摘 " "要：【目的】HB家族轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控植物器官發(fā)育和響應(yīng)非生物及生物脅迫的功能。揭示庫爾勒香梨HB基因家族成員在越冬過程中的表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制，為深入研究庫爾勒香梨HB家族基因的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā炕趲鞝柪障憷娴娜蚪M數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)對HB基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對這些基因的系統(tǒng)發(fā)育、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式作用元件及家族內(nèi)共線性進(jìn)行分析。同時(shí)，利用越冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對這些基因在越冬過程的差異表達(dá)模式進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】庫爾勒香梨基因組中共鑒定出93個(gè)HB基因家族成員，分為8個(gè)亞家族。這些基因在17條染色體上不均勻分布，其編碼的蛋白質(zhì)在大小、相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等方面表現(xiàn)出顯著多樣性。順式作用元件分析表明，大量的HB基因含有響應(yīng)光（97.85%）、脫落酸（78.49%）、赤霉素（50.54%）、低溫（41.94%）和干旱（54.84%）等環(huán)境應(yīng)激的順式作用元件。越冬適應(yīng)性分析發(fā)現(xiàn)，39個(gè)HB基因在越冬過程中表現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)，其中23個(gè)基因在12月最冷期的表達(dá)量達(dá)到最高，暗示HB基因在低溫應(yīng)激下的適應(yīng)性?！窘Y(jié)論】93個(gè)PsHBs基因家族成員在越冬過程的不同時(shí)期，其表達(dá)模式存在差異。為深入理解HB基因在低溫應(yīng)激中的功能及其調(diào)控機(jī)制提供新見解，并為庫爾勒香梨的遺傳改良及環(huán)境適應(yīng)性研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：庫爾勒香梨；轉(zhuǎn)錄因子；HB基因；越冬；生物信息學(xué)

中圖分類號：S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2025）01-0001-15

Genome-wide identification and expression of the HB gene family during overwintering in Korla pear （Pyrus sinkiangensis）

LIU Xiaoyan1， 2， WANG Lijuan1， YANG Shenghui1， LUO Guanghong1*， ZHU Jianbo2*

（1Hexi University/Gansu Microalgae Engineering and Technology Research Center， Zhangye 734000， Gansu， China; 2Shihezi University， Shihezi 832000， Xinjiang， China）

Abstract： 【Objective】 The HB （Homeobox） family of transcription factors plays a crucial role in regulating plant organ development and responding to both abiotic and biotic stresses. This study aims to elucidate the expression patterns and regulatory mechanisms of HB gene family members in Pyrus sinkiangensis during the overwintering process， providing a theoretical foundation for further exploration of the biological functions of the HB gene family in this species. 【Methods】 Based on the whole-genome database of P. sinkiangensis， bioinformatics tools were utilized to identify members of the HB gene family. Comprehensive analyses were performed， including phylogenetic relationships， chromosomal localization， gene structure， promoter cis-acting elements and family-wide collinearity. In addition， differential expression patterns of these genes during the overwintering process were examined using transcriptome data. 【Results】 A total of 93 HB gene family members were identified in the P. sinkiangensis genome through bioinformatics approaches. Analysis of the physicochemical properties of these HB proteins revealed that their lengths ranged from 176 to 1196 amino acids， with isoelectric points （pI） ranging from 4.69 to 9.32. More than 75% of these proteins had a pI below 7.0， suggesting that the HB genes in P. sinkiangensis likely encoded acidic proteins. The molecular weight of these proteins ranged from 20.18 ku to 135.08 ku， with PsHB69 being the largest and PsHB74 the smallest. Among all members， only PsHB5 contained a signal peptide， while the remaining members lacked signal peptides， indicating that the majority were not secreted proteins. Subcellular localization analysis showed that six members （PsHB90， PsHB54， PsHB15， PsHB48， PsHB36 and PsHB12） were localized in the chloroplast， while the others were localized in the nucleus. Chromosomal localization analysis revealed that the 93 HB gene family members were distributed across 17 chromosomes （Chr01-Chr17） in P. sinkiangensis. On chromosome 15， the highest number of HB members was distributed， totaling 12， while the other chromosomes contained 2 to 9 members each. Additionally， two pairs of closely located members on chromosomes 9 （PsHB46 and PsHB47） and 17 （PsHB92 and PsHB93） exhibited high sequence similarity. All four belonged to the HD-ZIP IV subfamily， suggesting that these pairs may have resulted from tandem duplication events. Phylogenetic analysis indicated that the HB gene family in P. sinkiangensis， along with Arabidopsis and Malus domestica， can be divided into eight subfamilies based on the classification of the Arabidopsis HB gene family and the HD-ZIP I-IV gene families in Malus domestica. Among these subfamilies， HD-ZIP I and HD-ZIP IV contained the most members， with a total of 34 genes. In P. sinkiangensis， all HB members contained exons， with the number ranging from 2 to 20. Each HB gene in P. sinkiangensis contained a coding sequence （CDS） region， although 59 members lacked untranslated regions （UTRs）. Conserved domain analysis of these proteins revealed that all members possessed the HD domain， and a total of 25 types of domains were identified among the 93 members. Besides the HD domain， the Homeodomain-associated Leucine Zipper （HALZ） domain was the most abundant， which was thought to mediate protein-protein interactions. Collinearity analysis of the HB gene family in P. sinkiangensis revealed 70 pairs of collinear genes. Interestingly， PsHB genes on chromosomes 8 and 15 appeared as tandem duplicates but belonged to different subfamilies. Further examination of the Ka/Ks ratio of these duplicated genes revealed values ranging from 0.06 to 0.49. Among the 70 pairs of collinear genes in P. sinkiangensis， 67 pairs had a Ka/Ks ratio of less than 1， indicating that these genes were under purifying selection and that their sequences were conserved throughout evolution. A cis-acting element analysis of the 2000 bp upstream promoter regions of the P. sinkiangensis PsHB gene family members identified 12 types of cis-elements related to plant hormone and stress responses. Among these， 78.49% of the PsHB genes contained an abscisic acid-responsive element （ABRE）， and 50.54% contained gibberellin-responsive elements （P-box and GARE-motif）. This suggested that the HB gene family may play a role in mitigating environmental stress through hormone-mediated pathways. Additionally， 41.94% and 54.84% of the PsHB genes contained low-temperature responsive elements （LTR） and drought-responsive elements （MBS）， respectively. Transcriptome data analysis during three stages of the overwintering process in P. sinkiangensis revealed that 39 out of the 93 PsHB genes were differentially expressed. Of these differentially expressed genes， more than half （23 genes） showed peak expression during the coldest period in January （TM）， 11 genes had the highest expression at the end of the overwintering period in March （TF）， and the remaining 5 genes exhibited the highest expression at the beginning of overwintering in October. Notably， during the coldest period in December， PsHB11 and PsHB78 were upregulated by 10.5-fold and 7.0-fold， respectively， indicating that these two genes may play a significant role during bud dormancy. Approximately 42% of the HB genes were significantly and differentially expressed during the overwintering period， with the majority reaching their peak expression in December， the coldest month， suggesting that the PsHB gene family played a critical role in cold stress resistance. 【Conclusion】 The expression patterns of the 93 PsHB gene family members varied across different stages of the overwintering process. These findings provide new insights into the functional roles and regulatory mechanisms of HB genes in response to cold stress， laying a foundation for genetic improvement and environmental adaptability research in P. sinkiangensis.

Key words： Pyrus sinkiangensis; Transcription Factor; HB Gene; Overwintering; Bioinformatics

同源盒基因家族（HB基因家族）廣泛存在于植物和動(dòng)物中。HB基因家族的成員通常都包含一個(gè)高度保守的同源異型框結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD），能夠與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)[1-3]。Mukherjee等[4]根據(jù)蛋白質(zhì)序列進(jìn)化分析，將植物中HB基因家族分為14類：HD-ZIPⅠ、HD-ZIP Ⅱ、HD-ZIP Ⅲ、HD-ZIP Ⅳ、PLINC、WOX、NDX、DDT、PHD、LD、SAWADEE、PINTOX、BEL和KNOX[5]。其中HD-ZIP Ⅰ～Ⅳ亞家族共同含有HD和亮氨酸拉鏈（leucine zipper，LZ）結(jié)構(gòu)域[6]，HD-ZIP Ⅲ亞族蛋白包含START結(jié)構(gòu)域和MEKHLA結(jié)構(gòu)域，HD-ZIP Ⅳ相比于HD-ZIP Ⅲ亞族不含有MEKHLA結(jié)構(gòu)域[7-8]。PLINC亞族特有的是PLINC結(jié)構(gòu)域；WOX家族特有的是WUS Box結(jié)構(gòu)域；NDX家族具有NDX A和NDX B結(jié)構(gòu)域；DDT亞族特有的是DDT和WSD結(jié)構(gòu)域；PHD亞族特有的是PHD結(jié)構(gòu)域；LD亞族特有的是LD 1～5結(jié)構(gòu)域；SAWADEE亞族特有的是SAWADEE結(jié)構(gòu)域；PINTOX亞族特有的是ACID PINT和PINTOX結(jié)構(gòu)域；BEL亞族特有的是ZIBEL結(jié)構(gòu)域；KONX亞族含有KNOX結(jié)構(gòu)域[4]。

HB基因家族編碼的轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、形態(tài)建成以及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6]。KNOX基因可以參與細(xì)胞分生組織能力的調(diào)控，從而促進(jìn)芽的形成[9]。PtrWOX4能夠促進(jìn)形成層分化[10]，WOX11/12可以調(diào)控葉子邊緣形狀、大小和長寬[11-12]。通過RNA干擾技術(shù)沉默SlBL4基因的番茄突變體表現(xiàn)出脫落區(qū)表皮細(xì)胞的顯著增大，進(jìn)而影響了果柄的正常形成，并導(dǎo)致了果實(shí)的過早脫落[13]。蘋果中MdHB7和MdHB7-like基因在ABA和干旱脅迫下被上調(diào)，其過表達(dá)顯著提高了ABA水平進(jìn)而增強(qiáng)了植物的抗逆性[14]。CaHB12轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)提高了棉花的抗旱性，并通過抑制茉莉酸響應(yīng)基因負(fù)調(diào)控對大麗弧菌的抗性[15]。CaATHB-12沉默提高了寒冷脅迫下辣椒果實(shí)中的抗氧化酶活性，而過表達(dá)降低了低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥品系中抗氧化酶活性，表明CaATHB-12參與辣椒果實(shí)中寒冷脅迫的調(diào)節(jié)[16]。

庫爾勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yü）是薔薇科梨屬中的一個(gè)優(yōu)良新疆地方梨品種，屬于多年生木本植物，主要種植在中國新疆的庫爾勒和阿克蘇地區(qū)。該品種因獨(dú)特的香氣和高品質(zhì)深受消費(fèi)者青睞，并且已經(jīng)有1400多年的栽培歷史，成為當(dāng)?shù)氐闹匾?jīng)濟(jì)作物[17]。然而，隨著氣候變化的加劇，新疆地區(qū)頻繁出現(xiàn)極端低溫天氣，導(dǎo)致庫爾勒香梨樹體受到嚴(yán)重的凍害[18-19]，進(jìn)而引發(fā)腐爛病等病害，對梨樹的健康和產(chǎn)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響。HB基因家族作為一類調(diào)控植物發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，在庫爾勒香梨的抗寒性研究中具有重要意義。目前關(guān)于HB家族的研究主要集中在模式植物中，且絕大部分為草本植物，例如擬南芥[20]、水稻[21]和馬鈴薯[22]等，但是對于多年生木本植物的研究相對較為匱乏。筆者在本研究中對庫爾勒香梨基因組中HB基因進(jìn)行了比較全面的分析，為后續(xù)研究庫爾勒香梨HB基因功能研究提供一定的基礎(chǔ)，也為庫爾勒香梨優(yōu)良抗性品種的進(jìn)一步選育提供理論指導(dǎo)，對庫爾勒香梨產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

基因組測序所用的庫爾勒香梨組培苗試驗(yàn)材料由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存?；蚪M數(shù)據(jù)的測定由百邁克生物有限公司（http：//www.biomarker.com.cn/）完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 庫爾勒香梨HB家族成員全基因組的鑒定 為鑒定庫爾勒香梨基因組中全部的HB家族成員，從擬南芥（Arabidopsis thaliana）數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）和蘋果（Malus domestica）數(shù)據(jù)庫（https：//iris.angers.inra.fr/gddh13/）中下載全部的HB家族成員的蛋白序列，使用本團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建的庫爾勒香梨全基因組數(shù)據(jù)[23]（https：//ngdc.cncb.ac.cn/，數(shù)據(jù)編號為PRJCA007928）進(jìn)行比對。以擬南芥和蘋果HB基因序列為靶序列，參考Li等[24]的方法篩選庫爾勒香梨的HB序列，利用BLASTp檢索出庫爾勒香梨全基因組中的HB候選序列，用隱馬爾可夫模型（HMM）進(jìn)一步檢索庫爾勒香梨HB基因結(jié)構(gòu)域（PF00046、PF02183），E值為e-5。檢索后的序列利用NCBI網(wǎng)站中的Batch CD-Search工具對筆者上一步篩選出的庫爾勒香梨HB基因家族蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，剔除不含有HB相關(guān)結(jié)構(gòu)域的序列。將獲得的PsHB基因家族蛋白序列的長度、相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等信息，由在線網(wǎng)站ExPASY（http：//www.expasy.org）分析。庫爾勒香梨HB基因家族的亞細(xì)胞定位預(yù)測利用SignaIP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）完成。

1.2.2 庫爾勒香梨HB基因在染色體上的分布 庫爾勒香梨HB基因家族的染色體定位分析參照林藝靈等[5]的方法。

1.2.3 庫爾勒香梨HB基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 庫爾勒香梨HB基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建參照林藝靈等[5]的方法。利用MEGA11軟件[25]構(gòu)建進(jìn)化樹。進(jìn)化樹美化使用tvBOT在線網(wǎng)站（https：//www.chiplot.online/tvbot.html）完成[26]。

1.2.4 庫爾勒香梨HB基因結(jié)構(gòu)和所編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析 基因結(jié)構(gòu)的注釋和MEME保守基序分析參考葉明輝等[22]的方法。使用NCBI中蛋白結(jié)構(gòu)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測網(wǎng)站CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）來搜索庫爾勒香梨HB蛋白包含的結(jié)構(gòu)域，可視化圖形利用TBtools軟件[27]完成。

1.2.5 庫爾勒香梨HB基因家族共線性和選擇壓力分析 庫爾勒香梨HB基因家族共線性和選擇壓力分析參考林藝靈等[5]的方法。

1.2.6 庫爾勒香梨HB基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分析 利用PlantCARE[28]在線網(wǎng)站對庫爾勒香梨HB基因家族ATG上游2000 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測分析。使用基因結(jié)構(gòu)可視化網(wǎng)站GSDS v2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）進(jìn)行可視化。

1.2.7 越冬過程中庫爾勒香梨HB基因的表達(dá)特性分析 根據(jù)本課題組前期庫爾勒香梨1年生枝條韌皮部的轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)[23]進(jìn)行庫爾勒香梨HB基因家族的表達(dá)分析，庫爾勒香梨越冬轉(zhuǎn)錄組測定的取樣時(shí)間分別是2019年10月中旬的越冬初期（TB）、2020年1月中旬的越冬最冷期（TM）和2020年3月中旬的越冬末期（TF）。根據(jù)基因組ID號從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取HB基因在越冬過程中的基因表達(dá)量信息，以|log2foldchange| ≥1為條件篩選差異表達(dá)基因，使用TBtools繪制熱圖。

筆者選取3個(gè)HB基因（PsHB3、PsHB23和PsHB66）用于qRT-PCR驗(yàn)證。使用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物，PsHB3使用的引物序列（5'→3'）上游：GTGGGTCTGTGTCTAATCTTGG，下游：GCATCAGGGTTCAAGGTCTAG；PsHB23使用的引物序列（5'→3'）上游：GGTCTCTGAAGGCGAAGTATC，下游：AAGAATCACCAGGCTCCAAG；PsHB66使用的引物序列（5'→3'）上游：TCAAAGTCCCACAAGTTCTCC，下游：AGGTGAATGATCCGAAGCTATG。采用ROCHE LightCycler? 480 system儀器檢測各基因的表達(dá)水平，以SYBR Green（KAPA Biosystems，Wilmington，MA，USA）作為熒光染料。PCR總體系為10 μL，每管分別加入2 ng RNA模板、上下游引物各為0.5 μL和5 μL熒光染料，最后用去離子水補(bǔ)足至10 μL。以PsGADPH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Excel和SPSS v23.0統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS Inc.; Chicago，IL，USA）。作圖與相關(guān)性分析采用Origin 2020軟件（OriginLab; Northampton，MA，USA）和TBtools軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 庫爾勒香梨HB家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

以擬南芥和蘋果HB基因家族的蛋白序列作為參考，最終在庫爾勒香梨基因組中鑒定出93個(gè)HB基因。根據(jù)其在庫爾勒香梨染色體上的分布位置情況，將這些基因命名為庫爾勒香梨HB（PsHB）1～93（表1）?；蚓幋a的蛋白長度、相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、信號肽的預(yù)測和亞細(xì)胞定位的預(yù)測如表1所示。HB蛋白的長度范圍在176～1196個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量范圍在20.18～135.08 kDa之間，最大的是PsHB89，最小的是PsHB4。由此可見，庫爾勒香梨HB基因家族的氨基酸和相對分子質(zhì)量的差異是比較大的。等電點(diǎn)（pI）的范圍為4.69～9.32（表1），其中超過75%的蛋白等電點(diǎn)在7.0以下，表明庫爾勒香梨的HB基因編碼的可能是一類酸性蛋白。所有的成員中僅PsHB5具有信號肽，剩下的PsHB成員沒有信號肽。將庫爾勒香梨PsHB蛋白序列上傳至SignaIP4.1網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)成員（PsHB90、PsHB54、PsHB15、PsHB48、PsHB36和PsHB12）定位在葉綠體上，其余全部定位于細(xì)胞核。

2.2 庫爾勒香梨HB基因家族染色體定位分析

93個(gè)庫爾勒香梨HB基因家族成員分別定位在17條染色體上（圖1）。其中在庫爾勒香梨Chr15上HB基因家族的成員數(shù)量最多，為12個(gè)，其余染色體上的成員個(gè)數(shù)較少（2～9個(gè)）。多數(shù)成員存在染色體的上端和下端，在染色體中部分布較少。有1/3以上的成員集中分布在Chr14～17這4條染色體上面。另外，在9號染色體和17號染色體上的PsHB46、PsHB47和PsHB92、PsHB93兩對成員位置相近且序列具有高度一致性。同時(shí)，它們4個(gè)均屬于HD-ZIP Ⅳ家族的成員。

2.3 庫爾勒香梨HB基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了解庫爾勒香梨HB基因家族間的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了庫爾勒香梨、擬南芥和蘋果HB基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。參考擬南芥HB基因家族與蘋果HD-ZIPⅠ～Ⅳ基因家族分類，使用ClustalW多重序列比對方法將筆者獲得的庫爾勒香梨HB蛋白序列進(jìn)行對比，最終根據(jù)進(jìn)化關(guān)系將其分為8個(gè)亞家族。其中HD-ZIPⅠ和Ⅳ家族的成員在基因組中包含HB的成員數(shù)量較多，兩者共有34個(gè)，占所有成員的1/3以上。最少的亞家族是DDT，有2個(gè)成員。

2.4 庫爾勒香梨HB基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

庫爾勒香梨中HB成員均包含CDS（Coding DNA Sequence），數(shù)目在2～20個(gè)（圖3），34個(gè)成員有非翻譯區(qū)（Untranslated Region，UTR）。庫爾勒香梨HD-ZIPⅠ亞家族的CDS數(shù)量為2～4個(gè)，且CDS和內(nèi)含子（Intron）排列的分布規(guī)律一致，為CDS-Intron-CDS。由于一些基因在長度上差異較大，不同亞家族的內(nèi)含子和外顯子的分布位置和數(shù)目也存在很大差異。

使用NCBI網(wǎng)站中提供的Batch CD-Search工具對庫爾勒香梨HB基因家族蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示均含有HD結(jié)構(gòu)域（圖3）。所有庫爾勒香梨PsHB成員共有25種結(jié)構(gòu)域，除HD結(jié)構(gòu)域外，同源異型盒相關(guān)亮氨酸（HALZ）結(jié)構(gòu)域的數(shù)量最多。

2.5 庫爾勒香梨HB基因家族共線性和選擇壓力分析

通過TBtools中的MCScanX插件分析庫爾勒香梨HB基因家族的共線性關(guān)系，結(jié)果（表2和圖4）表明庫爾勒香梨HB基因家族有70對共線性基因。共鑒定出了6個(gè)串聯(lián)復(fù)制事件（PsHB30/PsHB31、PsHB33/PsHB34、PsHB46/PsHB47、PsHB61/PsHB62、PsHB70/PsHB71/PsHB72、PsHB92/PsHB93），分別位于第8、8、9、14、15和17號染色體上。筆者發(fā)現(xiàn)，在第8號染色體和15號染色體上PsHB基因以串聯(lián)復(fù)制的形式出現(xiàn)，但屬于不同的亞家族，這表明在串聯(lián)復(fù)制之后，這些基因的序列發(fā)生了很大程度的改變，可以通過結(jié)構(gòu)域的重組獲得蛋白質(zhì)的多樣化。通過鑒定庫爾勒香梨HB家族復(fù)制基因的Ka/Ks值發(fā)現(xiàn)，Ka/Ks值的取值范圍在0.06～0.49之間。庫爾勒香梨70對共線性基因中67對復(fù)制基因鑒定出Ka/Ks值小于1。表明整體序列偏向于保守型，進(jìn)化時(shí)受純化選擇影響。其中3對復(fù)制基因鑒定產(chǎn)生異常值，異常值產(chǎn)生的原因可能是序列分歧度太大，進(jìn)化距離太遠(yuǎn)。

2.6 庫爾勒香梨HB基因順式作用元件分析

對PsHB基因家族成員上游2000 bp的啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件分析，鑒定出與植物激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)的12種啟動(dòng)子順式作用元件（圖5）。其中，激素類相關(guān)的響應(yīng)元件包括茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element、SARE）、赤霉素響應(yīng)元件（P-box、GARE-motif）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）和生長素響應(yīng)元件（TGA-element、AuxRR-core）等5類。PsHB基因中，78.49%含有ABRE，50.54%含有P-box、GARE-motif。與脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件有7類，包括無防御和應(yīng)激反應(yīng)元件（TC-rich repeats、TATC-box）、傷口響應(yīng)元件（WUN-motif）、光響應(yīng)元件（ACE、GT1-motif、3-AF1 binding site、AAAC-motif、MRE、Sp1、G-Box/box）、氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件（ARE）、低溫響應(yīng)誘導(dǎo)元件（LTR）、缺氧特異性誘導(dǎo)元件（GC-motif）和干旱響應(yīng)誘導(dǎo)元件（MBS）。其中，含有MBS和LTR元件的PsHB基因分別占41.94%和54.84%。而PsHB25、PsHB55、PsHB61、PsHB84和PsHB91這4個(gè)基因含有與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的元件。這些結(jié)果表明PsHB基因廣泛參與庫爾勒香梨的脅迫響應(yīng)及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

2.7 庫爾勒香梨HB基因家族在越冬過程中的表達(dá)分析

對庫爾勒香梨越冬過程中3個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，有39個(gè)基因在越冬過程中差異表達(dá)。圖6-A顯示，在鑒定出來的差異表達(dá)基因中有超過半數(shù)的基因（21個(gè)）在3月份越冬末期（TF）高表達(dá)，11個(gè)基因在12月份的越冬最冷期（TM）高表達(dá)，其余7個(gè)基因在10月份越冬初期（TB）高表達(dá)。其中在12月份的越冬最冷期，PsHB11和PsHB78相比于越冬初期分別上調(diào)10.5和7.0倍，表明這兩個(gè)基因可能在芽休眠期發(fā)揮一定的作用。大約42%的PsHB基因在越冬過程中顯著差異表達(dá)，并且大部分基因在越冬最冷時(shí)期12月份時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，提示庫爾勒香梨中的HB基因家族在越冬時(shí)期低溫脅迫中發(fā)揮作用。熒光定量PCR的結(jié)果顯示，PsHB3、PsHB23和PsHB66基因在越冬過程中的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序一致（圖6-B）。

3 討 論

前人的研究已經(jīng)對多個(gè)物種中的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了鑒定。例如，擬南芥中發(fā)現(xiàn)了110個(gè)HB基因[20]，胡蘿卜（Daucus carota）中鑒定出了140個(gè)HB基因[29]，水稻（Oryza sativa）中有107個(gè)HB基因[21]，油菜（Brassica rapa）中有113個(gè)HB基因[30]，毛楊果（Populus trichocarpa）中有156個(gè)HB基因[31]。而在筆者的研究中，庫爾勒香梨的基因組中共鑒定出了93個(gè)HB基因。與其他物種相比，庫爾勒香梨中HB基因的數(shù)目相對來說比較少，庫爾勒香梨HB基因可能在進(jìn)化過程中發(fā)生了部分基因缺失。根據(jù)庫爾勒香梨基因組基因結(jié)構(gòu)的注釋，PsHBs基因在所有17條染色體上分布不均勻，染色體編號為14、15和17這幾條染色體上的PsHBs基因約占總數(shù)的三分之一。因此，筆者推測這3條染色體上存在PsHBs基因的進(jìn)化熱點(diǎn)。類似的結(jié)果也在其他物種中得到了驗(yàn)證。例如，在毛楊果中Chrs 1、2和5同樣是約占PtrHBs基因總數(shù)的三分之一[31]。葡萄中的VvHBs基因在Chrs 4、8和18上占基因總數(shù)的三分之一[5]。

根據(jù)擬南芥和蘋果HB基因家族的分類和系統(tǒng)發(fā)育樹，筆者將庫爾勒香梨的HB基因劃分為8個(gè)亞家族，包括HD-ZipⅠ～Ⅳ、WOX、BEL、KNOX和DDT。與擬南芥相比，庫爾勒香梨的HB基因家族缺少了PINTOX、NDX、LD、PLINC、PHD和SAWADEE類成員[20]。而在其他物種中對HB基因家族的鑒定也發(fā)現(xiàn)存在差異，如在水稻、油菜中也僅分別鑒定出10個(gè)和9個(gè)HB基因亞家族[21，30]。將與其同為薔薇科的蘋果HB基因家族成員數(shù)量進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)HD-Zip Ⅱ家族成員的數(shù)量是一致的，均為13個(gè)[32]。而且?guī)鞝柪障憷鍴D-Zip Ⅰ、HD-Zip Ⅲ和HD-Zip Ⅳ亞家族成員的數(shù)量與蘋果中亞家族的數(shù)量相似，分別為19、8和15個(gè)。表明庫爾勒香梨和蘋果作為薔薇科植物，在進(jìn)化過程中表現(xiàn)出一定程度的保守性，并且在形態(tài)發(fā)育、生長和逆境響應(yīng)等方面可能存在類似的基因調(diào)控機(jī)制。這種相似性可能源于他們的共同祖先或者遺傳機(jī)制的保守性，這對筆者理解這些植物的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及他們之間的關(guān)系具有重要意義。庫爾勒香梨HB基因中存在70對片段重復(fù)基因，表明在庫爾勒香梨進(jìn)化過程中可能促進(jìn)了基因組的重組和重排，進(jìn)而增加了遺傳多樣性，在進(jìn)化過程中發(fā)揮了重要作用。此外，還存在6對串聯(lián)重復(fù)基因，這將可能導(dǎo)致基因副本間的相互作用，可能影響基因的表達(dá)和功能，有助于庫爾勒香梨在逆境脅迫下進(jìn)行基因組調(diào)節(jié)和進(jìn)化，表明HB基因家族成員的擴(kuò)增以片段重復(fù)為主。在9號染色體和17號染色體上的PsHB46、PsHB47和PsHB92、PsHB93兩對成員位置相近并且序列具有高度的一致性，它們4個(gè)都屬于HD-ZIP Ⅳ家族的成員，推測可能是基因間的串聯(lián)重復(fù)造成的。8號染色體第2個(gè)位置和15號染色體上PsHBs基因以串聯(lián)復(fù)制的形式出現(xiàn)，但屬于不同的亞家族。這表明在串聯(lián)復(fù)制之后這些基因的序列發(fā)生了很大程度的改變，可以通過結(jié)構(gòu)域的重組獲得蛋白質(zhì)的多樣化，推測這些基因可能在串聯(lián)復(fù)制后失去了原有的功能或獲得了新的功能。

轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的順式作用元件結(jié)合以在各種生物過程中調(diào)節(jié)基因表達(dá)[33-35]。筆者分析了庫爾勒香梨所有PsHBs基因上游2000 bp啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)這些啟動(dòng)子含有多種參與激素和非生物脅迫反應(yīng)的順式作用元件，包括茉莉酸甲酯（MeJA）反應(yīng)元件、光反應(yīng)元件、ABA反應(yīng)元件和厭氧誘導(dǎo)反應(yīng)元件。這些結(jié)果在油菜中也存在[30]，大多數(shù)HB基因啟動(dòng)子含有與光反應(yīng)、激素反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。其中只有PsHB25、PsHB55、PsHB61、PsHB84和PsHB91這5個(gè)基因含有創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的元件，暗示其可能在庫爾勒香梨受到創(chuàng)傷時(shí)發(fā)揮一定作用。表明PsHBs基因廣泛參與庫爾勒香梨的脅迫響應(yīng)和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

植物在越冬過程中，ABA是最主要的誘導(dǎo)劑和維持者[36]。大量的HD-Zip I蛋白在受到ABA信號誘導(dǎo)時(shí)參與植物應(yīng)對脅迫的過程[37]。PsHBs基因上游2 kb的啟動(dòng)子中包含大量的ABA響應(yīng)元件。此外，筆者前期的研究中發(fā)現(xiàn)，庫爾勒香梨越冬過程中PsHBs基因隨著越冬過程中環(huán)境溫度的波動(dòng)，其表達(dá)水平也隨之發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。PsHB基因的上調(diào)表達(dá)可能與越冬過程中ABA信號的調(diào)控相關(guān)聯(lián)。油菜型甘藍(lán)HB7/12提高了擬南芥種子在萌發(fā)時(shí)對ABA的敏感性，并且過表達(dá)株系具有更高的抗旱性[38]。油菜型甘藍(lán)HB7/12與越冬最冷時(shí)期高表達(dá)的PsHB3和PsHB23同屬HD-Zip Ⅰ亞家族，具有大量的ABA響應(yīng)元件并且在越冬過程中具有較高的表達(dá)量。因此，推測PsHB3和PsHB23基因在庫爾勒香梨越冬過程中扮演著參與ABA信號調(diào)控的重要角色，并響應(yīng)越冬時(shí)期低溫脅迫。這一結(jié)果深化了對庫爾勒香梨越冬適應(yīng)性的理解，為未來探究其越冬機(jī)制提供了重要線索。然而，需進(jìn)一步的研究來明確HB基因在ABA信號調(diào)控中的具體調(diào)控機(jī)制，以及他們在庫爾勒香梨越冬過程中的具體作用機(jī)制。

綜上所述，本研究全面鑒定并分析了庫爾勒香梨HB基因家族，揭示了其在環(huán)境響應(yīng)特別是越冬適應(yīng)性中的重要潛在作用。這些結(jié)果不僅豐富了對庫爾勒香梨基因組資源的了解，還為深入探究HB基因家族在其他植物物種中的功能提供了參考。

4 結(jié) 論

通過對庫爾勒香梨全基因組的系統(tǒng)分析，成功鑒定出93個(gè)HB基因家族成員。這些基因在17條染色體上不均勻分布，且編碼的蛋白質(zhì)在大小、相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等參數(shù)表現(xiàn)出顯著的差異。系統(tǒng)進(jìn)化分析將這些基因歸為BEL、DDT、HD-ZIPⅠ～Ⅳ、KNOX和WOX等8個(gè)亞家族。順式作用元件分析顯示，大部分HB基因含有響應(yīng)脫落酸、赤霉素、低溫、干旱和無氧等環(huán)境應(yīng)激的元件，暗示這些基因可能在庫爾勒香梨的環(huán)境適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用。越冬適應(yīng)性分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在越冬過程中有39個(gè)HB基因表現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)，還有11個(gè)基因在最冷的12月（TM時(shí)期）表達(dá)量達(dá)到最高。這些結(jié)果表明，HB基因家族可能在庫爾勒香梨的越冬適應(yīng)性中扮演關(guān)鍵角色。綜上所述，本研究不僅為庫爾勒香梨的基因組研究提供了新的資源，也為探討HB基因在其他植物中的功能及其在環(huán)境適應(yīng)性中的調(diào)控機(jī)制提供了重要參考。

參考文獻(xiàn) References：

[1] WANG H L，CHENG X，YIN D M，CHEN D L，LUO C，LIU H，HUANG C L. Advances in the research on plant WRKY transcription factors responsive to external stresses[J]. Current Issues in Molecular Biology，2023，45（4）：2861-2880.

[2] RADANI Y，LI R X，KORBOE H M，MA H Y，YANG L M. Transcriptional and post-translational regulation of plant bHLH transcription factors during the response to environmental stresses[J]. Plants，2023，12（11）：2113.

[3] LIU H T，TANG X，ZHANG N，LI S G，SI H J. Role of bZIP transcription factors in plant salt stress[J]. International Journal of Molecular Sciences，2023，24（9）：7893.

[4] MUKHERJEE K，BROCCHIERI L，BüRGLIN T R. A comprehensive classification and evolutionary analysis of plant homeobox genes[J]. Molecular Biology and Evolution，2009，26（12）：2775-2794.

[5] 林藝靈，劉眾杰，王子誠，楊毓賢，王令宇，張川，王晨，賈海鋒，盧素文，房經(jīng)貴，上官凌飛. 葡萄HB基因家族全基因組鑒定及表達(dá)分析[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，45（6）：1126-1139.

LIN Yiling，LIU Zhongjie，WANG Zicheng，YANG Yuxian，WANG Lingyu，ZHANG Chuan，WANG Chen，JIA Haifeng，LU Suwen，F(xiàn)ANG Jinggui，SHANGGUAN Lingfei. Genome-wide identification and expression analysis of HB gene family in Vitis vinifera[J]. Journal of Nanjing Agricultural University，2022，45（6）：1126-1139.

[6] SESSA G，CARABELLI M，SASSI M. The ins and outs of homeodomain-leucine zipper/hormone networks in the regulation of plant development[J]. International Journal of Molecular Sciences，2024，25（11）：5657.

[7] ?Y?A N，BABULA-SKOWRO?SKA D. Evolutionary consequences of functional and regulatory divergence of HD-zip I transcription factors as a source of diversity in protein interaction networks in plants[J]. Journal of Molecular Evolution，2023，91（5）：581-597.

[8] SCHRICK K，AHMAD B，NGUYEN H V. HD-zip Ⅳ transcription factors：Drivers of epidermal cell fate integrate metabolic signals[J]. Current Opinion in Plant Biology，2023，75：102417.

[9] YANG Q Q，CONG T C，YAO Y C，CHENG T R，YUAN C Q，ZHANG Q X. KNOX genes were involved in regulating axillary bud formation of Chrysanthemum × morifolium[J]. International Journal of Molecular Sciences，2023，24（8）：7081.

[10] DAI X F，ZHAI R，LIN J J，WANG Z F，MENG D K，LI M，MAO Y L，GAO B Y，MA H Y，ZHANG B F，SUN Y，LI S，ZHOU C G，LIN Y C J，WANG J P，CHIANG V L，LI W. Cell-type-specific PtrWOX4a and PtrVCS2 form a regulatory nexus with a histone modification system for stem cambium development in Populus trichocarpa[J]. Nature Plants，2023，9（1）：96-111.

[11] 李真，王留強(qiáng)，盧孟柱. 毛白楊PtoWOX11/12a對楊樹扦插苗生長發(fā)育的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)，2017，53（11）：69-76.

LI Zhen，WANG Liuqiang，LU Mengzhu. Effects of PtoWOX11/12a gene from Populus tomentosa on the growth and development of cutting seedlings in poplar[J]. Scientia Silvae Sinicae，2017，53（11）：69-76.

[12] 文爽爽，王留強(qiáng)，盧孟柱. 銀腺楊PagWOX11/12a基因?qū)ηo生長發(fā)育的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2023，36（1）：39-46.

WEN Shuangshuang，WANG Liuqiang，LU Mengzhu. Effects of PagWOX11/12a gene on stem growth and development of Populus alba × P. Glandulosa[J]. Forest Research，2023，36（1）：39-46.

[13] YAN F，GONG Z H，HU G J，MA X S，BAI R Y，YU R N，ZHANG Q，DENG W，LI Z G，WURIYANGHAN H. Tomato SlBL4 plays an important role in fruit pedicel organogenesis and abscission[J]. Horticulture Research，2021，8（1）：78.

[14] ZHAO S，GAO H B，JIA X M，WEI J T，MAO K，MA F W. MdHB-7 regulates water use efficiency in transgenic apple （Malus domestica） under long-term moderate water deficit[J]. Frontiers in Plant Science，2021，12：740492.

[15] BASSO M F，COSTA J A，RIBEIRO T P，ARRAES F B M，LOUREN?O-TESSUTTI I T，MACEDO A F，DAS NEVES M R，NARDELI S M，ARGE L W，PEREZ C E A，SILVA P L R，DE MACEDO L L P，LISEI-DE-SA M E， AMORIM R M S，DE CAMPOS P E R，SILVA M C M，MORGANTE C V，F(xiàn)LOH E I S，ALVES-FERREIRA M，GROSSI-DE-SA M F. Overexpression of the CaHB12 transcription factor in cotton （Gossypium hirsutum） improves drought tolerance[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2021，165：80-93.

[16] ZHANG R X，ZHU W C，CHENG G X，YU Y N，LI Q H，HAQ S U，SAID F，GONG Z H. A novel gene，CaATHB-12，negatively regulates fruit carotenoid content under cold stress in Capsicum annuum[J]. Food amp; Nutrition Research，2020，64：64.

[17] 饒媛媛，王晗瑤. 庫爾勒市香梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀、問題及對策[J]. 山西農(nóng)經(jīng)，2024（14）：192-194.

RAO Yuanyuan，WANG Hanyao. The current status，problems，and strategies of the fragrant pear industry development in Korla city[J]. Shanxi Agricultural Economy，2024（14）：192-194.

[18] 馬建江，陳久紅，黃國輝. 庫爾勒香梨凍害發(fā)生原因及預(yù)防措施[J]. 果樹實(shí)用技術(shù)與信息，2021（6）：28-29.

MA Jianjiang，CHEN Jiuhong，HUANG Guohui. The causes of freeze damage to Pyrus sinkiangensis and preventive measures[J]. Practical Fruit Tree Technology and Information，2021（6）：28-29.

[19] 林彩霞，吳運(yùn)建，魯曉燕，劉艷，王剛. 不同凍害程度對香梨生理指標(biāo)的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：121-123.

LIN Caixia，WU Yunjian，LU Xiaoyan，LIU Yan，WANG Gang. Effect of different freezing injury degree on physiological indexes in fragrant pear[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，2015，43（10）：121-123.

[20] CHAN R L，GAGO G M，PALENA C M，GONZALEZ D H. Homeoboxes in plant development[J]. Biochimica Et Biophysica Acta，1998，1442（1）：1-19.

[21] JAIN M，TYAGI A K，KHURANA J P. Genome-wide identification，classification，evolutionary expansion and expression analyses of homeobox genes in rice[J]. FEBS Journal，2008，275（11）：2845-2861.

[22] 葉明輝，趙朋，牛洋，王冬冬，陳勤. 馬鈴薯同源異形框基因家族的鑒定和表達(dá)分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2021，29（2）：224-239.

YE Minghui，ZHAO Peng，NIU Yang，WANG Dongdong，CHEN Qin. Identification and expression analysis of homeobox gene family in potato （Solanum tuberosum）[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，2021，29（2）：224-239.

[23] XIA W W，WANG S S，LIU X Y，CHEN Y F，LIN C X，LIU R N，LIU H L，LI J，ZHU J B. Chromosome-level genome provides new insight into the overwintering process of Korla pear （Pyrus sinkiangensis Yu）[J]. BMC Plant Biology，2024，24（1）：773.

[24] LI Y D，ZHU Y X，YAO J，ZHANG S L，WANG L，GUO C L，VAN NOCKER S，WANG X P. Genome-wide identification and expression analyses of the homeobox transcription factor family during ovule development in seedless and seeded grapes[J]. Scientific Reports，2017，7（1）：12638.

[25] TAMURA K，STECHER G，KUMAR S. MEGA11：Molecular evolutionary genetics analysis version 11[J]. Molecular Biology and Evolution，2021，38（7）：3022-3027.

[26] XIE J M，CHEN Y R，CAI G J，CAI R L，HU Z，WANG H. Tree visualization by one table （tvBOT）：A web application for visualizing，modifying and annotating phylogenetic trees[J]. Nucleic Acids Research，2023，51（W1）：W587-W592.

[27] CHEN C J，WU Y，LI J W，WANG X，ZENG Z H，XU J，LIU Y L，F(xiàn)ENG J T，CHEN H，HE Y H，XIA R. TBtools-II：A “one for all，all for one” bioinformatics platform for biological big-data mining[J]. Molecular Plant，2023，16（11）：1733-1742.

[28] LESCOT M，DéHAIS P，THIJS G，MARCHAL K，MOREAU Y，VAN DE PEER Y，ROUZé P，ROMBAUTS S. PlantCARE，a database of plant Cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences[J]. Nucleic Acids Research，2002，30（1）：325-327.

[29] QUE F，WANG G L，LI T，WANG Y H，XU Z S，XIONG A S. Genome-wide identification，expansion，and evolution analysis of homeobox genes and their expression profiles during root development in carrot[J]. Functional amp; Integrative Genomics，2018，18（6）：685-700.

[30] KHAN N，HU C M，KHAN W A，WANG W L，KE H，DONG H J，ZHANG Z S，HOU X L. Genome-wide identification，classification，and expression pattern of homeobox gene family in Brassica rapa under various stresses[J]. Scientific Reports，2018，8（1）：16265.

[31] HOU J，SUN Y，WANG L，JIANG Y Z，CHEN N N，TONG S F. Genome-wide analysis of the homeobox gene family and identification of drought-responsive members in Populus trichocarpa[J]. Plants，2021，10（11）：2284.

[32] 趙雙. 蘋果MdHB-7和MdHB7-like在抗旱耐鹽中的功能及其機(jī)制研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2021.

ZHAO Shuang. Study on the function and mechanism of MdHB-7 and MdHB7-like in apple on drought and salt tolerance[D]. Yangling：Northwest A amp; F University，2021.

[33] GAO Y L，MA X L，ZHANG Z X，WANG Y X. Transcription factors and plant hormones mediate wax metabolism in response to drought stress[J]. Physiologia Plantarum，2024，176（4）：e14478.

[34] WEI H，WANG X，WANG K T，TANG X，ZHANG N，SI H J. Transcription factors as molecular switches regulating plant responses to drought stress[J]. Physiologia Plantarum，2024，176（3）：e14366.

[35] DHATTERWAL P，SHARMA N，PRASAD M. Decoding the functionality of plant transcription factors[J]. Journal of Experimental Botany，2024，75（16）：4745-4759.

[36] SINGH R K，MISKOLCZI P，MAURYA J P，BHALERAO R P. A tree ortholog of SHORT VEGETATIVE PHASE floral repressor mediates photoperiodic control of bud dormancy[J]. Current Biology，2019，29（1）：128-133.

[37] ZHU Y Y，SONG D L，XU P，SUN J Y，LI L G. A HD-ZIP III gene，PtrHB4，is required for interfascicular cambium development in Populus[J]. Plant Biotechnology Journal，2018，16（3）：808-817.

[38] 張馨. 過表達(dá)甘藍(lán)型油菜HB7和HB12基因?qū)M南芥生長發(fā)育的影響[D]. 曲阜：曲阜師范大學(xué)，2024.

ZHANG Xin. The impact of overexpressing Brassica napus HB7 and HB12 genes on the growth and development of Arabidopsis thaliana[D]. Qufu：Qufu Normal University，2024.