摘 要：為闡明‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因組密碼子的使用模式，本研究以‘湘辣14號(hào)’（Capsicum annuum cv ‘Xiangla NO.14’）葉綠體基因組52條蛋白編碼基因序列（CDS）為材料，采用Codon W1.4.2等軟件分析‘湘辣14號(hào)’密碼子堿基組成及使用偏好性，并利用中性繪圖、奇偶偏好（PR2-plot）、有效密碼子數(shù)（ENC-plot）分析了影響密碼子偏好性的主要因素，并進(jìn)一步確定其最優(yōu)密碼子。結(jié)果表明，‘湘辣14號(hào)’密碼子GCall平均含量為38.70%，且GC1（47.29%）＞GC2（39.74%）＞GC3（29.05%），ENC介于34.10～54.31之間，平均值為46.69。有29個(gè)密碼子的同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU）＞1，且以A或U結(jié)尾，密碼子第3位堿基偏好使用A/U結(jié)尾。ENC與GC3呈極顯著相關(guān)，而與GCall、GC1、GC2不相關(guān)。繪圖分析表明，自然選擇和突變均對(duì)‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性產(chǎn)生重要影響。共篩選出GCA、GCU、AGA等19個(gè)最優(yōu)密碼子，其中10個(gè)以A結(jié)尾，9個(gè)以U結(jié)尾，說(shuō)明‘湘辣14號(hào)’密碼子第3位堿基偏愛(ài)使用A/U結(jié)尾。本研究為茄科辣椒屬葉綠體基因工程的開(kāi)展提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：‘湘辣14號(hào)’；葉綠體基因組；密碼子偏好性；最優(yōu)密碼子

中圖分類(lèi)號(hào)：S602 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-1038（2025）01-0047-09

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2025.01.008

Analysis of Codon Usage Bias in Chloroplast Genome

of Capsicum annuum cv‘Xiangla NO.14’

HE Daoshan1， YANG Xiaoqiang2， QIN Yalin2， HE Haiyan1， XIE Wei1， LUO Zhiguo1， LI Peng1*

（1. Xiangtan Institute of Agricultural Sciences， Xiangtan 411134， China; 2. Hunan University of Humanities， Science and Technology， College of Agriculture and Biotechnology， Loudi 417000， China）

Abstract： In order to confirm the codon usage pattern of chloroplast genome of Capsicum annuum cv ‘Xiangla NO.14’， the 52 protein coding genes of the chloroplast genome of ‘Xiangla NO.14’ were selected as materials in this work， and base composition and codon usage bias of ‘Xiangla NO.14’ were detected using Codon W1.4.2. The main factors affecting codon preference were analyzed by neutral plot， PR2-plot and ENC-plot， and the optimal codon was further determined. The results indicated that the average ratio of GCall in the ‘Xiangla NO.14’ chloroplast genome was 38.70%， with GC1（47.29%）＞GC2（39.74%）＞GC3（29.05%）. The ENC value varied from 34.10 to 54.31， with an average of 46.69. There were 29 codons with RSCU＞1 and ended with A or U， which revealed that the third base of the codon preferred to end with A/U. ENC was significantly correlated with GC3， but not with GCall， GC1 and GC2. The graphical analysis showed that codon usage bias was affected by natural selection and mutation in the ‘Xiangla NO.14’ chloroplast genome. A total of 19 optimal codons such as GCA， GCU， AGA were screened out， and ten codons ended with A， and nine codons ended with U. The third base of codon preferred to use A/U ending. The findings obtained in this work provided a theoretical basis for the development of chloroplast genetic engineering of Capsicum in Solanaceae.

Keywords： Capsicum annuum cv ‘Xiangla NO.14’; chloroplast genome; codon usage bias; optimal codons

密碼子是生物活動(dòng)中最基本的信息單元，在傳遞遺傳信息過(guò)程中扮演著不可替代的角色[1]。64種密碼子因密碼子簡(jiǎn)并性的存在只編碼20種氨基酸。在核基因組中，除色氨酸（Trp）和甲硫氨酸（Met）外，其他氨基酸均由2～6個(gè)同義密碼子編碼[2-3]。密碼子偏好性是指同一密碼子在不同的基因組或基因中非隨機(jī)的使用現(xiàn)象。密碼子偏好性是特定生物體所特有的，受GC含量、基因表達(dá)水平和基因長(zhǎng)度等因素的影響[4-5]，且會(huì)影響外源基因的表達(dá)效率、信使RNA的合成、蛋白質(zhì)的翻譯速度及折疊等生物學(xué)功能[6-8]?？紤]到不同的密碼子模式具有重要的生物學(xué)效應(yīng)，在特定的基因組或基因中識(shí)別密碼子的使用偏好性對(duì)于闡明生物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律以及利用葉綠體基因組技術(shù)改良物種性狀具有重要的意義[9-10]。

目前，解釋密碼子使用偏好性的最流行且被廣大學(xué)者普遍認(rèn)可的假說(shuō)是突變-選擇平衡，該理論認(rèn)為密碼子的使用反映了三種進(jìn)化力量的綜合效應(yīng)：突變壓力、自然選擇和群體內(nèi)的遺傳漂變[11-13]。研究表明，紫菜薹（Brassica rapa var. purpuraria）葉綠體密碼子偏好使用A/U堿基，主要受突變壓力的影響[14]，自然選擇、堿基突變均對(duì)豇豆（Vigna unguiculata）密碼子的偏好性產(chǎn)生了重要影響[15]；這些研究表明，密碼子偏好性使用模式和其他相關(guān)指標(biāo)為研究不同物種復(fù)雜的進(jìn)化規(guī)律提供了簡(jiǎn)單且直觀的策略。

‘湘辣14號(hào)’（Capsicum annuum cv ‘Xiangla NO.14’）屬茄科（Solanaceae）辣椒屬（Capsicum）一年生植物，是湖南地區(qū)重要的蔬菜和香料作物。‘湘辣14號(hào)’具有皮薄肉脆、果實(shí)細(xì)長(zhǎng)、辣味上佳、味道鮮美等特點(diǎn)，在辣椒市場(chǎng)中具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值都比較高，深受?chē)?guó)內(nèi)外廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。近年來(lái)，‘湘辣14號(hào)’在湖南省栽培面積和產(chǎn)值迅猛發(fā)展，已成為湖南地區(qū)農(nóng)民增收、鄉(xiāng)村振興的重要農(nóng)作物之一。目前，研究者們從種質(zhì)資源[16]、高產(chǎn)高效栽培技術(shù)集成[17]、遺傳育種[18]等方面開(kāi)展了大量的研究，隨著‘湘辣14號(hào)’葉綠體全基因組序列的拼接和組裝的完成，目前尚未對(duì)‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因組密碼子使用偏好性進(jìn)行相關(guān)研究。本研究以‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因組52條蛋白編碼基因序列（coding DNA sequence，CDS）為材料，對(duì)‘湘辣14號(hào)’密碼子堿基組成及使用偏好性進(jìn)行分析，并明確影響‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性的主要因素，從而在‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因組篩選出最優(yōu)密碼子，以期為開(kāi)展‘湘辣14號(hào)’品種鑒定、性狀改良及外源基因的優(yōu)化表達(dá)等方面提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 序列的獲得

根據(jù)‘湘辣14號(hào)’的GenBank登錄號(hào)（OR551752.1）在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載整個(gè)序列，共87條蛋白編碼基因序列（coding DNA sequence，CDS），利用Excel 2016挑選出起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AG、TGA 或TAA的CDS序列，但刪除長(zhǎng)度小于300 bp且重復(fù)的CDS序列，最后共得到52條CDS序列作為本研究密碼子偏好性分析的樣本。

1.2 密碼子使用偏好性及相關(guān)指標(biāo)分析

通過(guò)在線程序CodonW 1.3對(duì)‘湘辣14號(hào)’的同義密碼子相對(duì)使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）、有效密碼子數(shù)（ENC）、總GC含量（GCall）、第3位堿基GC使用頻率（GC3s），以及密碼子第3位各堿基使用頻率（A3s、T3s、C3s和G3s）分別進(jìn)行計(jì)算[19]。RSCU值和ENC值一起被用來(lái)描述‘湘辣14號(hào)’的密碼子使用偏好性。當(dāng)RSCU大于1時(shí)，為‘湘辣14號(hào)’的高頻密碼子且偏好性較強(qiáng)；RSCU等于1，則表明‘湘辣14號(hào)’密碼子無(wú)使用偏向；RSCU小于1，表明密碼子偏好性較弱。采用EMBOSS軟件對(duì)‘湘辣14號(hào)’密碼子的GC1、GC2、GC3和GC 12含量進(jìn)行計(jì)算。

1.3 中性繪圖分析

根據(jù)Wei等[20]的方法，對(duì)‘湘辣14號(hào)’密碼子第3位的GC含量（GC3）進(jìn)行計(jì)算，分別取GC3和GC12為橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)，制作散點(diǎn)圖進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 ENc-plot分析

采用ENC-plot繪圖法分析可以確定影響‘湘辣14號(hào)’密碼子使用偏好性的關(guān)鍵因素。ENC值取值為20～61之間，與密碼子使用偏好性存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。分別采用‘湘辣14號(hào)’的GC3s和有效密碼子ENC作為橫縱坐標(biāo)，制作‘湘辣14號(hào)’的ENc-plot 散點(diǎn)圖，其中有效密碼子ENC的計(jì)算公式為ENC=2+GC3s +29/[GC3s2 +（1-GC3s）2]，并制作其標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)散點(diǎn)越接近ENC標(biāo)準(zhǔn)曲線，則表明堿基突變對(duì)‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性的形成起主導(dǎo)作用，當(dāng)散點(diǎn)處于ENC標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，則表示自然選擇對(duì)‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性的形成起主導(dǎo)作用[21]。

1.5 PR2-plot繪圖分析

利用PR2-plot對(duì)‘湘辣14號(hào)’密碼子的第3位堿基（A、T、C、G）的組成情況進(jìn)行分析。計(jì)算‘湘辣14號(hào)’密碼子第 3位各堿基的比例，以A3/（A3+T3）、G3/（G3+C3） 分別為Y軸、X軸，通過(guò)Matlab R2016a制作PR2-plot散點(diǎn)圖，散點(diǎn)與中心點(diǎn)的距離則表示‘湘辣14號(hào)’密碼子的偏倚程度及方向[22]。

1.6 最優(yōu)密碼子的鑒定

根據(jù)密碼子的RSCU值大小來(lái)確定高頻使用密碼子[23]。以ENC分析作為偏好性標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)52條‘湘辣14號(hào)’CDS序列進(jìn)行排序，選擇5%的高偏向性（ENC值小于30）和低偏向性（ENC值大于55）數(shù)據(jù)集[24]。計(jì)算ΔRSCU=高表達(dá)基因的RSCU-低表達(dá)基因的RSCU，并同時(shí)滿足RSCU＞1且ΔRSCU≥0.08這兩個(gè)條件的密碼子為最優(yōu)密碼子。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子的堿基組成分析

由表1可知，‘湘辣14號(hào)’密碼子的總GC含量（GCall）為38.70%，GC1、GC2、GC3分別為47.29%、39.74%、29.05%，其中GC1含量最高，而GC3含量最低，GC含量在‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因組中分布不平衡，表明‘湘辣14號(hào)’在其密碼子第3位堿基優(yōu)先使用A或T。ENC值介于34.1～54.31之間，平均值為46.69，第3位同義密碼子的GC3s為29.10%，說(shuō)明‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性較弱且不明顯。

由表2可知，GCall與GC1、GC2、GC3三個(gè)指標(biāo)間存在極顯著相關(guān)；GC1分別與GC2和GCall兩個(gè)指標(biāo)間存在極顯著相關(guān)；ENC和GC3存在極顯著相關(guān)，且與GC1和GC2不相關(guān)；揭示GC3在‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性形成過(guò)程中的影響作用大于GC2與GC1。

2.2 相對(duì)同義密碼子使用度分析

由表3可知，在‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因組中共發(fā)現(xiàn)21 055個(gè)密碼子，總編碼20種氨基酸，密碼子數(shù)介于12～879個(gè)，其中密碼子UAG為12個(gè)，編碼異亮氨酸（Ile）的AUU最多，為879個(gè)。RSCU值介于 0.344 4～1.959 6之間，使用頻率最高氨基酸為亮氨酸（Leu），其RSCU值為1.959 6，絲氨酸（Ser）的使用頻率最低，其RSCU值為0.344 4，在‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因組中RSCU＞1的高頻密碼子共有30個(gè)，其中以U、A、G結(jié)尾的密碼子分別為16、13、1個(gè)，表明‘湘辣14號(hào)’偏好使用NNA或NNU的密碼子。此外，蛋氨酸（Met）和色氨酸（Trp）的使用頻率為1，說(shuō)明‘湘辣14號(hào)’的AUG和UGG密碼子不表現(xiàn)出偏好性。

2.3 中性繪圖分析

中性繪圖（圖1）分析說(shuō)明，‘湘辣14號(hào)’GC12和GC3之間的相關(guān)關(guān)系，量化自然選擇、突變與‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性形成的關(guān)系。GC3取值介于18.52%～37.39%之間，GC12取值為31.76%～57.86%，‘湘辣14號(hào)’基因全部落在對(duì)角線之上，回歸系數(shù)為0.060 8，r2為0.018，GC3與GC12并不存在顯著相關(guān)性，說(shuō)明影響‘湘辣14號(hào)’偏好性形成的主導(dǎo)因素為自然選擇，但突變?cè)谝欢ǔ潭壬嫌绊憽胬?4號(hào)’密碼子的使用偏好性。

2.4 ENC-plot繪圖分析

ENC-plot繪圖分析結(jié)果顯示（見(jiàn)圖2），少數(shù)幾個(gè)‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線上方，只有少數(shù)基因處于ENC標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，說(shuō)明自然選擇和突變都對(duì)‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性的形成產(chǎn)生影響。位于標(biāo)準(zhǔn)曲線下方的基因數(shù)量較多且相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明自然選擇主導(dǎo)了‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性的形成。ENC比值頻數(shù)分析說(shuō)明，共有13個(gè)基因與ENC預(yù)期值（-0.05～0.05）相符，有39個(gè)基因與ENC預(yù)期值差距較大（表4），說(shuō)明在‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因組中只有少數(shù)基因的ENC期望值與預(yù)期值相符。

2.5 PR2-plot繪圖分析

分析A、T、C、G堿基的使用頻率有助于闡明‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性（見(jiàn)圖3）。其中大多數(shù)基因分布于平面圖的下半方，其中右下方最多，其次是左下方，再其次是右上方，最后是左上方，說(shuō)明4種堿基的使用頻率為T(mén)＞A、G＞C，這說(shuō)明‘湘辣14號(hào)’密碼子的偏好性受多種因素影響，包括堿基突變、自然選擇等。

2.6 最優(yōu)密碼子的確定

在‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因組中有24個(gè)高頻密碼子（ΔRSCU≥0.08），9個(gè)高頻密碼子以U結(jié)尾，2個(gè)高頻密碼子以G結(jié)尾，按照RSCU值＞1 且ΔRSCU≥0.08條件，共在‘湘辣14號(hào)’中確定19個(gè)最優(yōu)密碼子，分別為GCA、GCU、AGA、CGA、UGU、CAA、GAA、GGU、AUU、CUA、CUU、AAA、CCA、CCU、UCU、ACA、ACU、GUA、GUU（表5），這些最優(yōu)密碼子全部以堿基A或U結(jié)尾。

3 結(jié)論與討論

密碼子偏好性分析是研究原核生物和真核生物進(jìn)化特征的有效手段[25]。大量研究表明，多種因素都對(duì)密碼子偏好性有影響，如基因片段大小、基因表達(dá)豐度、tRNA豐度等[26]。研究顯示，影響密碼子偏好性最主要的原因是堿基突變和自然選擇，被廣泛應(yīng)用于闡述物種密碼子使用的偏好性[27]。堿基組成和自然選擇對(duì)植物進(jìn)化過(guò)程中的密碼子偏好性形成有重要的影響。本研究在‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因組中，GC3與GCall和ENC呈極顯著相關(guān)，與GC1和GC2不相關(guān)，說(shuō)明自然選擇對(duì)‘湘辣14號(hào)’密碼子使用偏好性的形成起主導(dǎo)作用。

葉綠體密碼子的堿基組成對(duì)生物的進(jìn)化歷程有著重要的影響。本研究發(fā)現(xiàn)‘湘辣14號(hào)’總GC含量（GCall）為38.70%，GC1為47.29%，GC2為39.74%，GC3為29.05%，GC3與GCall和ENC三者之間具有極顯著相關(guān)，而與GC1和GC2三者之間不存在相關(guān)性，表明‘湘辣14號(hào)’密碼子的使用偏好性為NNU/NNA，這與同科植物番茄（Solanum lycopersicum L.）[28]、辣椒屬等密碼子的使用模式相似[29]?！胬?4號(hào)’共得到30個(gè)高頻密碼子（RSCU值gt;1），其中有29個(gè)以堿基A或U結(jié)尾，再次驗(yàn)證‘湘辣14號(hào)’偏好使用NNU/NNA類(lèi)型的密碼子。

本研究發(fā)現(xiàn)‘湘辣14號(hào)’密碼子的ENC平均值為46.69，且高于45，35個(gè)CDS的ENC＞45，揭示這些CDS密碼子的使用偏好性較弱。對(duì)‘湘辣14號(hào)’密碼子的中性繪圖分析表明，葉綠體基因全部位于標(biāo)準(zhǔn)曲線之上，且GC3與GC1和GC2中的A、T、C、G組成差異較大，GC12含量明顯高于GC3，進(jìn)一步表明‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性的主要影響因素為自然選擇，這與黃荊坪竹根椒（C. annuu L. cv HuangJingping）[30]、梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）[31]的結(jié)果相符。ENC-plot分析表明，自然選擇比突變更加影響‘湘辣14號(hào)’密碼子偏好性，該結(jié)果與葉琦等[32]對(duì)迎春櫻桃（Prunus discoidea）、與胡曉艷等[33]對(duì)酸棗（Ziziphus jujuba var．spinosa）的研究結(jié)果相一致。影響紫花苜蓿（Medicago sativa）[34]密碼子偏好性形成的主要原因則是突變。在芒果（Mangifera indicate L.）[35]密碼子偏好性形成中突變和選擇起同等重要作用。這些結(jié)果揭示了影響不同植物密碼子的使用偏好性因素可能有所不同。

在‘湘辣14號(hào)’葉綠體基因組中共確定GCA、GCU、AGA等19個(gè)最優(yōu)密碼子，這些最優(yōu)密碼子全部以堿基A或U結(jié)尾，進(jìn)一步證實(shí)了‘湘辣14號(hào)’密碼子偏向使用NNA或 NNU模式，其使用模式與黃荊坪竹根椒[30]、牛茄子（Solanum capsicoides）[36]、黃果枸杞（Lycium ruthenicum）[37]等植物密碼子使用模式一致。同時(shí)，‘湘辣14號(hào)’密碼子第3位的高AU含量可能是造成這種使用模式的原因之一。在設(shè)計(jì)‘湘辣14號(hào)’外源基因時(shí)，優(yōu)先考慮A或U結(jié)尾的最優(yōu)密碼子，可在一定程度上提高‘湘辣14號(hào)’外源基因表達(dá)效率，從而為‘湘辣14號(hào)’的性狀改良及進(jìn)化規(guī)律的研究提供理論支撐。

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