【摘要】 現(xiàn)階段腫瘤、放射治療等均可導(dǎo)致唾液腺生理和功能性損傷，且嚴(yán)重影響患者生理心理健康，唾液腺損傷修復(fù)仍是臨床治療的難點(diǎn)。細(xì)胞因子介導(dǎo)下的干細(xì)胞定向分化組織再生工程為唾液腺損傷修復(fù)提供新的治療靶點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞（ESC）和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）具有多向分化和自我更新潛能，在唾液腺組織再生修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。文章基于細(xì)胞因子介導(dǎo)下ESC/iPSC向經(jīng)典三胚層分化的研究，綜述了細(xì)胞因子介導(dǎo)干細(xì)胞向唾液腺定向分化的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞因子；多能干細(xì)胞；定向分化；唾液腺再生

Research progress of cytokine mediated pluripotent stem cells into salivary gland differentiation

CHENG Taiqi， YAN Xing

（Department of Stomatology， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China）

Corresponding author： YAN Xing， E-mail： happytooth@yeah.net

【Abstract】 Currently， tumor and radiotherapy can result in physiological and functional damage to the salivary glands， significantly impacting the physiological and psychological well-being of patients. The repair of salivary gland injuries remains a challenging aspect of clinical treatment. Tissue regeneration engineering through cytokine-mediated stem cell directed differentiation offers a novel therapeutic approach for addressing salivary gland injuries. Embryonic stem cells （ESC） and induced pluripotent stem cells （iPSC）， with their potential for multidirectional differentiation and self-renewal， play a crucial role in regenerating and repairing salivary gland tissue. Building upon studies on classical tridermal differentiation of ESC/iPSC mediated by cytokines， this paper provides an extensive review on the research progress and future prospects of utilizing cytokine-mediated stem cell differentiation for salivary gland regeneration.

【Key words】 Cytokine； Pluripotent stem cell； Directed differentiation； Regeneration of salivary glands

干燥綜合征或頭頸部惡性腫瘤的放射治療導(dǎo)致的唾液腺不可逆性損傷往往造成唾液分泌功能障礙，進(jìn)一步影響口腔健康乃至全身健康［1-4］。唾液是由三對(duì)大唾液腺和數(shù)百個(gè)小唾液腺分泌產(chǎn)生的、具有多種物理化學(xué)性質(zhì)的無(wú)色無(wú)味稀薄液體，其不僅在咀嚼、吞咽、保護(hù)口咽黏膜、促進(jìn)發(fā)音等方面發(fā)揮作用，而且在維持口腔微生物群穩(wěn)態(tài)方面扮演著重要的角色［5］。自身免疫疾病或放射治療導(dǎo)致的唾液分泌功能減弱，降低了口腔自潔、牙齒組織再礦化、對(duì)酸性微環(huán)境緩沖及抗菌等能力，這些因素均會(huì)導(dǎo)致齲齒快速進(jìn)展和牙齒硬組織喪失，致使齲齒發(fā)病概率大幅增加［6］。此外，患者還會(huì)出現(xiàn)口腔黏膜疼痛、味覺(jué)異常、口臭、咀嚼吞咽和言語(yǔ)困難等臨床表現(xiàn)，同時(shí)也增加了口腔及其他部位感染發(fā)生的概率［5， 7］。因此，關(guān)注唾液腺的保護(hù)以及唾液分泌質(zhì)量有助于促進(jìn)機(jī)體局部及全身的健康，對(duì)于保護(hù)機(jī)體功能以及系統(tǒng)健康至關(guān)重要。

針對(duì)原發(fā)性和自發(fā)性的唾液分泌功能喪失，目前臨床治療一般以藥物促進(jìn)唾液分泌以及唾液代用品為主。唾液激動(dòng)劑（鹽酸匹羅卡品、西維美林等）可以短暫快速地增加唾液的分泌［8］，但其作用效果取決于剩余腺體的功能，對(duì)于功能?chē)?yán)重破壞的腺體沒(méi)有明顯改善作用。有研究顯示，高壓氧治療［8］、針灸治療［9］和電刺激治療［10］等也可以增加唾液腺腺體分泌功能，緩解口干癥狀。由此可見(jiàn)，目前的治療主要集中于對(duì)癥治療，仍無(wú)有效的方法改善已經(jīng)受到損傷的腺體功能，尤其對(duì)于腺體實(shí)質(zhì)細(xì)胞（腺泡、導(dǎo)管細(xì)胞）完全被破壞的患者。盡管對(duì)癥治療或唾液激動(dòng)藥物的使用能夠在一定程度上改善患者口干癥狀，但不可逆性的腺體組織損傷限制了其治療效果，基于多種干細(xì)胞的組織再生治療已成為最具潛力且更加有效的治療方法［11-13］。充足的種子干細(xì)胞是保障干細(xì)胞治療成功的基本條件［14］。胚胎干細(xì)胞［15］（embryonic stem cell，ESC）和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞［16］（induced pluripotent stem cell，iPSC）作為分化潛能最為豐富的兩種干細(xì)胞，在定向分化及組織再生研究中已得到廣泛應(yīng)用。此外，隨著干細(xì)胞治療和組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，細(xì)胞因子介導(dǎo)下ESC/iPSC向成體細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化已成為目前研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。本文基于ESC/iPSC向經(jīng)典三胚層分化的研究，綜述了ESC/iPSC向唾液腺定向分化的研究進(jìn)展，為臨床治療唾液腺再生修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞

從20世紀(jì)90年代末科學(xué)家首次分離出人類ESC開(kāi)始［15］，人類再生醫(yī)學(xué)和發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的研究取得了全新的突破。如今，研究者們通過(guò)哺乳動(dòng)物原始性腺的分離培養(yǎng)［17］，不斷優(yōu)化培養(yǎng)方案，可以獲得可持續(xù)穩(wěn)定培養(yǎng)的單倍體胚胎干細(xì)胞用于定向誘導(dǎo)分化研究［18］。盡管人類對(duì)于ESC的研究工作引起很大的社會(huì)倫理學(xué)爭(zhēng)議，但基于ESC的細(xì)胞治療的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)研究仍在進(jìn)行中，特別是在脊髓損傷、視網(wǎng)膜黃斑變性、I型糖尿病、心力衰竭等方面已取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展［19］。在ESC研究中的細(xì)胞獲取及倫理相關(guān)問(wèn)題遲遲不能解決時(shí)，2006年，日本科學(xué)家山中伸彌教授將Oct3/4、Sox2、Kl4和c-Myc 4種基因通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞中，首次獲得了類似胚胎干細(xì)胞樣的細(xì)胞克隆，即iPSC［16］。iPSC與ESC類似，具有無(wú)限自我更新的能力和三胚層分化的多向分化潛能。由于iPSC來(lái)源于分化成熟的體細(xì)胞，從而避免了從胚胎或原始性腺中獲取ESC的倫理問(wèn)題。目前，iPSC技術(shù)已廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、疾病建模、藥物篩選及臨床治療等多個(gè)領(lǐng)域，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域一種重要的研究工具［13］。

2 細(xì)胞因子誘導(dǎo)應(yīng)用于三胚層分化

ESC/iPSC應(yīng)用于細(xì)胞治療中的異質(zhì)性和不可控制的成瘤性一直是其實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的難題［20］，因此，通過(guò)誘導(dǎo)分化ESC/iPSC形成特定組織的單能干細(xì)胞或特定體細(xì)胞的研究得到廣泛關(guān)注。轉(zhuǎn)錄因子的介入使得ESC/iPSC定向分化具有更高的誘導(dǎo)效率，但基因修飾過(guò)程中存在的可能基因組和表觀遺傳條件改變等問(wèn)題限制了其在臨床中的應(yīng)用；而在特定細(xì)胞因子和小分子化合物作用下進(jìn)行的定向誘導(dǎo)分化，可以更加安全有效地獲得所需體細(xì)胞類型。為了充分利用ESC/iPSC細(xì)胞來(lái)源的優(yōu)勢(shì)，設(shè)計(jì)出可重復(fù)且高效的分化方案來(lái)形成目標(biāo)細(xì)胞類型是目前研究的終極目標(biāo)。目前，通過(guò)誘導(dǎo)ESC/iPSC定向分化，在體外培養(yǎng)中可形成其來(lái)源的經(jīng)典三胚層分化細(xì)胞：心肌細(xì)胞［21］、神經(jīng)元細(xì)胞［22］、肝細(xì)胞［23］等，并且已形成了較為成熟的系統(tǒng)性誘導(dǎo)分化方法。視黃酸（retinoic acid，RA）、音猬因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是目前最常用的促神經(jīng)分化細(xì)胞因子和小分子化合物［22］；以激活素A、FGF2和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等細(xì)胞因子為基本要素的心肌細(xì)胞分化方案已經(jīng)較為成熟［21］；肝細(xì)胞樣細(xì)胞的基本誘導(dǎo)方法一般需在激活素A和Wnt3信號(hào)傳導(dǎo)作用下誘導(dǎo)形成定向內(nèi)胚層細(xì)胞，并進(jìn)一步在BMP和FGF作用下誘導(dǎo)為肝祖細(xì)胞，最后在肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、制瘤素M、地塞米松等作用下誘導(dǎo)形成肝細(xì)胞［23］。由此可見(jiàn)，細(xì)胞因子介導(dǎo)下的ESC/iPSC成體細(xì)胞定向分化研究已在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

3 細(xì)胞因子誘導(dǎo)應(yīng)用于唾液腺定向分化

干細(xì)胞治療是指利用活細(xì)胞來(lái)恢復(fù)或再生組織器官功能，目前有多種方法可以保護(hù)唾液腺損傷或提高唾液腺組織的再生能力。多能干細(xì)胞（pluripotent stem cell，PSC）及其衍生細(xì)胞以及這些細(xì)胞的旁分泌產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)和組織再生作用已有廣泛研究，其治療效果也在一些臨床前研究中得到證實(shí)，但其潛在作用機(jī)制目前仍不清楚［11］。因此，獲取足量且有效的唾液腺種子細(xì)胞成為干細(xì)胞治療發(fā)揮作用的關(guān)鍵，并且有望成為修復(fù)唾液腺組織損傷及解決唾液腺功能障礙的最佳方式之一［11］。唾液腺組織是由漿液性/黏液性腺泡細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞組成的分泌系統(tǒng)以及閏管、橫紋管和排泄管組成的導(dǎo)管系統(tǒng)共同形成的復(fù)雜但有序的分支結(jié)構(gòu)體系。如今研究者們根據(jù)唾液腺發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞間信號(hào)分子調(diào)控作用，不斷探索干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化形成功能性唾液腺的全新方法。

3.1 誘導(dǎo)形成唾液腺干細(xì)胞

利用譜系追蹤技術(shù)可以從成熟唾液腺組織的導(dǎo)管中分離出表達(dá)c-Kit、K14、CD49f和CD44等干細(xì)胞標(biāo)記物的唾液腺干細(xì)胞（salivary gland stem cell，SGSC）［24］。通過(guò)對(duì)唾液腺再生過(guò)程中基因通路的研究，結(jié)合組織工程學(xué)，可誘導(dǎo)iPSC分化為SGSC，可能成為唾液腺組織再生的有效方式，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)唾液腺損傷的治療［25］。結(jié)合三胚層經(jīng)典成體細(xì)胞分化方法，可以發(fā)現(xiàn)，ESC/iPSC的體外定向誘導(dǎo)分化全都基于體內(nèi)胚胎發(fā)育的基本模式和過(guò)程。已有研究證實(shí)利用間充質(zhì)干細(xì)胞與脫細(xì)胞腺體的外基質(zhì)環(huán)境結(jié)合可轉(zhuǎn)分化形成唾液腺上皮細(xì)胞譜系［26］，但考慮到原代組織和細(xì)胞獲取難度以及臨床應(yīng)用可行性，利用PSC直接開(kāi)發(fā)形成唾液腺類器官的研究仍在持續(xù)進(jìn)行［27］。2023年，Zhang等［28］報(bào)道了一種利用胚狀體作為中間途徑，通過(guò)RA促進(jìn)唾液腺初始分化，隨后通過(guò)小分子化合物激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)人ESC和人iPSC生成SGSC的有效方法。盡管胚狀體的中間態(tài)存在誘導(dǎo)不確定性等問(wèn)題，但以上研究表明，小分子化合物和細(xì)胞因子的組合應(yīng)用已逐漸滲入PSC成唾液腺的誘導(dǎo)分化過(guò)程中，可穩(wěn)定調(diào)節(jié)基因表達(dá)和表觀遺傳修飾，控制分化進(jìn)程，在唾液腺再生研究中已取得突破性進(jìn)展。

3.2 誘導(dǎo)形成功能性唾液腺

唾液腺細(xì)胞的二維（2-dimensional，2D）培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分化、增殖等體外研究，但基于唾液腺的復(fù)雜三維（3-dimensional，3D）結(jié)構(gòu)，2D培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法不能復(fù)制體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用，限制了對(duì)細(xì)胞間調(diào)控分化以及代謝等方面的研究［29-30］。通過(guò)將PSC誘導(dǎo)分化為唾液腺細(xì)胞，再將該種細(xì)胞生成的唾液腺類器官應(yīng)用于唾液腺疾病的治療，這種基于PSC衍生的工程化唾液腺類器官移植方案已得到廣泛研究。此外，利用體外3D成熟培養(yǎng)模型進(jìn)行的體內(nèi)移植，可降低異質(zhì)性因素并預(yù)測(cè)成瘤風(fēng)險(xiǎn)［31］。3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)有望成為替代2D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的另一種有廣闊前景的生物醫(yī)學(xué)研究方法。

SGSC或唾液腺原始芽的形成被認(rèn)為是成熟功能性唾液腺形成的重要中間階段。研究者通過(guò)3D培養(yǎng)人下頜下腺干細(xì)胞形成唾液腺三維類器官，在FGF10進(jìn)一步誘導(dǎo)下，與唾液腺間充質(zhì)細(xì)胞組合移植獲得具有唾液分泌功能的成熟唾液腺［24］。Zhang等［32］在另一項(xiàng)研究中利用BMP4（前3天）、RA（第4～6天）、FGF10（第6～10天）分時(shí)段處理小鼠胚胎干細(xì)胞后可形成ESC衍生的唾液腺基板，經(jīng)小鼠腎囊移植后可形成唾液腺導(dǎo)管結(jié)構(gòu)（橫紋管和排泄管）。如今，有研究者首次描述了一種經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的臨床級(jí)人唾液腺類器官衍生細(xì)胞療法生產(chǎn)工藝，以患者活檢取得的自體腺體組織為基礎(chǔ)，誘導(dǎo)形成可臨床應(yīng)用的SGSC，并可形成唾液腺類器官［33］。在唾液腺組織結(jié)構(gòu)形成以及譜系定形的過(guò)程中，Sox轉(zhuǎn)錄因子是腺泡細(xì)胞譜系的主要調(diào)節(jié)因子，而FGF通過(guò)驅(qū)動(dòng)上皮增殖進(jìn)而重塑腺體形成最終分支結(jié)構(gòu)［34］。2018年，Tanaka等［35］通過(guò)兩種轉(zhuǎn)錄因子（Sox9和Foxc1）的特定組合，首次利用小鼠胚胎干細(xì)胞衍生的口腔外胚層細(xì)胞分化為具有成熟唾液腺分泌功能的功能性唾液腺。2022年，該團(tuán)隊(duì)又利用改良的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，通過(guò)利用細(xì)胞因子和小分子化合物，在無(wú)需Sox9或Foxc1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)下，成功誘導(dǎo)人iPSC生成功能性唾液腺類器官，并且確認(rèn)了嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2 （severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）在該唾液腺類器官中的感染和復(fù)制，重現(xiàn)SARS-CoV-2感染唾液腺的體外模型［36］。

目前研究認(rèn)為，腮腺在胚胎第6周開(kāi)始發(fā)育，起源于上、下頜突分叉處的外胚層上皮，而下頜下腺在胚胎第6周末開(kāi)始發(fā)育，可能起源于頜舌溝舌下肉阜處內(nèi)胚層上皮，舌下腺在第7～8周開(kāi)始發(fā)育，起源于頜舌溝近外側(cè)的內(nèi)胚層上皮。已有研究證實(shí)唾液腺在組織結(jié)構(gòu)甚至轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式上都與內(nèi)胚層來(lái)源的肝臟組織類似［37］，然而截至目前，仍沒(méi)有內(nèi)胚層來(lái)源誘導(dǎo)形成功能性唾液腺的更進(jìn)一步研究成果。因此，基于唾液腺發(fā)育中的潛在多胚層來(lái)源優(yōu)勢(shì)，唾液腺在組織再生中的研究相比其他組織器官將具有更大的潛力。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

目前有關(guān)唾液腺再生的細(xì)胞因子誘導(dǎo)方案尚處于起步階段，仍有其本身的不足，在較長(zhǎng)的誘導(dǎo)周期里頻繁更換不同培養(yǎng)基會(huì)大量損失類唾液腺細(xì)胞聚集體的數(shù)量，尚不能滿足應(yīng)用于臨床治療的需求。隨著組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，ESC/iPSC參與下的組織再生研究已取得重大突破。形成具有完備分泌功能的唾液腺是需要包括腺泡、導(dǎo)管和肌上皮細(xì)胞等在內(nèi)的多種類型細(xì)胞共同參與并發(fā)揮作用，基于ESC/iPSC衍生的多種細(xì)胞類型的類器官誘導(dǎo)方案能夠有效解決這一難題。除此之外，獲取具備完整功能的唾液腺同樣需要遺傳學(xué)、生物學(xué)、材料學(xué)、組織工程學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的共同努力。結(jié)合發(fā)育生物學(xué)的基本研究方向，我們有理由相信，在特定細(xì)胞因子介導(dǎo)下、ESC/iPSC參與下的3D唾液腺再生研究或許能夠建立集程序性、穩(wěn)定性和高效性于一體的全新再生策略，為下一代唾液腺組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究提供全新方向。

利益沖突聲明：本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：鄭巧蘭）