摘要：CCCH（C3H）型鋅指蛋白是進(jìn)化上保守的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，主要與DNA和RNA結(jié)合來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，不僅參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和激素調(diào)控過(guò)程，同時(shí)也響應(yīng)生物和非生物脅迫。運(yùn)用生物信息學(xué)方法，在番茄（Solanum Lycopersicum）中鑒定出47個(gè)SlC3H 基因，不均勻地分布在12條染色體上，主要定位于細(xì)胞核中。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將其分為3個(gè)亞族（Ⅰ～Ⅲ）。共線性分析發(fā)現(xiàn)，SlC3H 基因家族存在基因復(fù)制現(xiàn)象，表明在進(jìn)化過(guò)程中SlC3H 基因可能通過(guò)復(fù)制進(jìn)行家族成員擴(kuò)增。番茄SlC3H 基因含有1～14個(gè)外顯子，其啟動(dòng)子區(qū)域存在與激素和非生物脅迫響應(yīng)的元件。Ka/Ks分析表明，SlC3H 基因家族成員和C3H 基因在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了強(qiáng)烈的進(jìn)化選擇。qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，SlC3H 基因家族有一半以上的基因表達(dá)上調(diào)，其中SlC3H1 在8 h時(shí)表達(dá)量最高，是0 h的30倍；用0.1 mol·L?1 2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-epibrassinolide，EBR）處理后所有SlC3H 基因在綠熟期都表達(dá)上調(diào)，表達(dá)量是對(duì)照組的8～150倍，尤其是SlC3H28 在其他時(shí)期表達(dá)量幾乎為0，但在綠熟期其表達(dá)量是對(duì)照組的150倍，推測(cè)EBR對(duì)果實(shí)綠熟期的發(fā)育有促進(jìn)作用。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示番茄C3H 基因家族在響應(yīng)非生物脅迫以及果實(shí)發(fā)育中的功能提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：CCCH；番茄；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0156

中圖分類號(hào)：S641.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008?0864（2025）01?0080?16

CCCH（C3H）型鋅指蛋白是進(jìn)化上保守的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，含有5個(gè)串聯(lián)的C3H鋅指結(jié)構(gòu)域。C3H鋅指轉(zhuǎn)錄因子（zinc finger，Znf）是一種新型的Znf 基因，其編碼的蛋白包含1～6個(gè)C3H 類型的鋅指基序，基序特征有3個(gè)基序半胱氨酸殘基和1個(gè)組氨酸殘基[1-4]。C3H型鋅指蛋白主要與DNA和RNA結(jié)合，從而調(diào)控基因表達(dá)，但更多表現(xiàn)出與RNA 結(jié)合的特性，在RNA 加工中起作用[5]。C3H鋅指基序已在人類和酵母的生物體蛋白中發(fā)現(xiàn)[6?7]。在植物中，C3H型鋅指蛋白不僅參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)控[8?9]，同時(shí)也參與生物和非生物脅迫的響應(yīng)[10]。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有11 個(gè)C3H家族成員，不僅參與植物對(duì)干旱、鹽、冷和脫落酸（abscisic acid，ABA）等脅迫的響應(yīng)，而且參與調(diào)控花發(fā)育[11]。此外，AtC3H14 和AtC3H15 被證實(shí)在擬南芥中調(diào)控次生細(xì)胞壁的生物合成，這也意味著它們的同源物可能也參與了擬南芥次生細(xì)胞壁的形成[12]。CCCH-ZFP 基因提高了西蘭花對(duì)鹽和滲透脅迫的耐受性[13]。水稻（Oryza sativa）中C3H 基因OsDOS 主要通過(guò)茉莉酸途徑的負(fù)調(diào)控進(jìn)行過(guò)度表達(dá)，使葉片延緩衰老[14]。棉花GhZFP1 轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鹽、干旱、水楊酸（salicylic acid，SA）脅迫和真菌疾病的耐受性顯著增強(qiáng)[15]。

番茄（Solanum lycopersicum）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，發(fā)掘其C3H 基因的潛在功能將為提高番茄產(chǎn)量、品質(zhì)及抵抗逆境脅迫提供重要的理論支持[16]。目前，已在擬南芥、水稻[17]、玉米（Zeamays）[18]、玫瑰（Rosa rugosa）[19]、煙草（Nicotianatabacum）[20]、茄子（Solanum melongena）[21]、蕓苔屬（Brassica）[22?23]、柑橘（Citrus reticulata Blanco）[24]和葡萄（Vitis vinifera）[25]中進(jìn)行了全基因組C3H 鑒定，但在番茄中鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法鑒定番茄C3H 基因家族，研究這些基因的結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和組織特異性表達(dá)，并從系統(tǒng)進(jìn)化、染色體分布、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)等方面分析番茄C3H類鋅指蛋白家族成員的特性；同時(shí)，分析家族成員基因啟動(dòng)子順式作用元件，并進(jìn)行熒光定量分析，為分析C3H參與番茄生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步探究C3H類鋅指蛋白在番茄應(yīng)對(duì)非生物脅迫中的功能機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以番茄栽培品種‘M82’為研究材料，種子由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所提供。將‘M82’種子清洗后放置培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄幼苗，移入1/2改良型霍蘭格營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，待番茄幼苗長(zhǎng)至4葉期用200 mol·L?1的NaCl溶液進(jìn)行脅迫處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，分別在處理0.0、0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0 h 時(shí)采集葉片。另采集膨大期（expansion period，EP）、綠熟期（green ripe period，GRP）、轉(zhuǎn)色期（veraiso period，VP）、紅熟期（red ripe period，RRP）4 個(gè)時(shí)期的番茄果實(shí)作為材料，分別采用0.00（E1）、0.05（E2）、0.10（E3）、0.20 mol·L?1（E4）的外源激素2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-epibrassinolide， EBR）處理番茄果實(shí)，連續(xù)噴施3 d后再自然生長(zhǎng)3 d，于第7天進(jìn)行果實(shí)取樣。為避免相互干擾，每3株設(shè)為1個(gè)分區(qū)，共有7個(gè)區(qū)組，各個(gè)區(qū)組之間距離設(shè)置為1.5 m。收集的材料放入液氮中速凍，并貯存在?80 ℃冰箱。

1.2 番茄SlC3H 基因家族鑒定

為鑒定番茄中潛在的C3H 家族基因，從番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//solomics.agis.org.cn/tomato/）下載番茄亨氏1705 基因組數(shù)據(jù)，并通過(guò)EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//plants.ensembl.org/）獲得擬南芥和煙草的基因組數(shù)據(jù)；然后從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下載C3H 結(jié)構(gòu)域隱馬爾可夫模型（ID：PF00642），并利用Hmmer工具對(duì)番茄C3H 全基因組蛋白質(zhì)進(jìn)行搜索和結(jié)構(gòu)域比較，E-value≤1×10?5[26]。最后，通過(guò)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中Conserved Domain Database程序和Pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）在線軟件中Search程序?qū)λ蝎@得的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)Expasy在線軟件（https：//web.expasy.org/tools/）預(yù)測(cè)番茄C3H蛋白的理化性質(zhì)[27]。采用Wolf Psort II（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析[28]。

1.3 番茄SlC3H 家族基因結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)MEGA 7.0軟件中的Muscle對(duì)番茄、擬南芥和煙草的C3H 蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并采用鄰接法進(jìn)行分析，采用最大似然法（maximumlikelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap 重復(fù)值為1 000，使用在線網(wǎng)站EVOLVIEW（https：//www. evolgenius. info/evolview-v2/）美化進(jìn)化樹(shù)[29]。采用DNAMAN 進(jìn)行結(jié)構(gòu)域序列多重比對(duì)，利用MEME（https：//meme-suite. org/tools/meme/）進(jìn)行保守基序分析[30]，通過(guò)TBtools 軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖[31]。

1.4 番茄SlC3H 基因的染色體定位、共線性和Ka/Ks 分析

根據(jù)SlC3H 基因的染色體位置信息，使用TBtools 軟件繪制位置分布圖。其中采用MCScanX 進(jìn)行番茄和擬南芥C3H 基因以及番茄和煙草C3H 基因的共線性分析[32]；Circos工具用于生成染色體共線性圖[33]；通過(guò)Ka/ks工具獲得番茄共線基因?qū)Φ腒a/Ks比值[34]。

1.5 番茄SlC3H 基因順式元件分析

利用TBtools軟件提取SlC3H 基因上游2 000 bp的序列，通過(guò)Plant Care 在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。最后用TBtools軟件中的HeatMap工具制作表達(dá)熱圖。

1.6 SlC3H 基因的qRT-PCR

使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（DP432，北京天根生化科技有限公司）提取處理后番茄的總RNA， 通過(guò)BiomarkerScirpt-1stStrandcDNA-SynthesisKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百邁客生物科技有限公司）合成cDNA，利用ChamQSYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。根據(jù)番茄C3H 基因家族成員保守基序設(shè)計(jì)熒光定量引物（ 表1）。qRT-PCR 反應(yīng)體系20 μL：SuperReal Color PreMix（北京天根生化科技有限公司）10 μL、上下游特異性引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)到20 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性120s；94 ℃變性5 s，（退火）15 s，72 ℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán)。以番茄Actin 為內(nèi)參基因。采用3個(gè)生物重復(fù)和2?△△CT法[35]計(jì)算，相對(duì)表達(dá)量為處理組和對(duì)照組的相對(duì)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄SlC3H 基因家族成員特征分析

通過(guò)全基因組鑒定分析，初步鑒定到47個(gè)潛在的SlC3H 基因，依據(jù)家族成員在基因組染色體的位置將其命名為SlC3H1～SlC3H47。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果（表2）表明，SlC3H 家族成員的氨基酸殘基數(shù)為93～1 064個(gè)，蛋白分子量為10 025.25～121 235.49 Da，其中SlC3H31 最小，SlC3H20 最大；等電點(diǎn)為4.92～9.52，SlC3H24 最低，SlC3H39 最高；SlC3H 基因家族蛋白均表現(xiàn)為親水性。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，SlC3H2 和SlC3H13 位于細(xì)胞質(zhì)，SlC3H7 位于葉綠體上，SlC3H31 處于細(xì)胞外基質(zhì)，其余均位于細(xì)胞核內(nèi)。

2.2 番茄SlC3H 基因家族染色體定位分析

染色體定位分析結(jié)果如圖1所示。47個(gè)番茄SlC3H 基因家族成員分布在12條染色體上，其中，多數(shù)SlC3H 基因主要分布于Chr3（5個(gè)）、Chr1（8個(gè)）、Chr6（8個(gè)）、Chr10（7個(gè)）、Chr11（5個(gè)），其余7條染色體上C3H基因家族成員數(shù)量為1～3個(gè)。番茄SlC3H基因家族成員在同一條染色體上的分布也不均勻，大多分布在各染色體的上端和下端，除了Chr6、Chr7、Chr10、Chr11和Chr12染色體上的C3H 基因家族成員分布較為集中外，其余染色體上的C3H基因家族成員分布較為分散。

2.3 番茄SlC3H 基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為明確C3H 基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對(duì)擬南芥（AtC3H，50個(gè)）、煙草（NtC3H，49個(gè)）和番茄（SlC3H，47個(gè)）的146個(gè)C3H保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖2所示。將這3個(gè)物種的146個(gè)C3H基因劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個(gè)組，同一組內(nèi)的C3H基因家族成員親緣關(guān)系較近。其中Ⅰ組有62個(gè)C3H，包含16個(gè)SlC3H、24個(gè)AtC3H 和22個(gè)NtC3H；Ⅱ組有19個(gè)C3H 基因，包含6個(gè)SlC3H、9個(gè)AtC3H和4個(gè)NtC3H；Ⅲ組有65個(gè)C3H 基因，包含25個(gè)SlC3H、17個(gè)AtC3H 和23個(gè)NtC3H。同時(shí)，Ⅰ組又可劃分為Ⅰ-a、Ⅰ-b 2個(gè)亞組，分別包含6和10個(gè)SlC3H家族成員；Ⅲ組又可劃分為Ⅲ-a、Ⅲ-b 2個(gè)亞組，分別有11和14個(gè)SlC3H。同一組內(nèi)的基因通常具有相似的功能特征，多數(shù)番茄SlC3H 基因處于Ⅰ組與Ⅲ組內(nèi)。

2.4 番茄SlC3H 基因家族成員基序和基因結(jié)構(gòu)分析

由圖3 可知，C3H 蛋白有不同的基序類型。所有SlC3H 蛋白都含有motif 1，SlC3H36、SlC3H45、SlC3H30、SlC3H28、SlC3H25、SlC3H44、SlC3H20、SlC3H16、SlC3H23、SlC3H15、SlC3H9、SlC3H31、SlC3H2、SlC3H40、SlC3H21 只含編碼區(qū)（coding sequence，CDS），其他基因既有CDS，又有非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，番茄SlC3H 基因的內(nèi)含子數(shù)為0～14個(gè)，其中有5個(gè)基因（SlC3H37、SlC3H26、SlC3H5、SlC3H25、SlC3H44）僅含1 個(gè)內(nèi)含子，有4 個(gè)基因（SlC3H36、SlC3H28、SlC3H45、SlC3H30）不含內(nèi)含子。內(nèi)含子是阻斷基因線性表達(dá)的序列，增加了基因的長(zhǎng)度，提高了基因間的重組頻率，有利于物種進(jìn)化并具有調(diào)控作用。有內(nèi)含子的5個(gè)SlC3H 基因可能具有某項(xiàng)功能，但對(duì)番茄進(jìn)化作用不明顯；其余4個(gè)不含有內(nèi)含子的SlC3H 基因推測(cè)其可能不具有調(diào)控作用，且不利于番茄物種進(jìn)化。結(jié)合進(jìn)化樹(shù)分析可知，處于同一組內(nèi)的基因家族成員親緣關(guān)系較近，例如，SlC3H36、SlC3H37、SlC3H5 和SlC3H26 在同一組內(nèi)，具有較近的親緣關(guān)系，并且由保守基序可知，這4 個(gè)SlC3H 基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)，即同組成員的motif 高度相似。由此可知，同一組內(nèi)成員的關(guān)系較近且基因結(jié)構(gòu)相似，可能具有相似的功能。

2.5 番茄SlC3H 基因家族成員共線性和進(jìn)化壓力分析

構(gòu)建番茄SlC3H 基因的共線性圖，結(jié)果（圖4）表明，有7對(duì)番茄SlC3H 基因具有同源關(guān)系，其成員之間存在共線性關(guān)系，分別是SlC3H1 與SlC3H41、SlC3H11與SlC3H18、SlC3H14與SlC3H24、SlC3H19 與SlC3H32、SlC3H30 與SlC3H45、SlC3H35與SlC3H38、SlC3H36 與SlC3H37，其余成員間不存在共線性關(guān)系。由上可知，SlC3H 基因家族存在基因復(fù)制現(xiàn)象，表明在進(jìn)化過(guò)程中C3H 基因可能通過(guò)復(fù)制進(jìn)行家族成員擴(kuò)增。

為進(jìn)一步探索C3H 基因家族成員間的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了番茄SlC3H 與擬南芥AtC3H 家族以及番茄SlC3H 與煙草NtC3H 家族的比較共線性圖，結(jié)果（圖5）表明，番茄、擬南芥和煙草中存在直系同源C3H 基因?qū)Γ渲蟹雅c擬南芥之間的同源基因?qū)?shù)量多于番茄與煙草的同源基因?qū)?。由此說(shuō)明，番茄與擬南芥的C3H 基因家族具有更近的同源進(jìn)化關(guān)系。

為探明物種間SlC3H 基因家族和C3H 基因的進(jìn)化，計(jì)算番茄中SlC3H 基因的復(fù)制和共線C3H基因之間的Ka/Ks值，結(jié)果（表3）顯示，6個(gè)SlC3H基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于1，表明SlC3H 在進(jìn)化時(shí)受到純化選擇。由此可知，SlC3H 基因家族成員和C3H 基因在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了強(qiáng)烈的選擇作用。

2.6 番茄SlC3H 基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分析

對(duì)番茄SlC3H 基因家族成員的順式作用元件進(jìn)行分析，按照其功能可分為光響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件、植物激素響應(yīng)元件和植物生長(zhǎng)發(fā)育元件（圖6）。光響應(yīng)元件（Box 4、G-box、GT1-Box 4的數(shù)量最多（300個(gè)），G-box次之（195個(gè)）；SlC3H44 基因中的Box 4元件數(shù)量最多，SlC3H43與SlC3H19 次之；SlC3H38 基因中的G-box 元件數(shù)量最多。Box 4 是參與光反應(yīng)的一部分DNA模塊，G-box 是參與光反應(yīng)的順式作用元件，由此推斷，這些基因主要調(diào)控特征與光有關(guān)。在脅迫響應(yīng)元件中，ARE 元件決定調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合與厭氧誘導(dǎo)的表達(dá)，其響應(yīng)元件數(shù)量最多，共142 個(gè)，且ARE 元件在所有47 個(gè)基因中均被檢測(cè)到，這說(shuō)明番茄SlC3H 基因可能與番茄對(duì)厭氧響應(yīng)密切相關(guān)。與干旱相關(guān)的MBS元件的數(shù)量排在第2位，共62個(gè)，其中有37個(gè)啟動(dòng)子檢測(cè)到MBS 元件。低溫（low temperature response，LTR）響應(yīng)元件共39 個(gè)，防御和應(yīng)激（TC-richrepeats）反應(yīng)元件共40 個(gè)。除此之外還發(fā)現(xiàn)了一些與植物生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的元件，其中分生組織表達(dá)相關(guān)的啟動(dòng)子元件最多，說(shuō)明其可能促使細(xì)胞進(jìn)行分裂分化，進(jìn)而對(duì)番茄生長(zhǎng)發(fā)育起調(diào)控作用；其他還包括玉米醇溶蛋白代謝（O2-site）、胚乳表達(dá)（GCN4-motif）和晝夜節(jié)律（circadian）相關(guān)的順式作用元件。

與激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件有3種，包括脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）以及水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）。茉莉酸甲酯能夠促使番茄植株產(chǎn)生防御反應(yīng)，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病能力，其響應(yīng)元件最多，共246個(gè)；脫落酸能夠有效控制番茄生長(zhǎng)、提高抗逆性，其響應(yīng)元件次之，共154 個(gè)；水楊酸既可以誘導(dǎo)番茄細(xì)胞分化，又可以參與番茄植株對(duì)病原體的抗性，其響應(yīng)元件最少，共54 個(gè)。這說(shuō)明多種激素可參與調(diào)控C3H 基因的表達(dá)，共同促進(jìn)番茄的生長(zhǎng)，提高番茄的抗逆性。

2.7 番茄SlC3H 基因響應(yīng)鹽脅迫和激素的表達(dá)模式分析

鹽脅迫是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)境因素，鑒定鹽脅迫相關(guān)基因以培育耐鹽品種是目前亟需解決的問(wèn)題。為了解番茄在鹽脅迫及果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育處理下SlC3H 基因的表達(dá)水平，利用qRT-PCR檢測(cè)番茄各器官中SlC3H 基因及其下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，挑選了36個(gè)SlC3H 基因進(jìn)行了qRT-PCR分析，結(jié)果（圖7）顯示，在鹽脅迫下，SlC3H14、SlC3H10、SlC3H8、SlC3H3、SlC3H46、SlC3H7、SlC3H41、SlC3H42、SlC3H43、SlC3H45、SlC3H23、SlC3H24、SlC3H30、SlC3H32、SlC3H35、SlC3H1、SlC3H33和SlC3H26 表達(dá)上調(diào)，尤其是SlC3H1 在8h 達(dá)到最大值，較0 h 的表達(dá)量上升了30 倍；SlC3H27、SlC3H40、SlC3H36 和SlC3H37 表達(dá)下調(diào)，推測(cè)這4個(gè)基因在鹽脅迫下起負(fù)調(diào)控作用；剩下的SlC3H2和SlC3H12在鹽脅迫下均勻表達(dá)。

為了進(jìn)一步研究激素脅迫下番茄SlC3H 基因在果實(shí)中表達(dá)，挑選12個(gè)SlC3H 基因進(jìn)行了qRTPCR分析，結(jié)果（圖8）顯示，在0.1 mol·L?1 EBR處理下，12個(gè)SlC3H 基因在綠熟期均表達(dá)上調(diào)，表達(dá)量是對(duì)照組的8～150倍，尤其是SlC3H28，該基因在其他時(shí)期的表達(dá)量幾乎為0，但在綠熟期其表達(dá)量是對(duì)照組的150倍。因此，推測(cè)EBR對(duì)果實(shí)綠熟期的發(fā)育有促進(jìn)作用，其他時(shí)期基因都均勻表達(dá)。

3 討論

C3H蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多方面發(fā)揮著重要作用。前人對(duì)C3H 基因家族成員進(jìn)行了大量研究，在擬南芥和水稻中分別鑒定出68和67個(gè)[17]，柑橘中62個(gè)[24]，楊樹(shù)中91個(gè)[37]，香蕉中89個(gè)[2]，煙草中86個(gè)[20]，然而在番茄中鮮有報(bào)道。對(duì)番茄C3H基因進(jìn)行全基因組分析，有助于更好地了解該基因家族。本研究從番茄基因組中鑒定出47個(gè)SlC3H 基因，分析基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，SlC3H基因的內(nèi)含子數(shù)量為0～14個(gè)，其中有5個(gè)基因僅含1個(gè)內(nèi)含子，有4個(gè)基因不含內(nèi)含子；序列分析表明，SlC3H 基序高度保守，處于同一亞家族的SlC3H 基因結(jié)構(gòu)域高度相似，表明這些SlC3H 基因可能具有相似的功能；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析將47個(gè)SlC3H 基因劃分為3個(gè)亞族，亞族內(nèi)的C3H基因有較高的同源性，同源基因發(fā)生復(fù)制時(shí)可能來(lái)自同一個(gè)祖先，推測(cè)其具有相似的功能。

基因復(fù)制是導(dǎo)致基因家族快速擴(kuò)張和進(jìn)化的主要因素[38]。本研究發(fā)現(xiàn)7對(duì)同源基因，其成員之間存在共線性關(guān)系，這與香蕉中的9對(duì)相似[2]。這一結(jié)果進(jìn)一步表明，C3H 基因具有高度的同源性，家族成員存在基因復(fù)制現(xiàn)象，表明在進(jìn)化過(guò)程中C3H 基因可能通過(guò)復(fù)制進(jìn)行家族成員擴(kuò)增。SlC3H 基因家族成員中有6對(duì)同源基因的Ka/Ks值小于1，表明這些基因主要受進(jìn)化選擇的影響。

順式元件在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[39]。本研究分析了SlC3H 基因上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，檢測(cè)到多種與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的元件，包括參與細(xì)胞周期調(diào)控的順式作用元件、激素響應(yīng)元件以及與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用調(diào)控元件；同時(shí)還檢測(cè)到與非生物脅迫相關(guān)的順式元件，如參與防御和脅迫響應(yīng)的順式作用元件、參與低溫響應(yīng)的順式作用元件，以及參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)。因此，順式作用元件分析為SlC3H 成員的功能研究，特別是相關(guān)基因的調(diào)控和植物在不同脅迫下的發(fā)育提供參考。

本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 首次對(duì)番茄SlC3H 基因家族的表達(dá)模式進(jìn)行了全面分析，結(jié)果表明，在NaCl脅迫時(shí)，SlC3H基因家族中有一半以上的基因上調(diào)表達(dá)，這與芝麻中的SiC3H1和香蕉中的CCCH-ZFP 表達(dá)相似[2，40]，而SlC3H27、SlC3H40、SlC3H36 和SlC3H37 下調(diào)表達(dá)，這與水稻中的OsC3H30、OsC3H50、OsC3H52 的表達(dá)模式一致[41]，說(shuō)明它們可能起負(fù)調(diào)控作用。擬南芥CCCH類鋅指蛋白還參與激素響應(yīng)[11，42]，本研究中SlC3H基因在激素處理后表達(dá)量發(fā)生變化，說(shuō)明SlC3H 基因參與番茄果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)在0.1 mol·L?1的EBR處理后，SlC3H基因在綠熟期表達(dá)量顯著升高，SlC3H28在激素處理后表達(dá)量提升了150倍，這與煙草NtC3H39基因的表達(dá)模式相似，進(jìn)一步說(shuō)明番茄SlC3H 基因家族的功能與擬南芥CCCH類鋅指蛋白相似[43]。

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