摘要：蠟樣芽孢桿菌是革蘭氏陽性桿菌，且能產(chǎn)芽孢，是一種食源性條件致病菌，誤食蠟樣芽孢桿菌超標的乳制品、糕點、腐乳、發(fā)酵食品等會引起食物中毒。準確、快速、高效地檢測蠟樣芽孢桿菌對預防蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒具有重要意義。本文以蠟樣芽孢桿菌為研究對象，對其檢測方法進行了概括總結，說明不同檢測方法的優(yōu)缺點，為快速檢測鑒定該菌提供一定的參考。關鍵詞：蠟樣芽孢桿菌；食源性；條件致病菌

中圖分類號：S852.6文獻標志碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1674-4977.2025.01.057

基金項目：遼寧省聯(lián)合基金項目面上資助計劃項目（2023-MSLH-086）：基于MALDI-TOFMS技術建立豆制品中蠟樣芽孢桿菌快速檢測平臺。

1蠟樣芽孢桿菌的危害

蠟樣芽孢桿菌在飼料、食品、土壤中廣泛存在，是一種革蘭氏陽性條件致病菌，其產(chǎn)生的內(nèi)生孢子可抵抗外界不良環(huán)境，可抵抗高溫、高壓、酸、堿等不利因素[1]。蠟樣芽孢桿菌根據(jù)致病性分為產(chǎn)毒株和不產(chǎn)毒株，產(chǎn)毒株產(chǎn)生的腹瀉毒素和嘔吐毒素對人們健康和食品安全造成巨大威脅。

2010—2019年全國細菌性食物中毒事件蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件占總數(shù)的11.89%（132/ 1110），僅次于非傷寒沙門氏菌和副溶血型弧菌，處于第3位[2]。2020—2022年泰州市500份預包裝糕點中97份檢出蠟樣芽孢桿菌，檢出率為19.4%[3]。攜帶毒力基因3種以上的菌株達100%，其中22株攜帶10種以上毒力基因，具有較大的安全隱患。產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌共檢出5株，其中4株攜帶3種毒力基因，1株攜帶1種毒力基因，說明僅針對1種嘔吐毒素毒力基因檢測會產(chǎn)生嘔吐型蠟樣芽孢桿菌假陽性的現(xiàn)象。2022年山東濟寧對轄區(qū)內(nèi)90份樣品進行蠟樣芽孢桿菌監(jiān)測，結果檢出率為24.44%，其中外賣送餐蠟樣芽孢桿菌檢出率最高，達46.67%[4]?；窗彩谐槿?18批嬰幼兒食品定量檢測蠟樣芽孢桿菌，39批次檢出蠟樣芽孢桿菌，檢出率為17.89%[5]。毒力基因檢測結果顯示分離的蠟樣芽孢桿菌100%攜帶1種或1種以上毒力基因，但未檢出ces嘔吐毒素毒力基因。檢測結果說明，嬰幼兒食品受蠟樣芽孢桿菌污染情況不容樂觀，需引起相關部門重視。由此可見，準確、快速、高效地檢測蠟樣芽孢桿菌對預防蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒具有重要意義。本文以蠟樣芽孢桿菌為研究對象，對其檢測方法進行了概括總結，說明不同檢測方法的優(yōu)缺點，為快速檢測鑒定該菌提供一定的參考，為食品安全監(jiān)督管理提供支持。

2免疫磁珠法

平陽等[6]研發(fā)了一種快速分離熟制食品中蠟樣芽孢桿菌的免疫磁珠法。采用兔抗蠟樣芽孢桿菌抗體和免疫磁珠相結合，同時用蠟樣芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、阪崎腸桿菌對炒青菜、雞絲花菜、紅燒肉、鹵鴨肉等樣品進行人工污染，分別取樣品25 g加入225 mL稀釋液中充分混勻，加入免疫磁珠在37℃充分振蕩吸附15 min后檢測，其靈敏度限值為4×10-7CFU/mL，在食品基質(zhì)中捕獲率可達62%，該方法可特異性檢測蠟樣芽孢桿菌，排除其他致病菌對蠟樣芽孢桿菌檢測的干擾。

3分子生物學法

3.1熒光定量PCR法

楊建等[7]建立了一個熒光定量PCR法，檢測乳制品中蠟樣芽孢桿菌，通過對蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌檢測，特異性良好無交叉反應，蠟樣芽孢桿菌最低檢出限為1×10-7ng/μL，將蠟樣芽孢桿菌添加至牛奶樣品中，10.4 CFU/mL的蠟樣芽孢桿菌即可檢出。馬琳琳等[8]提出一種以gyrB作為基因檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的方法，該方法對蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌特異性良好，靈敏度可達0.01 mg/L，活菌檢出限為8.9×10-2CFU/mL。楊滴等[9]根據(jù)蠟樣芽孢桿菌腸毒素基因片段序列設計引物和探針，建立實時熒光PCR法檢測蠟樣芽孢桿菌。對蠟樣芽孢桿菌標準菌株及含有蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌在內(nèi)的20種菌株進行實驗，結果顯示特異性良好，無假陽性或假陰性現(xiàn)象，靈敏度高，檢測低限可達1×103CFU/mL。

3.2多重PCR法

劉秀峰等[10]建立多重PCR方法對蠟樣芽孢桿菌進行分型。根據(jù)蠟樣芽孢桿菌的hbl A、hbl C、nhe A、nhe B、bce、cyt K和cer基因設計引物，對120株蠟樣芽孢桿菌進行毒力基因檢測，結果顯示攜帶嘔吐毒素毒力基因的蠟樣芽孢桿菌占96.66%（116/120）。姜菲菲等[11]以nhe、cyt K和ent FM這3種毒素基因作為標志物，建立一種多重PCR快速檢測蠟樣芽孢桿菌。該方法可快速檢測蠟樣芽孢桿菌，對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌具有特異性，且3種引物在同一反應體系中無干擾，最低檢出限可達0.1 mg/L，具有高靈敏度。

3.3環(huán)介導等溫擴增法

周巍等[12]根據(jù)蠟樣芽孢桿菌hbl A基因的特異性建立一種環(huán)介導恒溫擴增技術檢測發(fā)酵乳中的蠟樣芽孢桿菌。將人工污染蠟樣芽孢桿菌的發(fā)酵乳接種至營養(yǎng)肉湯中，在36℃±1℃條件下培養(yǎng)20 h后提取蠟樣芽孢桿菌的DNA，采用建立的LAMP法進行檢測，同時以巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、福氏志賀氏菌、腸炎沙門氏菌的基因組DNA為模板進行擴增，均無擴增產(chǎn)物，說明該方法可特異性檢測蠟樣芽孢桿菌。該方法以發(fā)酵乳為基質(zhì)菌量在2.1×102 CFU/mL時即可被檢出。唐瓔等[13]采用雙層膜富集法提取樣品中的目標菌，磁珠法對目標菌DNA進行純化提取，將微流控芯片與LAMP反應相結合快速檢測蠟樣芽孢桿菌，該方法檢測限為10 CFU/mL。采用此法對蘇云金芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157∶H7、蕈狀芽孢桿菌等進行檢測結果均為陰性，說明其具有較強的特異性。

3.4基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法（MAL？ DI-TOF MS）

Minling Chen等[14]用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜儀（Microflex LT/SH smart MALDI-TOF MS）對蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌進行鑒定，篩選出4組特異峰，蠟樣芽孢桿菌的物種特異性峰為3211、6427、9188和9214 m/z，蘇云金芽孢桿菌的物種特異性峰為3218、6441、9160和9229 m/z。上述特異峰均代表核糖體蛋白，這些蛋白是保守的，與蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關系一致。Krzysztof F等[15]使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）分析了152個菌株（其中包括57個炭疽芽孢桿菌、49個蠟樣芽孢桿菌、27個蘇云金芽孢桿菌、18個魏德曼芽孢桿菌和1個魏氏芽孢桿菌等）檢測特定生物標志物。使用主成分分析（PCA）對每個芽孢桿菌屬物種質(zhì)譜圖進行分組，以確定蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖的一般差異，PCA分析揭示了7個不同的集群。發(fā)現(xiàn)炭疽芽孢桿菌特異性離子峰為3339、3592、4871、9740 m/z；蘇云金芽孢桿菌特異性離子峰為2956、2968、3411 m/z，魏氏芽孢桿菌特異性離子峰為4637、7324、9272 m/z。

4討論

國標方法檢測蠟樣芽孢桿菌檢驗周期較長，檢驗過程耗時費力，對人員要求高。免疫磁珠吸附法具有特異性強，靈敏度高的特點，可縮短檢測周期，所用儀器設備均為實驗室常用設備，但尚不能實現(xiàn)對目標菌的實時檢測。熒光定量PCR實驗室已普遍配置，檢測周期短，但蠟樣芽孢桿菌分為產(chǎn)毒株和不產(chǎn)毒株，產(chǎn)毒株又分為產(chǎn)腹瀉毒素和產(chǎn)嘔吐毒素，所以蠟樣芽孢桿菌擁有多個毒力基因，若僅檢測其中某個毒力基因則有漏檢和假陰性的情況出現(xiàn)。多重PCR可對多個目標基因同時進行檢測，但引物設計難度大，既要防止交叉反應，又要優(yōu)化實驗條件，否則易造成假陽性。LAMP法適于快速檢測，設計引物時要強調(diào)特異性，關注其有無特異性擴增，操作時應注意氣溶膠的產(chǎn)生，避免由氣溶膠引起的結果異常。近年來基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MAL？ DI-TOF MS）作為一種新興的以蛋白質(zhì)指紋圖譜為考察對象的鑒定方式，具有通量高，周期短等特點，前期儀器設備投入較大，限制其發(fā)展，但后續(xù)使用成本低于以上各種方法。每種檢測方法優(yōu)缺點不一，應從實際出發(fā)，發(fā)揮各種檢測方法的長處，以便充分利用它們的優(yōu)勢。

參考文獻

[1]孟慶磊，張玉良，趙東輝，等.蠟樣芽孢桿菌分型方法的研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2022，38（29）：61-66.

[2]胡金宇，王銳.2010—2019年全國細菌性食物中毒事件流行病學特征分析[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2023，35（8）：1225-1230.

[3]王萍，陳琳，喬勇升，等.2020—2022年泰州市售預包裝糕點中蠟樣芽孢桿菌毒力基因及耐藥性[J].衛(wèi)生研究，2024，53（1）：55-59.

[4]孔政，韓淑琪，丁一，等.2022年山東省濟寧市食品中蠟樣芽孢桿菌分布及其分子特征分析[J].預防醫(yī)學論壇，2023，29（7）：502-506.

[5]杭婧，宋呈文，金華，等.淮安市218批嬰幼兒食品中蠟樣芽胞桿菌毒力基因檢測和耐藥性分析[J].食品與藥品，2024，26（1）：77-82.

[6]平洋，譚靜，王曉瑞，等.免疫磁珠技術分離檢測熟制食品中的蠟樣芽孢桿菌[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2019，10（20）：6963-6967.

[7]楊健，侯婷婷，佐兆杭，等.牛乳中蠟樣芽孢桿菌熒光定量PCR檢測方法的建立及驗證[J].中國生物制品學雜志，2019，32（3）：324-327，332.

[8]馬琳琳，劉珍，馬騰州，等.實時熒光PCR技術快速檢測食品中的蠟樣芽孢桿菌[J].理化檢驗-化學分冊，2022，58（12）：1461-1465.

[9]楊滴，趙宇明，秦鵬鈞，等.肉制品中蠟樣芽胞桿菌實時熒光PCR檢測方法的研究[J].肉類工業(yè)，2017（6）：49-52.

[10]劉秀峰，潘潔茹，林萍.應用多重PCR技術檢測120株蠟樣芽胞桿菌毒力基因[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2018，45（21）：3972-3976.

[11]姜菲菲，李昊宇，賈慧建，等.基于多重PCR技術檢測蠟樣芽胞桿菌3種毒素基因方法的建立及評價[J].吉林大學學報（醫(yī)學版），2022，48（5）：1223-1228.

[12]周巍，張薇，劉亮，等.環(huán)介導等溫擴增技術檢測酸乳中蠟樣芽孢桿菌[J].乳業(yè)科學與技術，2013，36（5）：29-31.

[13]唐瓔，周春紅，楊曉楠，等.基于雙富集微流控技術的食品中蠟樣芽孢桿菌快速檢測[J].中國測試，2023，49（11）：53-59，90.

[14] MINLIN C，XIANHU W，JUNHUI Z，et al.Differentiation of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Using GenomeGuided MALDI-TOF MS Based on Variations in Ribosomal Proteins[J].Microorganisms，2022，10（5）：918.

[15] MANZULLI V，RONDINONE V，BUCHICCHIO A，et al. Discrimination of Bacillus cereus group members by MALDI-TOF mass spectrometry[J].Microorganisms，2021，9（6）：1202-1216.

作者簡介

種婷，女，1982年出生，高級工程師，碩士，研究方向為食品中致病微生物檢驗。

（編輯：于淼，收稿日期：2024-03-23）