摘要：" 以刺五加腋芽為材料，研究了壓切培養(yǎng)技術對試管苗增殖的作用，篩選出增殖培養(yǎng)基配方：MS+KT1.0 mg/L+6-BA1.5 mg/L+NAA0.2 mg/L。結合此技術誘導試管苗分化，增殖倍數(shù)達4.0倍，可使新分化的芽苗快速進入自主生長，葉片展開，生長勢強，有利于培養(yǎng)試管壯苗，為生根培養(yǎng)奠定基礎。

關鍵詞：" 刺五加；" 壓切技術；" 增殖培養(yǎng)

中圖分類號：" "S 567. 1 + 90. 43" " " " " " " "文獻標識碼：" "A" " " " " " " " 文章編號：１００1 － 9499（２０25）01 － 0013 － 04

Effect of Pressure-cutting Culture on Differentiation andProliferation in Stem Tips of Acanthopanax senticosus

TIAN Xinhua GUO Qi WANG Fude LI Yanxia**

（Forestry Research Institute of Heilongjiang Province，" Heilongjiang Harbin 150081）

Abstract In order to clarify the effect of pressure-cutting culture on the proliferation of tube seedlings， we used axillary buds of Acanthopanax senticosus as the study material and screened the proliferation medium： MS+KT1.0 mg/L+6-BA1.5 mg/L+NAA0.2 mg/L. We found that a 4-fold increase in stem tip proliferation of tube seedlings， and led to a rapid growth of newly differentiated axillary buds， leaf unfolding and vigorous growth. This study facilitates the optimization of tube seedlings and provides a basis for rooting culture.

Key words Acanthopanax senticosus; pressure-cutting culture; proliferation culture

刺五加（Acanthopanax senticosus）為五加科，多年生落葉灌木，主要分布在中國東北、華北、陜西及俄羅斯和朝鮮等地[ 1 ] 。刺五加的根、根莖、根皮均可入藥，具有益氣健脾、補腎安神、抗腫瘤、增強機體免疫力的功效[ 2 - 4 ]，是極其珍貴的藥物資源。刺五加的嫩芽可以作為蔬菜、茶葉，因其含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油等特殊成分，營養(yǎng)價值也非常髙[ 5 - 7 ]。

刺五加種子質量差，存在嚴重的生理后熟[ 8 ]，經(jīng)處理后萌發(fā)率仍低于30%[ 9 ]。刺五加組培過程一直存在微體生長速度慢、分化增殖困難，苗木不生根等技術難題，組織培養(yǎng)技術體系尚不成熟，嚴重制約了刺五加良種化進程。因此，本試驗通過對刺五加優(yōu)良單株展開研究，采用原創(chuàng)壓切培養(yǎng)方法，結合激素種類和濃度的篩選，攻克微體培養(yǎng)過程中的技術難關，提高苗木存活率，培育出試管壯苗，促進苗木生根，建立完善的組培體系，從而推動優(yōu)良品種的推廣與應用。

1 試驗材料與方法

1. 1 供試材料預處理

2月初采集伊春市金山屯林場的刺五加優(yōu)良單株休眠枝條為供試材料，用清水反復沖洗，然后置于有光照的室內，溫度控制在20～25 ℃，待休眠芽開始萌動即可利用。

1. 2 外植體的滅菌處理

待腋芽萌發(fā)后，剪取長約1.0 cm的單芽莖段，用軟毛牙刷刷洗帶刺莖段，放入燒杯中上面覆蓋紗布，流水沖洗2 h。在超凈工作臺上進行不同滅菌處理：

（1）2% NaClO浸泡4 min，用無菌水沖洗3次；

（2）75% 酒精浸泡30s，0.1% HgCI2浸泡2min，然后用無菌水沖洗3次；

（3）紫外線直射5 min，0.1% HgCI2浸泡4 min，然后無菌水浸泡30 min；

（4）0.1% HgCI2浸泡6 min，然后無菌水浸泡30 min。

以上材料滅菌后取出，用無菌濾紙吸干材料表面多余水分。每組處理8個腋芽，重復2次，7 d后觀察效果。

1. 3 誘導側芽生長

在超凈工作臺的無菌環(huán)境下，將帶芽的莖段接種于MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+30 g/L蔗糖 +瓊脂粉6 g/L培養(yǎng)基上（pH值調至5.8～6.0），誘導芽苗生長。

1. 4 壓切培養(yǎng)與試管苗分化增殖

待腋芽伸長、葉片展開后，轉接于以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度激素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)（表1），培養(yǎng)基中添加蔗糖30g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6 g/L。采用L9（34）正交試驗設計表進行試管苗增殖培養(yǎng)基篩選。每個處理接種10瓶，重復2次，無菌條件下結合壓切技術培養(yǎng)試管苗，40 d后調查苗木的長勢及分化情況。

1. 5 培養(yǎng)條件與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

培養(yǎng)溫度控制在（24±2）℃，光照強度2 000 Lux，光照時長12 h/d。采用dps19.05統(tǒng)計軟件進行方差分析和差異顯著性測驗（LSD法）[ 11 ]。

2 結果與分析

2. 1 不同滅菌處理的效果

獲得無菌材料是組織培養(yǎng)過程的重要初始環(huán)節(jié)，要求選用的滅菌方法在保證對外植體損傷、褐化最小的前提下，降低污染率。由表2可見，處理1滅菌不充分，污染率較高（43.75%）；處理4滅菌過度，盡管污染率較低，但苗木損傷嚴重，大量褐化，嚴重影響外植體生長，甚至導致外植體死亡；處理3污染率為18.75%，褐化率25.00%，其他外植體均表現(xiàn)正常，是較適宜的滅菌方法。

2. 2 誘導側芽生長

將獲得的無菌外植體轉接入MS+KT 1.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.4 mg/L培養(yǎng)基上誘導培養(yǎng)10 d左右開始萌動，經(jīng)一周培養(yǎng)葉片展開，培養(yǎng)30 d后新生出葉片4～5片，葉片展開，葉色新綠，但主莖生長緩慢。在培養(yǎng)過程中每培養(yǎng)一周時間就轉接入新的培養(yǎng)基中，這種方法可減少褐化的產(chǎn)生。

2. 3 壓切技術在試管苗分化增殖培養(yǎng)中的應用

2. 3. 1 植物壓切培養(yǎng)技術

壓切培養(yǎng)技術是經(jīng)長期試驗摸索總結出來的一種試驗操作技術，該技術適用于無主莖或主莖生長緩慢，增殖困難，分化苗弱、成苗率低的植物。利用此項技術，在保證新分化出的幼苗獲得足夠營養(yǎng)的同時，又為其獨立生存創(chuàng)造條件，從而有利于提高分化苗的存活率，有利于培育出健壯試管苗，為生根培養(yǎng)奠定物質基礎。

2. 3. 2 結合壓切培養(yǎng)技術篩選增殖培養(yǎng)基

將經(jīng)誘導培養(yǎng)的基礎苗分別轉入不同增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后，待有分化苗產(chǎn)生后，在超凈工作臺無菌條件下，利用鑷子整體夾出，采用壓切方法部分切割，給分化苗基部造成傷口，然后整體轉接入相同處理的新培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)20 d后，觀察到傷口處慢慢長出白色營養(yǎng)瘤，新分化出的小苗葉片展開，葉色轉綠，生長勢強于未經(jīng)壓切培養(yǎng)處理的分化苗。然后將分化苗徹底分離，獨立培養(yǎng)，獲得健壯的試管苗。試驗結果經(jīng)極差分析（表3），從各因素對苗木性狀影響的極差結果反應：對于試管苗有效葉片數(shù)性狀而言，A因素極差5.15，B因素2.00；C因素1.82；D因素1.97；對于增殖倍數(shù)而言，A因素極差1.43，B因素0.75；C因素0.38，D因素0.27；即無論從有效葉片數(shù)還是分化增殖情況來講，KT（A）都是決定苗木生長分化的重要因素。從各因素對苗木性狀影響的均值結果反應： 對于試管苗有效葉片數(shù)性狀而言，A因素的均值K2＞K3＞K1，B因素K3＞K2＞K1；C因素K3＞K1＞K2；D因素K2＞K1＞K3；對于增殖倍數(shù)而言，A因素的均值K3＞K2＞K1，B因素K3＞K2＞K1；C因素K1＞K3＞K2，D因素K2＞K1＞K3，即對苗木生長狀況影響最大的因素A（KT），其次是B因素（6-BA），并且分化數(shù)隨著他們濃度升高而增加。但在試驗中苗木還有其他反應：即隨他們濃度增高，主莖生長會更慢，易形成叢生苗，葉片小，色淡，分化苗不易分割，分離往往造成苗木損失。方差分析結果（表4）表明，各因素間差異極顯著（p＜0.01）。按F值大小分析，影響苗木有效葉片數(shù)、分化增殖的主要因素仍是KT。按照植株上部生長情況的多重比較結果顯示（表5），以處理6培養(yǎng)的試管苗分化增殖苗數(shù)較多，葉片展開，有效葉片數(shù)也較多，便于壓切培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中苗木損失少，且與其他處理差異顯著。因此，選擇培養(yǎng)基（即處理6）MS+KT 1.0 mg/L+6-BA 1.5" mg/L+NAA 0.2 mg/L為刺五加的分化增殖培養(yǎng)基，分化苗數(shù)較多，葉色深綠，頂芽新綠，植株生長健壯。

2. 3. 3 壓切培養(yǎng)對苗木生長的作用

將經(jīng)壓切技術與增殖培養(yǎng)（處理6）相結合培養(yǎng)的苗木與直接分化培養(yǎng)的苗木進行對比：結合培養(yǎng)出來的分化苗頂芽新綠，下部葉色深綠，葉片展開，主莖較粗，分離母體后可快速吸收營養(yǎng)，啟動自主生長能力強，存活率比直接切離母體的試管苗提高20%左右。

3 討 論

3. 1 刺五加屬于藥食兼用植物，一般長梗刺五加用作藥用，短梗刺五加做為蔬菜。從基礎苗木培養(yǎng)方面看，菜用品種更易培養(yǎng)，生長分化速度也較快；藥用品種則需要較長時間的前期積累，因品種不同無菌苗可能需要2個月左右的預培養(yǎng)，才能轉接入分化增殖培養(yǎng)階段。

3. 2 在植物組織培養(yǎng)中易出現(xiàn)外植體或培養(yǎng)物褐化現(xiàn)象，這主要是切割外植體使植物受到創(chuàng)傷刺激，細胞內的酚類物質流出，被氧化為褐色的醌類物質，產(chǎn)生褐變現(xiàn)象，導致植物生長受阻，甚至死亡，又稱之為酚污染現(xiàn)象[ 10 ]。目前可以通過不同的處理方法抑制外植體褐變：加入抗氧化劑、吸附劑、改變滲透壓[ 12 ]或低溫處理[ 13 ]等，但不同物種抑制褐變的方法也不盡相同，應結合植物的具體生長情況選擇適宜的方法。本試驗在初代培養(yǎng)時通過不斷轉換培養(yǎng)基減少褐變，效果較好。

3. 3 刺五加屬于不易打破自身生物調控的植物，先要獲得理想的培養(yǎng)結果，應結合生長季進行。壓切培養(yǎng)是一種新型培養(yǎng)技術，適用于無主莖或主莖生長緩慢、不易伸長的植物。通過與其他培養(yǎng)方法結合，可以大大減低苗木死亡，有效提高分化苗存活率。

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