing gelatin/chitosan nanofiber

films [J]. Int. J. Biol. Macromol.， 2020， 164： 3376-3387.

［24］ 陳夢玲，藍(lán)蔚青，李函笑，等.牛至精油對腐生葡萄球菌抑制

作用機制[J].食品科學(xué)，2020，41（7）：46-51.

CHEN M L， LAN W Q， LI H X， et al .. Action mechanism of

oregano essential oil against Staphylococcus saprophyticus [J].

Food Sci.， 2020，41（7）：46-51.

［25］ ZHU Y， ZHANG S .Antibacterial activity and mechanism of

lacidophilin from Lactobacillus pentosus against Staphylococcus

aureus and Escherichia coli [J/OL]. Front. Microbiol.， 2020，11：

582349 [2024-01-26]. https：//doi.org/10.3389/fmicb.2020.582349.

［26］ SHU H， CHEN H， WANG X， et al .. Antimicrobial activity and

proposed action mechanism of 3-Carene against Brochothrix

thermosphacta and Pseudomonas fluorescens [J/OL]. Molecules，

2019，24（18）：3246 [2024-01-26]. https：//doi.org/10.3390/molecules

24183246.

［27］ WU Y P， BAI J R， ZHONG K， et al .. Antibacterial effect of 2R，

3R-dihydromyricetin on the cellular functions of Staphylococcus

aureus [J]. Biosci. Biotechnol. Biochem.， 2018，82（1）：135-138.

［28］ 張舒涵，梁海運，孫佳慧，等. 甘草提取物對Staphylococcus

aureus 的抑菌活性及作用機理[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2024，

50（10）：259-265.

ZHANG S H， LIANG H Y， SUN J H， et al .. Antimicrobial

activity of licorice extract against Staphylococcus aureus and its

underlying mechanism of action [J]. Food Ferment. Ind.， 2024，

50（10）： 259-265.

［29］ ZHOU C Q， LI C Z， SIVA S，et al .. Chemical composition，

antibacterial activity and study of the interaction mechanisms

of the main compounds present in the Alpinia galanga

rhizomes essential oil [J/OL]. Ind. Crops Prod.， 2021， 165：

113441 [2024-01-26]. https：//doi.org/10.1016/j.indcrop.2021.113441.

［30］ JIN Y S， LIN J X， SHI H Q， et al .. The active ingredients in

Chinese peony pods synergize with antibiotics to inhibit MRSA

growth and biofilm formation [J/OL]. Microbiol. Res.， 2024，281：

127625 [2024-01-26]. https：//doi.org/10.1016/j.micres.2024.127625.

［31］ 黃梅，譚余慶，羅俊，等.植物類中藥抗細(xì)菌耐藥性的研究進(jìn)

展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2018，24（23）：218-224.

HUANG M， TAN Y Q， LUO J， et al .. Antimicrobial resistance

of Chinese herbal medicine [J]. Chin. J. Exp. Tradit. Med.

Formulae， 2018，24（23）：218-224.

［32］ WANG J， WANG L， LOU G H， et al .. Coptidis rhizoma： a

comprehensive review of its traditional uses， botany，

phytochemistry，pharmacology and toxicology [J]. Pharm. Biol.，

2019，57（1）：193-225.

［33］ RUBFIARO A S， TSEGAY P S， LAI Y， et al .. Scanning ion

conductance microscopy study reveals the disruption of the

integrity of the human cell membrane structure by oxidative

DNA damage [J]. ACS Appl. Bio. Mater.， 2021，4（2）：1632-1639.

［34］ WANG L H， WANG M S， ZENG X N， et al .. An in vitro

investigation of the inhibitory mechanism of β-galactosidase by

cinnamaldehyde alone and in combination with carvacrol and

thymol [J]. Biochim. Biophys. Acta （BBA） Gen. Subj.， 2017，

1861（1）：3189-3198.

［35］ WANG J， RAN Q， ZENG H R， et al .. Cellular stress response

mechanisms of rhizoma coptidis： a systematic review [J/OL].

Chin. Med.， 2018，13（1）：27 [2024-01-26]. https：//doi.org/10.1186/

s13020-018-0184-y.

［36］ DHAMGAYE S， DEVAUX F， VANDEPUTTE P， et al ..

Molecular mechanisms of action of herbal antifungal alkaloid

berberine， in Candida albicans [J/OL]. PLoS One， 2014， 9（8）：

e104554 [2024-01-26]. https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0104554.

［37］ 楊維琴，錢亮亮，張宗藝，等.黃連提取物抗副溶血弧菌活性

成分的鑒定及其作用機理[J].中國食品添加劑，2022，33（4）：

181-187.

YANG W Q， QIAN L L， ZHANG Z Y， et al .. Identification of

the active components of Coptis chinensis extracts and its

antibacterial mechanism on Vibrio parahaemolyticus [J]. China

Food Addit.， 2022，33（4）：181-187.

［38］ ZHANG R， TIAN S， ZHANG T， et al .. Antibacterial activity

mechanism of coptisine against Pasteurella multocida [J/OL].

Front. Cell. Infect. Microbiol.， 2023，13：1207855 [2024-01-26].

https：//doi.org/10.3389/fcimb.2023.1207855.