摘要：為明確2020年以來(lái)在福州市郊區(qū)種植無(wú)花果上新發(fā)生的細(xì)菌性葉斑病的病因，在果園內(nèi)采集病樣進(jìn)行病原菌分離純化，利用煙草過(guò)敏性反應(yīng)測(cè)定、噴霧接種無(wú)花果葉片以及柯赫氏法則驗(yàn)證，明確其致病性；通過(guò)對(duì)病原菌的形態(tài)特征觀察、生理生化測(cè)定，結(jié)合16S rDNA、gyrB 和rpoD 基因序列分析，確定病原菌的分類(lèi)地位。結(jié)果表明，從病樣中分離純化獲得10株細(xì)菌菌株；煙草過(guò)敏性反應(yīng)陽(yáng)性；人工接種結(jié)果顯示，供試細(xì)菌可侵染健康的無(wú)花果葉片，并產(chǎn)生與田間相似的癥狀，且重新分離到與原菌落形態(tài)相同的細(xì)菌，柯赫氏法則證明這些菌株為該病害的病原菌。該病菌在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，菌落為淡黃色、圓形、扁平；菌體形狀為短桿狀，革蘭氏染色陰性；病菌在KB培養(yǎng)基上能產(chǎn)生綠色水溶性熒光色素；供試菌株的16S rDNA、gyrB 和rpoD 基因序列分析結(jié)果顯示，供試菌株與菊苣假單胞菌（Pseudomonas cichorii）聚為一支；其生理生化和Biolog表型測(cè)定結(jié)果以及菊苣假單胞菌特異性引物檢測(cè)結(jié)果均與菊苣假單胞菌的模式菌株5707一致。因此將該致病菌鑒定為菊苣假單胞菌（P. cichorii）。這是首次發(fā)現(xiàn)菊苣假單胞菌在自然狀態(tài)下侵染無(wú)花果并引起葉斑病。

關(guān)鍵詞：無(wú)花果細(xì)菌性葉斑??；病原菌鑒定；菊苣假單胞菌；管家基因

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0546

中圖分類(lèi)號(hào)：S663.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008?0864（2025）01?0147?08

無(wú)花果屬于?？疲∕oraceae）榕屬（Ficus L.），全株都具有較高的利用價(jià)值，種植歷史悠久，在我國(guó)廣東、四川、福建等地區(qū)均有種植[1]。據(jù)報(bào)道，無(wú)花果病害主要有無(wú)花果疫病（Phytophthorapalmivora）[2]、炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）[3?4]、細(xì)菌性葉斑?。≒seudomonas syringae pv. syringae）[5]和病毒?。‵ig mosaic virus，F(xiàn)MV； Fig badnavirus 1，F(xiàn)BV-1； Fig fleck-associated virus，F(xiàn)Fka V）[6?7]等。2020年在福建省福州市郊區(qū)種植的無(wú)花果上新發(fā)生了一種葉斑病，目前，該病發(fā)生較嚴(yán)重。新發(fā)病害主要發(fā)生在葉片和莖稈上，初期呈水浸狀，隨后病斑褐變，嚴(yán)重時(shí)連成一片，最后葉片枯死，田間株發(fā)病率達(dá)50%以上，個(gè)別果園的發(fā)病率高達(dá)100%，給當(dāng)?shù)毓r(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。切取病組織鏡檢，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到噴菌現(xiàn)象，初步診斷該病是由細(xì)菌引起，從該病害的田間癥狀來(lái)看，與?arko等[5]報(bào)道的由丁香假單胞菌（P. syringae）引起的無(wú)花果葉斑病的癥狀相似，因此疑似該病害的病原菌為丁香假單胞菌。但對(duì)采集的病害標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌分離后發(fā)現(xiàn)，分離細(xì)菌的菌落形態(tài)、顏色等與丁香假單胞菌略有差異。為明確該病害的病因，本研究進(jìn)一步對(duì)病原菌進(jìn)行煙草過(guò)敏性反應(yīng)、噴霧接種無(wú)花果葉片以及柯赫氏法則驗(yàn)證，明確其致病性；通過(guò)對(duì)病原菌的形態(tài)特征觀察、生理生化測(cè)定，結(jié)合16S rDNA、gyrB 和rpoD 基因的序列分析，確定病原菌的分類(lèi)地位，為無(wú)花果細(xì)菌性葉斑病的機(jī)理研究及防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

菊苣假單胞（P. cichorii）5707和Pc-GD-1菌株分別由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所趙廷昌研究員和廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所佘小漫研究員惠贈(zèng)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrientagar medium，NA）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrientbroth medium，NB）、金氏B 培養(yǎng)基（King’s Bmedium， KB）、蔗糖還原培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基、碳素化合物基本培養(yǎng)基的配方均參照方中達(dá)[8]的方法，121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病樣的采集及病原菌的分離純化

從福州市郊區(qū)無(wú)花果果園中采集疑似無(wú)花果細(xì)菌性病害的樣品，用平板劃線分離法[8]進(jìn)行分離純化。

1.2.2 細(xì)菌的培養(yǎng)

將純化的菌株接種到NA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落接種至NB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r·min?1振蕩培養(yǎng)24 h后獲得細(xì)菌懸浮液，將其調(diào)到OD600=0.8，備用。

1.2.3 致病性測(cè)定

采用噴霧接種，以每片葉的正反面噴濕為準(zhǔn)，每個(gè)處理重復(fù)3次，接種后保濕24 h，第2天開(kāi)始觀察，并記錄發(fā)病情況。以無(wú)菌水處理為對(duì)照（CK）。對(duì)接種后發(fā)病的病斑進(jìn)行病原菌的再分離。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌的菌落形態(tài)學(xué)鑒定參照方中達(dá)[8]的方法。在透射電子顯微鏡（Hitachi HT7700）下觀察細(xì)菌的菌體及鞭毛形態(tài)特征并拍照。

1.2.5 生理生化測(cè)定

KB培養(yǎng)基上是否產(chǎn)生熒光、過(guò)氧化氫酶活性、氧化酶活性、精氨酸雙水解、硝酸鉀還原反應(yīng)、吲哚和果聚糖產(chǎn)生、淀粉水解、甲基紅和V-P 試驗(yàn)、溶解果膠活性、碳素化合物（丙二酸納、麥芽糖、纖維二糖、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、海藻糖、棉籽糖、山梨醇、酒石酸鈉、甜醇、丙三醇、香葉醇、甘露醇、葡萄糖、檸檬酸鈉）的利用情況等參照方中達(dá)[8]的方法。以菊苣假單胞菌5707菌株為對(duì)照菌株。

1.2.6 Biolog 測(cè)定

采用Gen Ⅲ Microstationbiolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.2.7 分子生物學(xué)鑒定

采用菊苣假單胞的特異性引物Hrp1a/Hrp2a（5’-CCGTTCATCGTCATCGACCT-3’/5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAGF-3’）進(jìn)行PCR，PCR體系及程序參照Cottyn等[9]方法。采用細(xì)菌的通用引物27F/1492R（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’/5’-GGTTACC TTGTTACGACTT-3’）擴(kuò)增16S rDNA基因，PCR體系及程序參照Lane[10]，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用引物rpoD-F/rpoD-R（5’-AAGGCGARATCGAAATCGCCAAGCG-3’/5’-GGAACWKGCGCAGGAAGTCGGCACG-3’）擴(kuò)增rpoD 基因、采用引物gyrB-F/gyrB-R（5’-MGGCGGYAAGTTCGATGACAAYTC-3’/5’ -TRATBKCAGTCARACCTTCRCGSGC-3’）擴(kuò)增gyrB 基因，PCR體系和程序參照Sara等[11]方法。采用最大似然法，運(yùn)用Phylosuite軟件進(jìn)行基因串聯(lián)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀及發(fā)病情況分析

田間調(diào)查結(jié)果（圖1）顯示，該病害在田間蔓延速度快，主要為害葉片。植株的下部葉片最先受害，然后逐漸向上擴(kuò)展，致使整株發(fā)病（圖1A）。葉片受害初期為水漬狀圓形或不規(guī)則小斑點(diǎn)（圖1B），后斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大，中心變成褐色，周?chē)悬S色暈圈（圖1C）；隨后病斑逐漸擴(kuò)展并合并成不規(guī)則形的褐色大斑，嚴(yán)重時(shí)葉片病斑連成一片，最后葉片枯死脫落（圖1D）。福州市郊區(qū)無(wú)花果細(xì)菌性葉斑病的田間株發(fā)病率達(dá)50%以上，個(gè)別果園株發(fā)病率高達(dá)100%。

2.2 細(xì)菌的分離、純化與致病性測(cè)定結(jié)果

采用平板劃線分離法從發(fā)病的無(wú)花果樣本上分離獲得10株細(xì)菌菌株，編號(hào)為W1～W10。將分離獲得的細(xì)菌菌株注射接種煙草葉片，24 h內(nèi)均可產(chǎn)生過(guò)敏性壞死斑。將分離的細(xì)菌菌株回接無(wú)花果（本地種）葉片，接種后3 d，葉片開(kāi)始出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，隨著病情的發(fā)展，病斑中央變?yōu)楹稚?，周?chē)悬S色暈圈（圖2A、B），與田間發(fā)病的癥狀相似；接種無(wú)菌水的葉片未發(fā)?。▓D2C、D）。隨后，對(duì)回接發(fā)病的病葉進(jìn)行再分離，均可獲得與接種時(shí)相同菌落形態(tài)特征的細(xì)菌菌株，說(shuō)明分離獲得的細(xì)菌菌株可使無(wú)花果致病，為無(wú)花果細(xì)菌性葉斑病的病原菌。

2.3 細(xì)菌鑒定分析

2.3.1 細(xì)菌的形態(tài)特征

供試細(xì)菌在NA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24～48 h后，菌落呈淡黃色、圓形、扁平（圖3A、B）；菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，大小為（0.45～1.45） μm×（2.05～4.45） μm，革蘭氏染色陰性（G?），極生1～7根鞭毛（圖3C）。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

分別用細(xì)菌16SrDNA 基因和管家基因gyrB 和rpoD 的測(cè)序結(jié)果在NCBI上比對(duì)。以Escherichia coli 為外群，采用鄰接法構(gòu)建16S rDNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果（圖4A）顯示，供試菌株與菊苣假單胞菌聚為一支；采用最大似然法對(duì)管家基因gyrB 和rpoD 進(jìn)行聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4B），鑒定結(jié)果與16 rDNA 基因一致，即供試菌株與菊苣假單胞菌聚為一支。進(jìn)一步用菊苣假單胞菌的特異性引物Hrp1a/Hrp2a 對(duì)分離獲得的細(xì)菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖5）表明，均能擴(kuò)增出大小約897 bp的特異性片段，與對(duì)照菊苣假單胞菌株5707和Pc-GD-1的擴(kuò)增結(jié)果一致，進(jìn)一步證明分離獲得的細(xì)菌菌株為菊苣假單胞。

2.3.3 生理生化測(cè)定

以菊苣假單胞菌菌株5707為對(duì)照菌株進(jìn)行生理生化測(cè)定，結(jié)果（表1）顯示，供試細(xì)菌菌株在KB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)可產(chǎn)生水溶性綠色熒光，過(guò)氧化氫、淀粉水解和氧化酶反應(yīng)為陽(yáng)性；精氨酸雙水解、硝酸鉀還原、吲哚和果聚糖產(chǎn)生、溶解果膠活性、果聚糖、甲基紅和V-P反應(yīng)為陰性；可利用葡萄糖、甘露醇、丙二酸鈉、丙三醇，不能利用檸檬酸鈉、麥芽糖、纖維二糖、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、海藻糖、棉籽糖、山梨醇、酒石酸鈉、甜醇、香葉醇，與對(duì)照菌株5707的結(jié)果一致。因此，將供試菌株鑒定為菊苣假單胞菌。

2.3.4 Biolog測(cè)定

由于分子生物學(xué)鑒定和生理生化結(jié)果表現(xiàn)一致，因此隨機(jī)挑選W1、W2、W3、W5、W10共5株菌株進(jìn)行Biolog GN 測(cè)試板測(cè)定，培育48 h 后，結(jié)果（表2）顯示，供試菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中P. cichorii 的相似度最高，相似性為0.721～0.801，進(jìn)一步證明分離獲得的細(xì)菌菌株為菊苣假單胞菌。

3 討論

無(wú)花果細(xì)菌性葉斑病是自2020年以來(lái)在福建省新發(fā)生的一種細(xì)菌性病害。本研究通過(guò)對(duì)該病害的病原菌進(jìn)行分離純化、致病性測(cè)定、生理生化和Biolog 測(cè)定、特異性引物檢測(cè)、16S rDNA 基因、管家基因gyrB 和rpoD 的序列分析，明確了引起福建無(wú)花果葉斑病的病原菌為菊苣假單胞菌。菊苣假單胞菌的寄主范圍廣，可引起多種植物如辣椒[12]、番茄[13?14]、煙草[15]、油麥菜和苦苣[16]、黃瓜[17]、絲瓜[18]、波斯菊[19]、非洲菊[20]、紫蘇[21]、半夏[22]和榕樹(shù)[23]等產(chǎn)生葉斑或者枯萎癥狀。本研究結(jié)果顯示，菊苣假單胞菌可侵染無(wú)花果并引起葉斑病，也進(jìn)一步證實(shí)該細(xì)菌的寄主范圍廣泛。

16S rDNA 是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA（16S rRNA）的基因，高度保守，該基因可用于所有細(xì)菌屬水平上的鑒定[24]，但很難鑒別出細(xì)菌的近緣種[25]。研究表明，用編碼蛋白的基因如gyrB、rpoD、acnB、pgi、pfk、cts、gapA、rpoC 等作為系統(tǒng)發(fā)育鑒定的靶標(biāo)可有效克服非蛋白編碼基因在鑒定中存在的缺陷[11，25]。其中g(shù)yrB 基因是以單拷貝的形式編碼促旋酶B亞單位的基因，普遍存在于細(xì)菌中[26]。Yamamoto等[27]應(yīng)用該基因?qū)賳伟壏N進(jìn)行鑒別，此后大量的研究證明，該基因能夠用于區(qū)分出革蘭氏陰性細(xì)菌如假單胞菌（Pseudomonas）[14]、伯克赫氏菌（Burkholderia） [28]、氣單胞菌（Aeromonas）[29]及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如芽胞桿菌（Bacillus）[30]等的近緣種。rpoD 基因是編碼RNA聚合酶δ-70因子的基因，它能把混雜在一起的種區(qū)分開(kāi)。研究證明，該基因與gyrB 基因聯(lián)合可更好地區(qū)分細(xì)菌的近緣種[31]。Yamamoto等[31]研究表明，用gyrB 和rpoD 管家基因聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)比其他管家基因能更有效地區(qū)分假單胞菌（Pseudomonas spp.）。Maeda 等[32]報(bào)道，用gyrB 和rpoD 基因可以有效地鑒別伯克赫氏菌（Burkholderia）的6 個(gè)近緣種（B. andropogonis， B.caryophylli，B. cepacian，B. plantarii，B. glumae 和B.gladioli）。綜上證明，聯(lián)合使用gyrB 和rpoD 基因能夠有效地區(qū)分假單胞菌、伯克赫氏菌等病原細(xì)菌的近緣種。本研究用管家基因gyrB 和rpoD 聯(lián)合構(gòu)建無(wú)花果細(xì)菌性葉斑病病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，供試細(xì)菌菌株與菊苣假單胞菌的遺傳距離最近，進(jìn)一步證明分離獲得的細(xì)菌菌株為菊苣假單胞菌。

本課題組對(duì)該病害在福州市無(wú)花果種植園發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病除在福州市郊區(qū)的無(wú)花果種植園發(fā)生外，在福州市連江地區(qū)部分無(wú)花果種植園的發(fā)生也較嚴(yán)重，個(gè)別果園的田間株發(fā)病率超過(guò)50%，嚴(yán)重的可達(dá)90%以上。通過(guò)與果農(nóng)交流得知，發(fā)病果園種植的無(wú)花果苗木與福州市郊區(qū)的病果園種植的苗木來(lái)源相同，這些苗木均由福州市郊區(qū)果農(nóng)自己選育。無(wú)花果可通過(guò)扦插、壓條、播種等方法繁殖育苗，生產(chǎn)上最常用的育苗方法是扦插法[33]。由于該病害是新發(fā)病害，果農(nóng)因缺乏對(duì)該病害的有效辨別，誤選用了帶菌的枝條進(jìn)行扦插，從而導(dǎo)致選育的部分苗木攜帶病菌，同時(shí)通過(guò)苗木調(diào)運(yùn)造成病害傳播流行，發(fā)生為害面積擴(kuò)大。由此推測(cè)，帶菌的苗木是該病害擴(kuò)大的主要侵染源之一。除此之外，該病害還有哪些侵染源，這需要對(duì)病菌的越冬場(chǎng)所、寄主范圍等進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)研究。

由菊苣假單胞菌引起的無(wú)花果細(xì)菌性葉斑病是福建無(wú)花果的一種新發(fā)病害，對(duì)該地區(qū)無(wú)花果的種植業(yè)造成嚴(yán)重威脅，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該細(xì)菌性病害的監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步系統(tǒng)開(kāi)展病菌的生物學(xué)特性、病害的初侵染來(lái)源、發(fā)生流行規(guī)律、防控技術(shù)等研究。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFD0201106-02）；福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（水果）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲(chóng)害防控崗位項(xiàng)目（KKE19005A）；福建省科技特派員工作經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（KTP21267A）。